Name: Diuraphis noxia İstilasına Karşı Buğday Hücre Duvarı Savunma Mekanizmasının 946;-1,3-Glukanaz ve Peroksidaz Fizikokimyasal Özelliklerinin Açıklanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Keşfedin buğday bitkilerinde Diuraphis noxia istilasına karşı β-1,3-glukanaz ve peroksidaz enzimlerinin hücre duvarı savunma mekanizmalarındaki rolünü. Bu yöntem dirençli buğday çeşitleri geliştirmeye katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M. Mafa NMK-Thuthuka'dan fon aldı (Referans Numarası: TTK2204102938). SN Zondo, yüksek lisans derecesi için Ulusal Araştırma Vakfı Yüksek Lisans Bursunu aldı. Yazarlar, bu çalışmada kullanılan tohumları sağladığı için Tarımsal Araştırma Konseyi - Küçük Tahıl (ARC-SG) Enstitüsü'ne minnettardır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve tavsiye yazar(lar)a aittir ve bu nedenle fon sağlayıcılar bunlarla ilgili herhangi bir sorumluluk kabul etmez.

DIT ile İstifa Edilmiş Buğday Çeşitlerinde Hücre Duvarı ile İlgili Enzimlerin Karakterizasyonu

<ol><li>Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+is+involved+in+resistance+responses+in+the+Russian+wheat+aphid-wheat+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction.</a> J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).</li>
<li>Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins+from+Russian+wheat+aphid-infested+wheat+induce+defense+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C+J+Biosci%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses.</a> Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).</li>
<li>Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactive+oxygen+species+are+involved+in+resistance+responses+of+wheat+to+the+Russian+wheat+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid.</a> J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).</li>
<li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+defense-related+genes+in+wheat+and+maize+against+Bipolaris+sorokiniana%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).</li>
<li>Botha, C. E., Matsiliza, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+transport+in+wheat+%28Triticum+aestivum%29+is+caused+by+sustained+phloem+feeding+by+the+Russian+wheat+aphid+%28Diuraphis+noxia%29%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia).</a> S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).</li>
<li>Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+structural+carbohydrates+reinforcements+are+part+of+the+defense+mechanisms+of+wheat+against+Russian+wheat+aphid+%28Diuraphis+noxia%29+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation.</a> Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).</li>
<li>Walker, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sieve+element+occlusion%3A+Interaction+with+phloem+sap-feeding+insects+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review.</a> J Plant Physiol. 269, 153582(2022).</li>
<li>Botha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+developing+Russian+wheat+aphid+biotypes+remains+an+unsolved+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma.</a> Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).</li>
<li>Saheed, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stronger+induction+of+callose+deposition+in+barley+by+Russian+wheat+aphid+than+bird+cherry-oat+aphid+is+not+associated+with+differences+in+callose+synthase+or+%CE%B2-1%2C3-glucanase+transcript+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance.</a> Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).</li>
<li>Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+cell+wall-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+and+peroxidase+induced+during+wheat-Diuraphis+noxia+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Square%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions.</a> Research Square. , (2024).</li>
<li>Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+damage+in+the+vascular+tissues+of+resistant+and+non-resistant+barley+%28Hordeum+Vulgare+L.%29+by+two+South+African+biotypes+of+the+Russian+wheat+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22NISEB+J%22%5BJournal%5D)">Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid.</a> NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).</li>
<li>Mohase, L., Taiwe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+fractions+from+South+African+Russian+wheat+aphid+biotypes+induce+differential+defense+responses+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afri+J+Plant+Soil%22%5BJournal%5D)">Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat.</a> S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).</li>
<li>Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-1%2C3-glucanases+in+wheat+and+resistance+to+the+Russian+wheat+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid.</a> Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Miller, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dinitrosalicylic+acid+reagent+for+determination+of+reducing+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.</a> Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).</li>
<li>Zieslin, N., Ben-Zaken, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidases%2C+phenylalanine+ammonia-lyase+and+lignification+in+peduncles+of+rose+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers.</a> Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).</li>
<li>Damager, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+principles+insight+into+the+%CE%B1-glucan+structures+of+starch%3A+Their+synthesis%2C+conformation%2C+and+hydration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Rev%22%5BJournal%5D)">First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration.</a> Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).</li>
<li>Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insight+into+the+mechanism+and+biosynthesis%3A+proteases+may+regulate+callose+biosynthesis+upon+wounding%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose%22%5BJournal%5D)">New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding.</a> Cellulose. 10, 269-289 (2003).</li>
<li>Cierlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+callose+and+%CE%B2-1%2C3-glucanases+during+aphid+infestation+on+barley+cv.+Clipper%5BTitle%5D)+AND+%22Master+thesis+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper.</a> Master thesis in Molecular Cell Biology. , Sodertorn University College. Stockholm. (2008).</li>
<li>Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization%2C+and+biological+properties+of+%CE%B2-glucans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Adv+Pharm+Technol+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans.</a> J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94(2011).</li>
<li>Mafa, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+complex+oligosaccharides+and+CAZymes+activity+under+acid+conditions+constitute+the+Thatcher+%2B+Lr9+defense+responses+to+Puccinia+triticina%5BTitle%5D)+AND+%22Biologia%22%5BJournal%5D)">Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina.</a> Biologia. 78, 1929-1941 (2023).</li>
<li>Megazyme. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GOPOD+reagent+enzymes%3A+Assay+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Megazyme%22%5BJournal%5D)">GOPOD reagent enzymes: Assay procedure.</a> Megazyme. , 1-4 (2019).</li>
<li>Hlahla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photosynthetic+efficiency+and+carbohydrates+responses+of+six+edamame+%28Glycine+max.+L.+Merrill%29+cultivars+under+draught+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress.</a> Plants. 11 (3), 394(2022).</li>
<li>Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereal+host+interactions+with+Russian+wheat+aphid%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Interact%22%5BJournal%5D)">Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review.</a> J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).</li>
<li>Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphid+infestation+induces+PR-proteins+differently+in+barley+susceptible+or+resistant+to+the+birdcherry-oat+aphid+%28Rhopalosiphum+padi%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi).</a> Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).</li>
<li>Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+secondary+cell+wall+in+plant+resistance+to+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens.</a> Front Plant Sci. 5, 358(2014).</li>
<li>Rajninec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+%CE%B2-1%2C3-glucanse+from+Drosera+binate+exhibits+antifungal+potential+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants.</a> Plants. 10 (8), 1747(2021).</li>
<li>Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+immunocytochemical+localization+of+wheat+%CE%B2-1%2C3-glucanase+induced+by+Russian+wheat+aphid+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afri+J+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation.</a> S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Buğday ve arpa, Rus buğday yaprak bitleri (Diuraphis noxia) dahil olmak üzere yaprak biti türleri tarafından sıklıkla istila edilen tahıl ürünleridir7,24. Dirençli buğday bitkileri, kalloz ve lignin birikimini düzenleyerek hücre duvarını değiştirmek için istila dönemi boyunca savunma tepkileri olarak POD ve β-1,3-glukanaz aktivitelerinin yukarı regülasyonunu indükler 6,25,26,27. Çoğu çalışmanın POD ve β-1,3-glukanaz enzimlerini apoplast 3,12,28'den çıkardığını ve hücre duvarı işlevlerini oldukça spekülatif hale getirdiğini belirtmek önemlidir. Bu çalışma, hücre duvarına bağlı β-1,3-glukanaz, MLG'ye özgü β-glukanaz ve POD'u toplam proteinin bir parçası olarak ekstrakte eden bir yöntem geliştirdi. Bu enzimler, dirençli buğday çeşitlerinde kontrole göre oldukça aktif iken, duyarlı çeşitlerde aktiviteleri gecikmiştir. Deneylerdeki kontrollerin kullanılması, istilanın duvara bağlı enzimlerin aktivite seviyeleri üzerindeki etkilerini anlamaya yardımcı oldu. İstöle edilmiş veya kontrol örnekleri için üçüncü ve ikinci yaprak dokularından numune alınması, tutarlılık sağladığı için önemlidir. Ayrıca, POD, β-1,3-glukanaz ve MLG'ye özgü β-glukanaz aktivitesi buğday fidelerinin büyümesini artırdığından, istila edilmiş ve kontrolü aynı periyotta örnekleyin.
Bu çalışmada kullanılan kıvrık substrat, buğday-RWA etkileşimi sırasında hücre duvarı bölgesinde biriken bir polimer olan kallosunkine benzer bir kimyasal yapıya sahiptir 7,24. Arpa MLG substratı, çoğu monokotta ksilona kıyasla düşük oranda bulunan hücre duvarı hemiselülozunun bir kısmını temsil eder. Substratlar, bitki hücre duvarı bölgesi29'un asidik durumunu taklit etmek için sodyum sitrat pH 5 tamponu içinde çözüldü. β-1,3-glukanaz ve MLG'ye özgü β-glukanaz IWF ile uzaklaştırılırsa, kalan yaprak dokusundan ekstrakte edilen toplam protein, MLG ve curdlan substratları üzerinde aktiviteye sahip olmayacaktır. Ayrıca, protein ekstraktları sitoplazmik bölgeden elde edilmişse, nötr pH aralığında aktivite gösterirler. İlginç bir şekilde, her iki enzim de toplam protein ekstraktında mevcuttu çünkü MLG ve curdlan substratlarını başarılı bir şekilde hidrolize ettiler. MLG ve curdlan'ın ilgili enzimler tarafından hidrolizi, Mafa ve ark.6 tarafından modifiye edilmiş bir yöntem izlenerek DNS reaktifi tarafından tespit edilen indirgeyici şekerleri üretti. Numuneler daha yüksek toplam indirgeyici şeker konsantrasyonuna sahip olduğunda, azalan şeker konsantrasyonu düşük olduğunda DNS reaktif rengi sarıdan koyu kahverengiye değişir veya renk sarıdan açık kahverengiye (koyu turuncu görünür) değişir.
POD aktivitesini ölçmek için Guaiacol substratı kullanıldı. POD'un yüksek katalitik verimliliği nedeniyle, spektrofotometrenin kinetik modunu kullanarak aktivitesini ölçtük. POD, substratın (Guaiacol) varlığında düşükH2O2konsantrasyonu ile aktive edilir. Bu enzimin aktivitesi, guaiacol'ü kahverengi-turuncu renkli bir bileşik olan tetra-guaiacol oluşturmaya dönüştürür. Tetra-guaiacol üretimi, POD'un oligomerler üretmek için fenolik bileşikleri çapraz bağladığını veya fenolik bileşikleri lignine dahil ettiğini doğrular. POD, RWASA2 ile enfekte olmuş dirençli Tugela-Dn5'te daha yüksek aktivite seviyeleri gösterdi, bunu kontrollere kıyasla orta derecede dirençli Tugela-Dn1 izledi. Bununla birlikte, istila edilmiş duyarlı Tugela'da POD aktivite seviyeleri zamanla önemli ölçüde azalmıştır. Bu çalışmanın bulguları, RWASA2 istilasına uğramış dirençli buğday çeşitlerinin, lignin veya lignin-hemiselüloz bağlantılarını6 çapraz bağlayarak hücre duvarlarını güçlendirmek için POD kullandığı iddiasıyla desteklenmiştir. POD, H2O2'nin çalışmasını gerektirdi, bu da hücre duvarı bölgesindeki H2O2 seviyelerini düzenleyerek hücre duvarı yapısal karbonhidratlarının oksidasyonunu veya ağartılmasını azalttığını gösterir.
Bu hücre duvarına bağlı enzimler için biyokimyasal optimum koşulları belirlemek için farklı pH ve sıcaklık koşulları kullanıldı. Optimum koşullar, enzimlerin asidik pH aralıklarında (pH 5) optimum aktivitelere sahip olduğunu gösterdi, bu da hücre duvarı bölgesi ile ilişkili olduklarını gösteriyor. β-1,3-glukanaz için optimum sıcaklık, β-1,3-1,4-glukan ve β-1,3-glukan substratları hidrolize edilirken sırasıyla 25 °C ve 40 °C'de elde edildi. Bu gözlem, β-1,3-glukanazların ve MLG'ye özgü β-glukanazın, RWASA2 istilası sırasında dirençli buğday çeşitlerinin hücre duvarı bölgesinde indüklenen iki farklı enzim olduğunu doğruladı. Biyokimyasal karakterizasyon, benzer substratlara sahip farklı enzimleri keşfetmek veya tanımlamak için umut verici bir yöntem olsa da, yine de western blotting ve zymogram tahlilleri dahil olmak üzere diğer zahmetli ama doğru yöntemlerin kullanılmasını öneriyoruz. Son olarak, MLG-oligosakkaritlerin eksikliğinden dolayı MLG'ye özgü β-glukanaz için enzim aktivitesi modunu ölçemedik. Bununla birlikte, RWASA2 ile enfekte edilmiş Tugela-Dn5 ve Tugela-Dn1'den ekstrakte edilen β-1,3-glukanazlar, LAM5, LAM4 ve LAM3'te daha yüksek aktivite gösterirken, duyarlı Tugela'dan elde edilen glukanazlar LAM5 ve LAM4'te daha yüksek aktivite gösterdi. Bu, enzim aktivitesi modunun incelenmesinin, RWA ile enfekte edilmiş dirençli ve duyarlı çeşitlerde indüklenen β-1,3-glukanazlar arasındaki ince farklılıkları da yakalayabileceğini doğrular.
Mevcut çalışma, buğday yaprağı dokusundan hücre duvarına bağlı enzimlerin çıkarılması için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Ekstraksiyondan sonra, β-1,3-glukanaz, MLG'ye özgü β-glukanaz ve POD olmak üzere üç hücre duvarına bağlı enzim tanımladık. Bu enzimlerin aktivite seviyeleri, RWASA2 ile enfekte olmuş orta derecede dirençli Tugela-Dn1 ve dirençli Tugela-Dn5 çeşitlerinde kontrollere göre anlamlı derecede daha yüksekti. Bunlar, hücre duvarına bağlı enzimlerin dirençli çeşitlerde savunma tepkisine katkıda bulunduğunu doğruladı. Karakterizasyon bulguları, hücre duvarı POD ve β-1,3-glukanazın aynı koşullar altında işlev gördüğüne dair bir fikir verir, bu da buğday-RWASA2 etkileşimi sırasında hücre duvarını sinerjik olarak güçlendirdiklerini düşündürür.
Tartışılan mevcut protokollere müdahale eden bazı sınırlamalar tespit edilmiştir. Buğday bitkilerinin kıtlığı, enzim örneklerini çıkarmak için mevcut yaprak materyalini sınırlayabilir. Apoplasttan gelen IWF, hücre duvarı enzimleri ekstrakte edilmeden önce yaprak örneklerinden başarılı bir şekilde ekstrakte edilmezse, hem apoplast hem de hücre duvarı enzimlerinin kombinasyonuna yol açabilir. IWF ve hücre duvarı bölgesi enzimlerinin kombinasyonu, hücre duvarına bağlı olan hücre duvarına bağlı enzimlerin incelenmesini zorlaştırır. Mevcut protokolde başka bir sınırlama tanımlanmamıştır.

Rus buğday yaprak bitleri (RWA) buğday ve arpayı istila ederek önemli verim kaybına veya tahıl kalitesinin düşmesine neden olur. Buğday, dirençli çeşitlerde β-1,3-glukanaz ve peroksidaz aktivite seviyelerinin arttırılması da dahil olmak üzere çeşitli savunma tepkilerini indükleyerek istilaya yanıt verirken, duyarlı çeşitler erken istila döneminde bu enzimlerin aktivitesini azaltır 1,2,3,4. Buğday bitkisindeki β-1,3-glukanaz ve POD'un temel işlevleri, RWA istilası 1,3,5,6,7 sırasında dirençli kültivarda kalloz birikiminin düzenlenmesi ve hücre duvarında ve apoplastik bölgelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) söndürülmesini içeriyordu. Mafa ve ark.6, RWASA2 istilası üzerine dirençli buğday çeşidinde artan POD aktivitesi ile artan lignin içeriği arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Ek olarak, artan lignin içeriği, istila edilmiş dirençli buğday çeşidinin hücre duvarının güçlendirildiğini ve bunun da RWA beslemesinin azalmasına yol açtığını gösterdi.
Çoğu araştırmacı grubu, buğday / arpa-RWA etkileşimi sırasında apoplastik β-1,3-glukanaz ve POD'u çıkardı ve inceledi; Ek olarak, bu çalışmaların çoğu, bu enzimlerin, hücre duvarı bölgesindeki enzim varlığını ölçmeden RWA ile enfekte olmuş buğday bitkisinin hücre duvarını etkilediğini iddia etti. Sadece birkaç çalışma, β-1,3-glukanaz aktivite seviyelerinin kalloz regülasyonu 7,8,9 ile bağlantılı olduğunu veya dirençli 6,10'da POD aktiviteleri ile hücre duvarı modifikasyonu arasındaki korelasyonu göstermek için ekstrakte edilen ana hücre duvarı bileşenlerine bağlı olduğunu göstermek için mikroskobik teknikler kullanmıştır. Hücre duvarına β-1,3-glukanaz ve POD ilişkisinin araştırılmaması, araştırmacıların hücre duvarına bağlı enzimleri doğrudan ölçmelerine izin veren yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir.
Mevcut yöntem, hücre duvarına bağlı enzimlerin ekstrakte edilmesinden önce apoplastik sıvının yaprak dokusundan çıkarılmasının gerekli olduğunu önermektedir. Apoplastik sıvının ekstraksiyon prosedürü, hücre duvarına bağlı enzimlerin ekstrakte edilmesi için kullanılan yaprak dokusundan iki kez yapılmalıdır. Bu işlem, apoplastik enzimlerin hücre duvarı bölgelerinde bulunanlarla kirlenmesini ve karışıklığını azaltır. Bu nedenle, bu çalışmada hücre duvarına bağlı POD, β-1,3-glukanaz ve MLG'ye özgü β-glukanaz ekstrakte edildi ve biyokimyasal karakterizasyonları gerçekleştirildi.

<table><tbody><tr><td>10 kDa Santrifüj konsantre membran cihazı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1NB84206</td><td>Sadece araştırma amaçlıdır. Teşhis prosedürlerinde kullanım için değildir. Biyolojik çözeltilerin konsantrasyonu ve saflaştırılması için.</td></tr><tr><td>2 g Laminaribiose</td><td>Megazyme (Wicklow, İrlanda)</td> <td>O-LAM2</td><td>Araştırma, biyokimyasal enzim tahlilleri ve in vitro diagnostik analizlerde kullanım için yüksek saflıkta laminaribioz.</td></tr><tr><td>3 g Laminaritriose</td><td>Megazyme (Wicklow, İrlanda)</td> <td>O-LAM3</td><td>Araştırma, biyokimyasal enzim tahlilleri ve in vitro diagnostik analizlerde kullanım için yüksek saflıkta laminaritrioz.</td></tr><tr><td>3,5 Dinitro salisilik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0550</td><td>İndirgeyici şekerlerin kolorimetrik tayininde kullanılır</td></tr><tr><td>4 g Laminaritetraoz;</td><td>Megazyme (Wicklow, İrlanda)</td> <td>O-LAM4</td><td>Araştırma, biyokimyasal enzim tahlilleri ve in vitro diagnostik analizlerde kullanım için yüksek saflıkta laminaritetraoz.</td></tr><tr><td>5 g Laminaripentaose</td><td>Megazyme (Wicklow, İrlanda)</td> <td>O-LAM5</td><td>Araştırma, biyokimyasal enzim tahlilleri ve in vitro diagnostik analizlerde kullanım için yüksek saflıkta laminaripentaoz.</td></tr><tr><td>%95 Mutlak etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107017</td><td>Analiz için mutlak</td></tr><tr><td>etanol asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B00063</td><td>Acetc asit buzul %100 analiz için (asetik asit içerir)</td></tr><tr><td>Azo-CM-Selüloz</td><td>Megazyme (Wicklow, İrlanda)</td><td>S-ACMC</td><td>Polisakkarit, 20 şeker kalıntısı başına yaklaşık bir boya molekülü olacak şekilde Remazolbrilliant Blue R ile boyanır.</td></tr><tr><td>Beta glukan (arpa)&nbsp;</td><td>Megazyme (Wicklow, İrlanda)</td><td>G6513</td><td>Suda daha az çözünür olan toz halinde bir substrat. &beta;-1,3-glukanaz aktivitesinin belirlenmesinde kullanılır.</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Test Boyası</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları, Güney Afrika</td><td>500-0006</td><td>Kolorimetrik tahlil boyası, konsantre, Bio-Rad Protein Test Kitleri I ve II ile kullanım için&nbsp;</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Gibco Europe</td><td>810-1018</td><td>Yalnızca laboratuvar kullanımı için</td></tr><tr><td>Sitrat asidi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759</td><td>Yalnızca Yaşam Bilimleri araştırmaları için. Teşhis prosedürlerinde kullanım için değildir.</td></tr><tr><td>CM-curdlan&nbsp;</td><td>Megazyme (Wicklow, İrlanda)</td><td>P-CMCUR</td><td>&beta;-1,3-glukanaz aktivitesini belirlemek için toz haline getirilmiş substrat. Suda çözünmez.</td></tr><tr><td>D-Glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Yalnızca Yaşam Bilimleri araştırmaları için. Teşhis prosedürlerinde kullanım için değildir.</td></tr><tr><td>Guaiacol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td>Oksidasyon göstergesi. Peroksidaz aktivitesini belirlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>BDH Laboratuvar Malzemeleri, İngiltere</td><td>10366</td><td>Güçlü oksitleyici ajan.</td></tr><tr><td>Mikskaar Professional Substarte</td><td>Mikskaar (Estonya)</td><td>NI</td><td>Turba yosunu bazlı fide substratı.</td></tr><tr><td>Çok beslemeli gübre (5.2.4 (43))</td><td>Multifeed Classic</td><td>B1908248</td><td>Optimum kök gelişimini sağlamak için yüksek fosfor (P) gereksinimi olan genç gelişmekte olan bitkiler ve fideler için suda çözünür bir gübredir.</td></tr><tr><td>Naphthol</td><td>Merck, Almanya</td><td>N2780</td><td>Bir katalizör varlığında hidrojenasyonlara uğrar.</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33517</td><td>Işığa duyarlı. Ar-Ge için Yalnızca D kullanın. İlaç, ev veya diğer kullanımlar için değil. SDS mevcut</td></tr><tr><td>Potasyum sodyum tartrat tetrahidrat (Rochelle tuzu)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2377</td>, <td>indirgeyici şekerin belirlenmesinde kullanılan 3,5-dinitrosalisilik asit çözeltisinin hazırlanmasında kullanılır.</td></tr><tr><td>Silika plaka (TLC Silika jel 60 F254)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60778-25EA</td><td>Silika jel matrisi, floresan göstergeli 254 nm</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Ar-Ge için Yalnızca D kullanın. İlaç, ev veya diğer kullanımlar için değil.</td></tr><tr><td>Sodyum metabisülfit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31448</td><td>3,5-dinitrosalisilik asit çözeltilerinin hazırlanması sırasında bir antioksidan olarak eklenir.</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik heptahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>Biyolojik araştırmalarda pH'ı sabit tutmak için tampon çözelti olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik heptahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td>Suda çözünen inorganik bir bileşik. Silikat bazlı harçların geliştirilmesinde reaktif olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>İstatistiksel analiz yazılımı</td><td>TIBCO Statistica</td><td>sürüm 13.1</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>30743</td><td>Hg, ACS reaktifi analizi için sülfürik asit %95-97.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10812846001</td><td>İnkübasyon karışımlarında tamponlama maddesi. Ayrıca lizis ve TE (Tris-EDTA) tamponunun bir bileşeni olarak da kullanılmıştır. Yalnızca yaşam bilimleri araştırmaları için. Teşhis prosedürlerinde kullanım için değildir.</td></tr><tr><td>UV&ndash; Görünür Spektrofotometre</td><td>GENESYS 120&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; NI = tanımlanmadı.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diuraphis noxia İstilasına karşı buğday hücre duvarı savunma mekanizmasının #946;-1,3-glukanaz ve peroksidaz fizikokimyasal Özelliklerinin açıklanması

Elucidating &#946;-1,3-Glucanase and Peroxidase Physicochemical Properties of Wheat Cell Wall Defense Mechanism Against Diuraphis noxia Infestation

Rus buğday yaprak bitleri (RWA) tarafından istila edilen buğday bitkileri, aşırı duyarlı tepkiler (HR) ve β-1,3-glukanaz ve peroksidaz (POD) gibi patogenezle ilgili (PR) proteinlerin indüksiyonu dahil olmak üzere bir dizi savunma tepkisine neden olur. Bu çalışma, hücre duvarı ile ilişkili POD ve β-1,3-glukanazın fizikokimyasal özelliklerini karakterize etmeyi ve RWASA2-buğday etkileşimi sırasında hücre duvarı modifikasyonu üzerindeki sinerjilerini belirlemeyi amaçlamaktadır. Duyarlı Tugela, orta derecede dayanıklı Tugela-Dn1 ve dayanıklı Tugela-Dn5 çeşitleri sera koşullarında önceden çimlendirilerek ekildi, ekimden 14 gün sonra gübrelendi ve her 3 günde bir sulandı. Bitkiler, 3 yapraklı aşamada aynı RWASA2 klonunun 20 partenogenetik bireyi ile istila edildi ve yapraklar istiladan 1 ila 14 gün sonra hasat edildi. Hücreler arası yıkama sıvısı (IWF), vakum filtrasyonu kullanılarak ekstrakte edildi ve -20 °C'de saklandı. Yaprak kalıntıları toz haline getirildi ve hücre duvarı bileşenleri için kullanıldı. POD aktivitesi ve karakterizasyonu, 5 mM guaiacol substratı ve H2O2 kullanılarak belirlendi ve 470 nm'de absorbanstaki değişiklik izlendi. β-1,3-glukanaz aktivitesi, pH ve sıcaklık optimum koşulları, β-1,3-glukan ve β-1,3-1,4-glukan substratları kullanılarak DNS reaktifi ile hidrolizattaki toplam indirgeyici şekerlerin ölçülmesi, 540 nm'de absorbansın ölçülmesi ve glikoz standart eğrisi kullanılarak gösterilmiştir. Optimum pH, pH 4 ila 9 arasında, sıcaklık optimumu 25 ila 50 °C arasında ve termal stabilite 30 °C ile 70 °C arasında belirlendi. β-1,3-glukanaz substrat özgüllüğü, curdlan ve arpa β-1,3-1,4-glukan substratları kullanılarak 25 °C ve 40 °C'de belirlendi. Ek olarak, β-1,3-glukanaz etki modu, laminaribiyoz ila laminaripentaoz kullanılarak belirlendi. Oligosakkarit hidroliz ürün paternleri, ince tabaka kromatografisi (TLC) ile kalitatif olarak analiz edildi ve HPLC ile kantitatif olarak analiz edildi. Bu çalışmada sunulan yöntem, buğdayın RWA ile istila edilmesi, hücre duvarı bölgesinden peroksidaz ve β-1,3-glukanazın ekstrakte edilmesi ve bunların kapsamlı biyokimyasal karakterizasyonu için sağlam bir yaklaşım göstermektedir.

Buğday çeşitlerinin dört biyolojik kopyası (Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5), 3 yapraklı büyüme aşamasında RWASA2 ile istila edildi. İstiladan sonra yapraklar 1, 2, 3, 7 ve 14 dpi'de hasat edildi. Deney sonuçlarını strese maruz kalmayan buğday bitkileriyle karşılaştırılabilir hale getirmek için kontrol tedavileri RWASA2 ile enfekte edilmedi. Deneyler dörtlü olarak yapıldı ve sonuçlar ortalama değerler olarak sunuldu.
Hem RWASA2 ile enfekte edilmiş hem de kontrol ekstraktlarının protein konsantrasyonları, bir protein standardı olarak BSA kullanılarak ölçüldü. Bu, β-1,3-glukanaz ve POD için enzim aktivitesini belirlerken ve her reaksiyonda kullanılan protein konsantrasyonlarının her numune için bilinmesini sağlarken yararlıdır; Farklılıklar yok denecek kadar azdı. Veriler bir grafik veya tablo biçiminde sunulabilir. İlk grafik formatı, hem enzim aktivitesi hem de karakterizasyon tahlil sonuçları için istiladan sonraki günlere (x ekseni) karşı çizilen enzime özgü aktiviteleri (y ekseni) ifade etmek için kullanıldı. RWASA2 ile enfekte edilmiş dirençli Tugela-Dn5 örneklerinde β-1,3-glukanaz, MLG'ye özgü β-glukanaz ve POD'un artan spesifik aktivitesi, enzimlerin savunma yanıtında rol oynadığını göstermiştir (Şekil 1 ve Şekil 2). Ek olarak, her iki enzim de RWASA2 ile enfekte olmuş duyarlı Tugela'da zamanla aktivitesini önemli ölçüde kaybetti.
Hücre duvarı ile ilişkili β-1,3-glukanaz ve POD'un biyokimyasal karakterizasyonu, aktivitenin sırasıyla çizgi ve çubuk grafiklerle temsil edilen yüzde göreceli aktivite veya spesifik enzim aktivitesi cinsinden ifade edilmesiyle belirlendi (Şekil 3). Sonuç, hem β-1,3-glukanaz hem de POD'un asidik hücre duvarı koşullarına karşılık gelen pH benzeri optimum koşullara (pH 5) sahip olduğunu gösterdi (Şekil 3<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig05large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/Table%201.xlsx" target="_blank"></a>

Mevcut protokol, buğday bitkilerinde başta β-1,3-glukanaz ve peroksidaz olmak üzere hücre duvarı ile ilgili enzimleri incelemek ve karakterize etmek için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. Buğday-RWA etkileşimi sırasında aktivite seviyeleri artar ve yaprak biti beslenmesini caydıran hücre duvarı takviyesi yoluyla bitki savunma tepkisinde yer alır.

Diuraphis noxia İstilasına Karşı Buğday Hücre Duvarı Savunma Mekanizmasının #946;-1,3-Glukanaz ve Peroksidaz Fizikokimyasal Özelliklerinin Açıklanması

Wheat plants infested by Russian wheat aphids (RWA) induce a cascade of defense responses, including the hypersensitive responses (HR) and induction of ...

elucidating-13-glucanase-peroxidase-physicochemical-properties-wheat

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bir ekstrasellüler matriks polisakkaritlerin yapısına anlayışlar kazanmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Yöntemi dakika miktarda malzeme analiz edilmesi için izin kütle spektrometresi glycosylhydrolases özgüllüğü ve duyarlılığı yararlanır. Bu teknikte doku kendisini doğrudan kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Bu protokol, enzimatik (endoksilanaz) hidrolizden önce RE'yi 2 aminobenzamid ile etiketleyerek ve ardından elde edilen oligosakkaritlerin kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanılarak analiz edilmesiyle, heteroksilanların indirgeyici uç (RE) ve iç bölge glikosil dizi(ler)inin yapısal karakterizasyonu için kullanılan spesifik teknikleri açıklar.

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Bitki defensins patojenlere karşı bitki savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Etkili eylem (MOA) onların mod anlama antifungal ajanları olarak antifungal Bu peptidler kullanımı önemlidir için. Burada, Bu peptidler MOA kritik yönlerini incelemek için canlı hücre görüntüleme yöntemi açıklanmıştır.

Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Bir iletişim kuralı tarafından mannan örnek olarak kullanarak Jel Elektroforez (AKPM), polisakkaritler yapısal analizi için tanımlanır.

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Bu eser için üç farklı Mısır dokuların içine salgılanan Mısır proteinlerin teslim yerinde bir Ustilago maydis Truva atı zor klonlama açıklar.

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Bu makalenin amacı, RING tipi E3 ubikitin ligaseskapsamlı biyokimyasal ve fonksiyonel çalışmalar için bir anahat sunmaktır. Ayrıntılı protokollere sahip bu çok aşamalı boru hattı, test edilen proteinin enzimatik aktivitesini doğrular ve aktivitenin işlevine nasıl bağdaştırılabildiğini gösterir.

Ring Tipi E3 Ubiquitin Ligases In Vitro ve Planta Fonksiyonel Karakterizasyonu

Bu protokol, kahve-mantar etkileşiminde pektini tespit etmek için mikroskobik bir yöntemi açıklar.

Bitki-Mantar Etkileşiminde Pektini Tespit Etmek için Çift Boyama Yöntemi

Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.

Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları

Keşfedin buğday bitkilerinde Diuraphis noxia istilasına karşı β-1,3-glukanaz ve peroksidaz enzimlerinin hücre duvarı savunma mekanizmalarındaki rolünü. Bu yöntem dirençli buğday çeşitleri geliştirmeye katkı sağlar.

Diuraphis noxia İstilasına Karşı Buğday Hücre Duvarı Savunma Mekanizmasının 946;-1,3-Glukanaz ve Peroksidaz Fizikokimyasal Özelliklerinin Açıklanması (Video) | JoVE Journal

Diuraphis noxia İstilasına Karşı Buğday Hücre Duvarı Savunma Mekanizmasının #946;-1,3-Glukanaz ve Peroksidaz Fizikokimyasal Özelliklerinin Açıklanması

Daha fazla video keşfet