Name: Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Öğrenin, farelerde hipokampusun dentat girusundaki granül hücrelerde in vivo kalsiyum görüntülemesi için virüs enjeksiyonu ve GRIN lens implantasyonunu tek cerrahi prosedürde nasıl birleştireceğinizi. Bu yöntem, nöral kodlama ve bilişsel işlevlerdeki uzamsal temsilleri incelemek için yüksek kaliteli veri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Şanghay Temel Araştırma Pilot Programı - Fudan Üniversitesi 21TQ1400100 (22TQ019), Şanghay Belediye Bilim ve Teknoloji Büyük Projesi, Lingang Laboratuvarı (hibe no. LG-QS-202203-09) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32371036).

Farelerin dentat gyrus hücrelerinde nöron aktivitesi için gerçek zamanlı görüntüleme 

<ol><li>Scoville, W. B., Milner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+recent+memory+after+bilateral+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).</li>
<li>Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+hippocampal+pathology+impairs+topographical+and+episodic+memory+but+not+visual+pattern+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching.</a> Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neurophysiological+approaches+in+the+study+of+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular neurophysiological approaches in the study of learning.</a> Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).</li>
<li>Zemla, R., Basu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal function in rodents.</a> Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).</li>
<li>Basu, J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corticohippocampal+circuit%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733(2015).</li>
<li>Gobbo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+signature+of+spatial+decision-making+during+navigation+by+freely+moving+rats+by+using+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119(2022).</li>
<li>Schuette, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabaergic+ca1+neurons+are+more+stable+following+context+changes+than+glutamatergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells.</a> Sci Rep. 12 (1), 10310(2022).</li>
<li>Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding%2C+consolidation%2C+and+retrieval+of+contextual+memory%3A+Differential+involvement+of+dorsal+ca3+and+ca1+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions.</a> Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).</li>
<li>Ognjanovski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Parvalbumin-expressing+interneurons+coordinate+hippocampal+network+dynamics+required+for+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation.</a> Nat Commun. 8, 16120(2017).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Yassa, M. A., Stark, C. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the hippocampus.</a> Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).</li>
<li>Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory.+Engram+cells+retain+memory+under+retrograde+amnesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia.</a> Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).</li>
<li>Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+investigations+into+the+role+of+histamine+in+the+dentate+gyrus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat.</a> Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).</li>
<li>Kim, S., Jung, D., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cell+maps+slowly+develop+via+competitive+learning+and+conjunctive+coding+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus.</a> Nat Commun. 11 (1), 4550(2020).</li>
<li>Danielson, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dentate+gyrus+mossy+cells+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice.</a> Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+gcamp6m%27s+ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m's ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0170934(2017).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normcorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInan%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2021).</li>
<li>Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+viral+injection+and+gradient-index+lens+implantation+for+deep+brain+in+vivo+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging.</a> J Vis Exp. (176), (2021).</li>
<li>Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-day+calcium+imaging+of+ca1+hippocampus+in+freely+moving+rats+reveals+a+high+preponderance+of+place+cells+with+consistent+place+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields.</a> J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).</li>
<li>Masala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+hippocampal+Ca2%2B+micro-waves+following+synapsin-dependent+adeno-associated+viral+expression+of+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniscope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Cholvin, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+spatial+representation+by+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 6227(2022).</li>
</ol>

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Burada, farelerin DG'sinde in vivo kalsiyum görüntüleme için bir prosedür tanımladık. Bu protokolün, özellikle genetik olarak tanımlanmış bir alt popülasyonun ilgi çekici olduğu durumlarda, çeşitli bilişsel süreçlerde DG işlevlerini incelemeyi amaçlayan araştırmacılar için yararlı olacağına inanıyoruz. Burada, cerrahideki bazı önemli noktaları vurgulayarak protokolümüzün avantajlarını açıklıyoruz ve bu yöntemin sınırlamalarını tartışıyoruz.
Mevcut literatürden DG görüntüleme için çeşitli prosedürleri test ettik ve bu protokolde detaylandırıldığı gibi deneysel prosedürleri optimize ettik. Bize göre, aşağıdaki üç önemli değişiklik protokolümüzün başarı oranını büyük ölçüde artırdı. İlk olarak tüm cerrahi işlemleri bir oturuşta birleştirirken, subkortikal bölgelere yönelik birçok kalsiyum görüntüleme çalışmasında iki ayrı ameliyatta virüs enjeksiyonu ve lens implantasyonu gerçekleştirildi. Yaklaşımımızın önemli bir avantajı, virüs ekspresyonu ve beyin dokusu iyileşmesinin artık aynı dönemde gerçekleşmesi ve fare hazırlığı için bekleme süresini yarı yarıya azaltmasıdır, bu da genellikle21 ay sürer. Ayrıca, 100 μm aralığında bir uyumsuzluk ile hafif eğimler prosedürün başarısızlığına yol açacağından, ayrı ameliyatlar farenin doğru bir şekilde yeniden konumlandırılmasını gerektirir. Lensi yanlış yerleştirmekten kaçınmak için, bazı gruplar miniskopu merceğe bağlayan bir yaklaşım geliştirdi ve implantasyon ameliyatı sırasında sensörün nöronal ifadesini görüntülemeye çalıştı. Bu geçici çözüm, yaygın olarak kullanılan stereotaksik aparatın önemsiz olmayan mühendisliğini gerektirir ve anestezi sırasında nöron aktivitelerinin baskılanması nedeniyle kullanımı karmaşıktır. Yöntemimiz, farenin yeniden konumlandırılmasını gerektirmez, böylece prosedürle ilişkili zamanı ve stresi büyük ölçüde azaltır.
Yaklaşımımızın ikinci kilit noktası, hedef bölgeye22 tekrar tekrar küçük miktarlarda virüs enjekte etmemizdir. Bu, daha fazla hücrenin enfekte olmasına yol açar. Daha da önemlisi, tek bir enjeksiyon bölgesinde virüs yükünün arttırılmasıyla karşılaştırıldığında, bu yaklaşım, enfekte olmuş hücrelerin konumlarının görüş alanı boyunca eşit şekilde yayılması açısından üstün sonuçlar vermiştir. İlgili bir diğer önemli nokta, virüs titresinin seyreltilmesinin kalsiyum görüntülemenin kalitesini artırmasıdır. Deneyimlerimize göre, aşırı miktarda virüs, önceki bir rapor23 ile tutarlı olan dalga benzeri aktivite kümelerinin ortaya çıkmasıyla ilişkilidir. Başlangıçta doku aspirasyonunun enjeksiyon bölgesinde virüsün erken temizlenmesine ve yetersiz ekspresyona yol açabileceğinden şüphelenirken, böyle bir fenomen gözlemlemedik ve protokolümüz genellikle hedef bölgenin sağlam bir şekilde enfekte edilmesini sağladı. GCaMP eksprese eden transgenik farelerle karşılaştırıldığında, virüs yaklaşımı kaçınılmaz olarak daha az tutarlıdır, ancak karmaşık üreme gerektirmediği için daha esnek kullanım sunar. Bununla birlikte, GCaMP'nin ekspresyonu komşu beyin yapılarına yayılabileceğinden veya hedef beyin bölgesinde eşit olmayan bir şekilde dağılabileceğinden, sabit dokudan virüs ve lensin anatomik pozisyonlarının dikkatli bir şekilde incelenmesi sonuçların yorumlanması için kritik öneme sahiptir. Bölgeye veya hücre tipine özgü Cre çizgilerini Cre'ye bağlı GCaMP ifadesiyle birleştirmek, görüntülenen sinyallerin özgüllüğünü artırabilir.
Protokolümüzün üçüncü kilit noktası, lensin implantasyonu sırasında, implantasyon alanında artık kan kalmadığından emin olmak için lens yerleştirme ve durulamayı birkaç kez tekrarlamamızdır. Bu, doku iyileşmesini kolaylaştırmak ve prosedürün başarı oranını artırmak için önemli bir operasyondur. Kesin mekanizma bilinmemekle birlikte, lens yerleştirilmesinin kaçınılmaz olarak dokuda bir miktar hasara neden olacağını ve durulama adımının bu hasara bağlı kanamayı temizleyeceğini tahmin ediyoruz. Aksi takdirde, yerleştirme ile ilişkili kanamanın beynin temizlenmesi uzun zaman alabilir, bu da lokal inflamasyon ve makrofaj sızması olasılığını artırır ve her ikisi de optik kaliteyi düşürür. Ek olarak, bu protokolde verdiğimiz koordinatlarda, lensi sagital sişe biraz daha yakın yerleştirmenin, üçüncü ventrikülü delmekten kaçınmak önemli olsa da, genellikle görünür hücre sayısının artmasına neden olduğunu bulduk. Bu adımda daha iyi sorun giderme için yaygın sorunların bir listesini de sağladık (Tablo 1).
Farenin, eklenen ağırlığın kafa üzerindeki etkisini en aza indirmek için davranışsal deneylerden önce sahte miniskopu takması için eğitilmesi gerekir. Tipik olarak, bu eğitim ~ 3 gün sürer ve her seans 20 dakika sürer. Davranışsal deneyler sırasında, farenin fiziksel durumu düzenli olarak izlenmelidir. Farenin davranışsal performansı, sağlığından büyük ölçüde etkilenecektir.
Bu protokol çeşitli sınırlamalar içerir. İlk olarak, kalsiyum görüntülemenin, sensörlerin ifadesinden etkilenebilecek nöral aktivitenin bir vekili olduğuna dikkat edilmelidir. Bir miniskop kullanan tek fotonlu görüntüleme yöntemleri, komşu hücrelerden üst üste binen sinyallere yol açabilir ve bu da sonraki analizlerden karıştırılmayı gerektirir. Ek olarak, protokolümüz invaziv ameliyatları içerir. GRIN lens implantasyonu adımı sırasında, genellikle CA1 bölgesinin bir kısmı, retrosplenial korteks ve ilişkisel görsel korteks dahil olmak üzere bir beyin dokusu parçası çıkarılır. Bu, tek fotonlu aydınlatmanın sağladığı görüntüleme derinliğinin sınırlandırılması nedeniyle gereklidir. Gözlemlerimizde, cerrahi prosedürü takiben farelerde, ne genel, sınırsız davranışlarında ne de doğrusal yol görevlerinin öğrenilmesinde herhangi bir belirgin davranışsal eksiklik fark etmedik (Ek Şekil S1). Alternatif olarak, beyin dokusu emmesi için otomatik cerrahi aletlerin kullanılması, manuel operasyonla ilişkili hataları azaltabilir ve böylece cerrahi prosedürün hassasiyetini artırabilir24. Ayrıca, kalsiyum görüntüleme verilerimiz genel olarak normal kalsiyum dinamiklerini verdi. Daha karmaşık bilişsel işlevler üzerindeki etki daha fazla karakterizasyona ihtiyaç duyar. Doku aspirasyonu olmadan lens yerleştirilmesi için alternatif bir yöntemdaha önce tanımlanmıştır 25. Bu, beyin dokusunda amaçlanan yerleştirme yolu boyunca bir kesi yapılarak ve lensi doğrudan açıklıktan yerleştirerek elde edilir. Deneyimlerimize göre, bu yaklaşım, yerleştirme yolu boyunca beyin dokusunun katlanmasına veya diğer deformasyonlarına yol açar ve bu hala invaziv olabilir. Deformasyonun yüksek değişkenliği, bu yaklaşımı tanımladığımız protokolden daha az güvenilir hale getirir. Protokolümüzün bir başka olası uyarısı, farenin davranışsal performansının, miniskop ile miniskop Veri Toplama (DAQ) Kutusunu birbirine bağlayan koaksiyel kablodan biraz etkilenmesidir. Bunun nedeni sadece tellerin çok sayıda dönüşten sonra birbirine sarılması değil, aynı zamanda telin görev sırasında fare için dikkat dağıtıcı olabilmesidir. Kablosuz bir miniskop26 kullanmak bu sorunu etkili bir şekilde çözecektir. 
Mevcut sınırlamalara rağmen, bu metodolojinin, hipokampal dentat girus içindeki nöronal aktivite modellerini incelemek için in vivo kalsiyum görüntülemeyi kullanmakla ilgilenen araştırmacılar için oldukça faydalı olabileceğine inanıyoruz. Örneğin, bu in vivo kalsiyum görüntüleme yaklaşımı, özellikle dentat girus bölgesindeki yer hücrelerini araştırmak için uygulanabilir. Bu, yer hücrelerinin farklı beyin bölgelerinde bilgiyi nasıl kodladığının araştırılmasını sağlayacaktır10,27. Doğrulamamız, bu protokolün makul ölçüde tekrarlanabilir olduğunu, yüksek başarı oranlarıyla ve farklı beyin bölgelerine uygulanabileceğini göstermektedir.

Önceki çalışmalar, hipokampusun anıları işlemek ve geri almak için gerekli bir beyin yapısı olduğunu buldu 1,2. 1950'lerden bu yana, kemirgenlerdeki hipokampusun nöral devreleri, hafıza oluşumu, depolanması ve geri çağrılması çalışmalarında odak noktası olmuştur3. Hipokampus içindeki anatomik yapılar, dentat girus (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 ve subiculum4'ün alt bölgelerini içerir. Bu alt bölgeler arasında karmaşık çift yönlü bağlantılar bulunur ve bunlardan DG, CA1 ve CA3, granül hücreler ve piramidal hücrelerden oluşan belirgin bir trisinaptik devre oluşturur5. Bu devre, birincil girdisini entorinal korteksten (EC) alır ve sinaptik plastisiteyi incelemek için klasik bir model olmuştur. Daha önce in vivo hipokampus fonksiyonu üzerine yapılan araştırmalar, daha kolay erişimi nedeniyle çoğunlukla CA1 6,7 üzerinde yoğunlaşmıştır. CA1 nöronları, özellikle uzamsal hafıza için yer hücrelerinde hafıza oluşumu, konsolidasyonu ve geri alınmasında önemli roller üstlenirken, hipokampusun diğer alt bölgeleri de hayati öneme sahiptir 8,9. Özellikle, son çalışmalar DG'nin hafıza oluşumundaki işlevlerini vurgulamıştır. DG'deki yer hücrelerinin CA110'dakilerden daha kararlı olduğu bildirilmiştir ve aktiviteleri bağlama özgü bilgileriyansıtır 11. Ayrıca, DG granül hücrelerinin aktiviteye bağlı etiketlemesi, hafıza ile ilgili davranışları indüklemek için yeniden etkinleştirilebilir12. Bu nedenle, DG'deki bilgi kodlaması hakkında daha derin bir anlayış kazanmak için, hayvan hafızaya bağlı görevleri yerine getirirken DG alt bölgesinin aktivitelerini araştırmak çok önemlidir.
DG aktiviteleri ile ilgili önceki çalışmalar çoğunlukla in vivo elektrofizyoloji13 olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu tekniğin bazı dezavantajları vardır: Birincisi, elektrik kayıtlarında, sinyali üreten çeşitli hücre türlerini doğrudan tanımlamak zor olabilir. Kaydedilen sinyaller hem inhibitör hem de uyarıcı hücrelerden gelir. Bu nedenle, bu iki hücre tipini ayırmak için daha fazla veri işleme yöntemi gereklidir. Ayrıca, projeksiyona özgü alt gruplar veya aktiviteye bağlı etiketleme gibi diğer hücre tipi bilgilerini elektrikli kayıtlarla birleştirmek zordur. Ek olarak, DG'nin anatomik morfolojisi nedeniyle, kayıt elektrotları genellikle ortogonal bir yönde implante edilir, bu da kaydedilebilecek nöron sayısını büyük ölçüde sınırlar. Bu nedenle, elektrik kayıtlarının aynı hayvanda DG yapısından yüzlerce bireysel nöronun izlenmesini sağlamak zordur14.
DG'de nöron aktivitelerini kaydetmenin tamamlayıcı bir tekniği, in vivo kalsiyum görüntülemeninkullanılmasıdır 15. Kalsiyum iyonları, organizmalardaki hücresel sinyalleşme süreçleri için temeldir ve özellikle memeli sinir sistemi içinde birçok fizyolojik fonksiyonda çok önemli bir rol oynar. Nöronlar aktif olduğunda, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu hızla artar ve nöronal aktivitenin ve sinyal iletiminin dinamik doğasını yansıtır. Bu nedenle, nöronlardaki hücre içi kalsiyum seviyelerindeki gerçek zamanlı değişikliklerin kaydedilmesi, nöral kodlama mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sağlar.
Kalsiyum görüntüleme teknolojisi, floresan yoğunluğundaki değişiklikleri tespit ederek nöronlardaki kalsiyum iyon konsantrasyonlarını izlemek için özel floresan boyalar veya genetik olarak tasarlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) kullanır ve bunlar daha sonra mikroskobik görüntüleme ile yakalanabilir16. Yaygın olarak, yeşil floresan proteini (GFP), kalmodulin ve M13 polipeptit dizilerini içeren GCaMP kalsiyum indikatör genleri ailesi kullanılır. GCaMP, kalsiyum iyonlarına17 bağlandığında yeşil floresan yayabilir ve yeşil floresanstaki dalgalanmaların görüntüleme18 aracılığıyla kaydedilmesine izin verir. Ek olarak, hedef beyin bölgesinin net görüntülerini elde etmek için, tipik olarak ilgilenilen bölgenin üzerine bir Gradyan İndeks Lensi (GRIN lens) implante edilir. GRIN lens, doğrudan yüzeyden erişilemeyen derin beyin bölgesinin görüntülenmesini sağlar.
Bu tekniğin, farklı hücre tiplerini etiketlemek için diğer genetik araçlarla birleştirilmesi nispeten kolaydır. Ayrıca, görüntüleme düzlemi DG'deki hücrelerin oryantasyonuna paralel olduğundan, her başarılı ameliyatta görüntüleme için yüzlerce nörona erişilebilir. Bu çalışmada, farelerde dentat girusta in vivo kalsiyum görüntüleme için tam ve ayrıntılı bir cerrahi protokol sunuyoruz (Şekil 1). Prosedür iki ana operasyonu içerir. Birincisi, AAV-CaMKIIα-GCaMP6f virüsünü DG'ye enjekte etmektir. İkinci işlem, virüs enjeksiyon bölgesinin üzerine bir GRIN lensi implante etmektir. Bu iki işlem aynı oturuşta gerçekleştirilir. Bu ameliyatlardan sonra iyileşme sağlandıktan sonraki adım, minyatür mikroskoplar (miniskoplar) ile görüntüleme kalitesini kontrol etmektir. Görüntüleme alanında yüzlerce aktif hücre varsa, sonraki prosedür, minoskop taban plakasını diş çimentosu kullanarak fare kafatasına tutturmaktır; Fare daha sonra görüntüleme deneyleri için kullanılabilir. Ayrıca, toplanan kalsiyum verilerinin analizini kolaylaştırmak için MATLAB tabanlı bir ön işleme hattı sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>200 &mu; L üniversal pipet uçları</td><td>Transcat Pipetler</td><td>1030-260-000-9</td><td>Kan ve salini çıkarmak için</td></tr><tr><td>25 G luer kilit künt iğne (Önceden bükülmüş dağıtım uçları)</td><td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>Beyin dokusunu çıkarmak için</td></tr><tr><td>3D baskılı koruyucu kapak</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>GRIN Lensi korumak için</td></tr><tr><td>% 75 etanol</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co., Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>GRIN lens yüzeyinin dezenfeksiyonu ve temizlenmesi için</td></tr><tr><td>AAV2/9-CaMKII&alpha;-GCaMP6f virüsü</td><td>Beyin Kılıfı</td><td>BC-0083</td><td>Viral enjeksiyon için</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 sürüm 22.1</td><td>Figür çizmek için</td></tr><tr><td>Anestezi hava pompası</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-30</td><td>Anestezi için</td></tr><tr><td>Kamera kontrol yazılımı</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td> <td>Davranışsal verileri kaydetmek için</td></tr><tr><td>Kanül / Seramik Yüksük Tutucular (GRIN lens tutucu)</td> <td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68214</td><td>GRIN lensi tutmak için</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>Farenin ameliyat sonrası ağrısını azaltmak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Koaksiyel Kablo</td><td>Açık ephys</td><td>CW8251</td><td>Minoskop ve miniskop DAQ kutusunu bağlamak için</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus Life Science&nbsp;</td><td>FV3000</td><td>Beyin dilimlerini gözlemlemek için</td></tr><tr><td>Pamuklu çubuk</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd</td><td>20202140438</td><td>Dezenfeksiyon için</td></tr><tr><td>Özelleştirilmiş başlık</td><td>N/A</td><td>N/A Fareyi</td><td>koşu tekerleği üzerinde tutmak için</td></tr><tr><td>Özelleştirilmiş başlık tutucu</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Farenin kafa plakasını tutmak için</td></tr><tr><td>Protez taban malzemeleri (kendi kendine kürlenen)</td><td>New Centry Dental</td><td>430205</td><td>Miniskop</td></tr><tr><td>Tüy dökücü krem</td><td>Veet</td><td>ASIN'i takmak için: B001DUUPQ0</td><td>Farenin tüylerini almak için</td></tr><tr><td>Strument'ta masaüstü dijital stereotaksik, SGL M</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68803</td><td>Viral enjeksiyon ve GRIN lens implantasyonu için</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Farenin ameliyat sonrası iltihaplanmasını önlemek için</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>Ameliyatlar sırasındaki koşulları gözlemlemek için</td></tr><tr><td>Gaz filtresi bidonu, büyük, 6'lı paket</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>Anestezi için</td></tr><tr><td>GRIN lens</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>GRIN lens implantasyonu için</td></tr><tr><td>GRIN lens</td><td>InFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>GRIN lens implantasyonu için</td></tr><tr><td>İndüksiyon odası-fare (15 cm x 10 cm x 10 cm)</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>V100</td><td>Anestezi için</td></tr><tr><td>Endüstriyel kamera</td><td>Daheng Görüntüleme</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>Davranışsal verileri elde etmek için</td></tr><tr><td>İyodofor dezenfektan</td><td>Qingdao Hainuo Innovi Dezenfeksiyon Technology Co., Ltd</td><td>8861F6DFC92A</td><td>Dezenfeksiyon için</td></tr><tr><td>Anestezi için Isofluran</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı numune toplama tüpü (Nanoject III için Cam Kılcal Damarlar mikropipeti)</td> <td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Viral enjeksiyon için</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>Verileri analiz etmek için</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>78001</td><td>Kraniyotomi için</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>Sıvı numune toplama tüpünü çekmek</td></tr><tr>için<td>Mineral yağ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Viral enjeksiyon için</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ Yazılımı</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>Kalsiyum görüntüleme verilerini kaydetmek için</td></tr><tr><td>Miniscope Veri Toplama (DAQ) Kutusu (V3.3)</td><td>Açık ephys</td><td>V3.3</td><td>Kalsiyum görüntüleme verilerini elde etmek için</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>In vivo kalsiyum görüntüleme için</td></tr><tr><td>Miniscope V4 taban plakası (Varyant 2)</td><td>Open ephys</td><td>Variant 2</td> Miniscope nanoject <td>III'ü tutmak için</td></tr><tr><td>Programlanabilir Nanolitre Enjektör</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>Viral enjeksiyon için</td></tr><tr><td>Oftalmik merhem</td><td>Cisen Pharmaceutical Co., ve Tic. Ltd. Şti</td><td>H37022025</td><td>Gözleri nemli tutmak için</td></tr><tr><td>PCR tüpü</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>Virüsü seyreltmek için</td></tr><tr><td>Kişisel Bilgisayar (ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>Kalsiyum görüntüleme verilerini ve davranışsal verileri kaydetmek için</td></tr><tr><td>Koşu tekerleği</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd</td><td>NA-H115</td><td>Taban plakasını takarken fareyi tutmak için</td></tr><tr><td>Tornavida (M1.6 vidalar)</td><td>Yeşillik (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)</td><td>60902</td><td>M1.6 vidalarını sökmek için</td></tr><tr><td>Tornavida (ayar vidaları)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)</td><td>S2</td><td>Ayar vidalarını sökmek için</td></tr><tr><td>Ayar vidası</td><td>TBD</td><td>2-56 koni noktası ayar vidası</td><td>Miniskopu taban plakasına sabitlemek için</td></tr><tr><td>Küçük hayvan anestezi makinesi</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R500</td><td>Anestezi için</td></tr><tr><td>Steril şırınga</td><td>Jiangsu Çin Seddi Tıbbi Cihazlar A.Ş., LTD</td><td>20163140236</td><td>Kanı durulamak için</td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>S14016-13</td><td>Saç ve saç derisini kesmek için</td></tr><tr><td>ThermoStar sıcaklık kontrol cihazı, 69025 ped dahil.</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>69027</td><td>Hayvanın vücut ısısını korumak için</td></tr><tr><td>Ultra ince forseps</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>F11020-11</td><td>Kemik kalıntılarını ve dura</td></tr><tr><td>USB 3.0 kablosunu</td> çıkarmak için <td>Ephys N</td><td>/A'yı</td> açın <td>Minoskop DAQ kutusunu ve bilgisayarın UV ışığını bağlamak için</td></tr><tr><td></td><td>Jinshida</td><td>66105854002</td><td>GRIN lensini kafatasına</td></tr> <tr><td>sabitlemek içinUV reçinesi (ışıkla sertleşen yapıştırıcı)</td><td>Loctite</td><td>32268</td><td>GRIN lensini kafatasına sabitlemek için</td></tr><tr><td>Vakum pompası</td><td>Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>Kanı, salini ve beyin dokusunu çıkarmak için</td></tr></tbody></table>

farelerde hipokampusun dentat girusundaki granül hücrelerin İn vivo kalsiyum görüntülenmesi 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Gerçek zamanlı yaklaşımlara tipik olarak öğrenme ve hafıza çalışmalarında ihtiyaç duyulur ve in vivo kalsiyum görüntüleme, davranış görevleri sırasında uyanık hayvanlarda nöronal aktiviteyi araştırma imkanı sağlar. Hipokampus, epizodik ve uzamsal hafıza ile yakından ilişkili olduğundan, bu alanın araştırmalarında önemli bir beyin bölgesi haline gelmiştir. Son araştırmalarda, engram hücreleri ve yer hücreleri, açık alan ve doğrusal iz dahil olmak üzere davranışsal görevleri yerine getirirken farelerde minyatür mikroskop kullanılarak hipokampal CA1 bölgesindeki nöral aktiviteler kaydedilerek incelenmiştir. Dentat girus, hipokampustaki bir diğer önemli bölge olmasına rağmen, daha derin olması ve görüntüleme zorluğu nedeniyle nadiren in vivo görüntüleme ile çalışılmıştır. Bu protokolde, virüsün nasıl enjekte edileceği, bir GRIN (Gradyan indeksi) lensinin nasıl implante edileceği ve hipokampusun dentat girusunun görüntülenmesi için bir taban plakasının nasıl takılacağı dahil olmak üzere bir kalsiyum görüntüleme sürecini ayrıntılı olarak sunuyoruz. Kalsiyum görüntüleme verilerinin MATLAB kullanılarak nasıl ön işleneceğini daha ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ek olarak, görüntüleme gerektiren diğer derin beyin bölgelerinin çalışmaları bu yöntemden fayda sağlayabilir.

Şekil 1 , virüs enjeksiyonu, GRIN lens implantasyonu, taban plakası ekfiksasyonu, bir miniskop aracılığıyla in vivo kalsiyum görüntüleme ve veri işleme dahil olmak üzere deneysel prosedürün şemasını göstermektedir. Genel olarak, tüm prosedür 1 ay sürer. Şekil 2 , kafatası üzerinde açılan deliğin konumlandırılması ve GRIN lens implantasyonundan önce beyin dokusunun durumu dahil olmak üzere örnek virüs enjeksiyon prosedürlerini göstermektedir.
Şekil 3 , bu ameliyatın başarısı için çok önemli olan beyin dokusunun çıkarılması sürecini göstermektedir. Daha fazla doku emildikçe, farklı doku katmanları görünür hale gelir. Bu emme adımı, gri, yansıtıcı bir tabaka gözlemlendiğinde durdurulabilir.
Şekil 4 , GRIN merceğinin yerleştirilmesi, kafa plakasının kafatasına yapıştırılması ve GRIN merceğinin özelleştirilmiş bir kapakla kaplanması dahil olmak üzere GRIN implantasyon prosedürünü göstermektedir. İn vivo kalsiyum görüntülemenin görüntüleme kalitesi, virüs enjeksiyonunun ve GRIN lens implantasyonunun başarısına bağlıdır.
Şekil 5, in vivo kalsiyumgörüntülemeden elde edilen dört tür sonucu göstermektedir.Şekil 5A başarısız sonuçtur; Görüntüleme görüş alanında aktif hücre gözlenmedi. Şekil 5B-D başarılı sonuçlardır. Şekil 5B'de 10'dan az aktif hücre vardır, ancak belirgin bir kan damarı yoktur. Şekil 5C, 50'den fazla aktif hücreye ve görünür kan damarlarına sahiptir. Şekil 5D'de, görüntüleme görüş alanında yüzlerce aktif hücre vardır; Aynı zamanda, temiz kan damarları gözlemledik. Yüksek kaliteli in vivo kalsiyum görüntüleme tipik olarak yüzlerce aktive edilmiş hücreye sahiptir. Bir düzineden az aktive edilmiş hücrenin görüntüleme sonuçları için yetersiz olduğu düşünülmektedir. Genellikle, hücre sayısı GRIN merceğinin çapı ve beyin bölgesinin bir kısmı ile ilişkilidir. Daha büyük bir GRIN lens çapı ve sırt tarafına daha yakın bir beyin bölgesi, daha aktif hücrelerin gözlemlenme olasılığını artıracaktır. GRIN merceğinin çapı ne kadar büyük olursa, fare beynine o kadar fazla zarar verdiğini unutmamak da çok önemlidir; Bu nedenle, uygun boyutu seçmek çok önemlidir. 1 mm çapında bir GRIN merceğinin implante edilmesi, hayvanın doğrusal iz davranışını edinme yeteneğini etkilemez (Ek Şekil S1).
Davranışsal veriler ve kalsiyum görüntüleme verileri genellikle ayrı ayrı işlenir. Fare davranış verileri manuel olarak etiketlenebilir veya açık kaynaklı analiz yazılımı kullanılarak işlenebilir. Kalsiyum görüntüleme verileri, MATLAB'da Rijit Olmayan Hareket Düzeltme (NoRMCorre) ve EXTRACT kullanılarak işlenir. Şekil 6 , görüş alanına üst üste bindirilmiş ekstrakte edilmiş tek tek hücreleri göstermektedir ve başarılı bir in vivo kalsiyum görüntüleme kaydından beş temsili kalsiyum izini göstermektedir. Ham verilerin temsili bir videosu için Ek Video S1'e bakın.
GRIN lens implantasyonu ve viral enjeksiyonun hedeflenen beyin bölgesinde gerçekleştiğinin doğrulanması son adımdır ve verilerin yorumlanması için de çok önemlidir. Şekil 7 , GCaMP6f ekspresyonunun konumunu (yeşil floresan bölgesi) ve GRIN merceğinin izini gösteren bir fare beyni dilimidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg"> Şekil 1: Virüs enjeksiyonu ve GRIN lens implantasyonu prosedürlerinin diyagramı. (A) AAV-CaMKIIα-GCaMP6f virüsünü dentat girusa enjekte edin. (B) GRIN lensini dentat girusun üzerine implante edin. (C) Ameliyattan sonra görüntüleme kalitesini kontrol edin. (D) Kontrol ettikten sonra miniskop taban plakasını takın. (E) Tüm protokolün zaman çizelgesi ve süreci. Kısaltma: GRIN = Gradyan indeksi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg"> Şekil 2: Virüs enjeksiyonu sırasında temsili cerrahi görünüm. (A) Fareyi stereotaksik cihazın üzerine yerleştirin. (B) GRIN lens implantasyon alanını (siyah bölge) işaretleyin. (C) Hedef bölgede kraniyotomi. (D) Dentat girusa 240 nL virüs enjekte edin. (E) Enjeksiyondan sonra mikropipeti çıkarın. (F) Korteks ve CA1 beyin dokusunun bir kısmını çıkarın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg"> Şekil 3: Beyin dokusu aspirasyonu sırasında temsili cerrahi görünüm. (A) Siyah işaretleyici ile çevrelenen bölge, bir mikromatkap kullanılarak parlatılır ve geride (B) kısmen açıkta kalan kortikal doku bırakılır. Sol kısım açıkta kalan bir korteksi gösterir ve sağ kısım dura ve kafatası dokusu ile kaplıdır. (C) Kortikal beyin dokusunun aspirasyonu sırasında temsili görüntü. Doku soluk pembe kalır. (D) Beyaz madde, beyaz okla gösterildiği gibi görüş alanı içinde görülebilir. (E) Daha fazla emme, beyaz maddenin altında koyu gri-kırmızı, yansıtıcı bir yüzey ortaya çıkardı. Bölgenin (siyah ok) CA1 yüzeyi olduğu ve emişin daha derine inmemesi gerektiği düşünülmektedir. (F) Birkaç kez tuzlu su ile duruladıktan sonra bölgeden daha fazla kanama görülmez. Tüm panellerde, yıldızlar cerrahi aletleri gösterir: salin için 30 G künt iğne ve beyin dokusu aspirasyonu için 25 G künt iğne. Ölçek çubukları = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg"> Şekil 4: GRIN lens implantasyonu ve taban plakası bağlantısı için örnek bir prosedür. (A) Bir GRIN lens tutucu kullanarak GRIN lensini beyin dokusuna implante edin. (B) GRIN lensini UV reçinesi ile uygun yere yapıştırın; yansıtıcı kısım UV reçinesini temsil eder. (C) UV reçinesi kullanarak kafa plakasını fare kafatasına takın. (D) GRIN lensini 3D baskılı bir koruyucu kapakla kapatın. (E) Ameliyat kalitesini kontrol edin. Minoskop bir tutucu tarafından sabitlendi. (F) Protez taban malzemelerini taban plakasının etrafına uygulayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg"> Şekil 5: Başarılı ve başarısız görüntüleme sonuçları. (A) Başarısız in vivo kalsiyum görüntüleme sonucu. A'da aktif hücre yoktur ve birçok bölgede siyah oklarla gösterildiği gibi koyu kan lekeleri vardır. (B-D) Başarılı in vivo kalsiyum görüntüleme sonuçları. (B) 10'dan az aktif hücre gözlenebilir, ancak görüntüleme alanında önemli kan damarları gözlenemez. (C) 50'den fazla aktif hücre ve önemli kan damarları gözlenebilir. (D) Yüzlerce aktif hücre ve daha önemli kan damarları gözlenebilir. Kesikli daireler görüntüleme görüş alanını temsil eder. Yeşil oklar, GCaMP6f'yi ifade eden hücreleri temsil eder. Kırmızı oklar kan damarlarını temsil eder. Ölçek çubukları = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg"> Şekil 6: Doğrusal yolda çalışan bir fareden alınan temsili in vivo kalsiyum görüntüleme verileri. (A) Miniskop tarafından kaydedilen görüntüleme görüş alanı, toplam hücre sayısı = 227. (B) Temsili kalsiyum izleri. Hücrenin konumları A'da aynı renkle gösterilir. (C) Davranışsal görev: Her iki ucunda su ödülleri olan doğrusal parkur. (D) Farenin aktivitesinin davranışsal analizinin temsili sonucu; Toplam süre = 100 sn. Mavi dikey çizgiler, yalama davranışının zaman noktalarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg"> Şekil 7: Ameliyat sonrası farelerden alınan beyin dokusu kesitleri. (A,B) Fare beyin dokularına iki örnek. Kesikli dikdörtgen alanlar, GRIN lens implantasyon yolunu gösterir. Eğri çizgiler, hipokampustaki dentat girusu temsil eder. Ölçek çubukları = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Sorun</td>
			<td>Olası neden:</td>
			<td>Çözüm</td>
		</tr><tr><td>Görüntüleme alanı koyu veya siyah görünür.</td>
			<td>GRIN lensin alt tarafında önemli miktarda kan kalıntısı vardır.</td>
			<td>GRIN lensini implante etmeden önce, salin solüsyonu, artık gözlemlenebilir bir kanama kalmayana kadar cerrahi bölgenin yüzeyini sürekli olarak yıkamak için kullanılır.</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Görüntüleme alanında açıkça görülebilen kan damarları vardır, ancak fark edilebilir bir nöronal aktivite yoktur.</td>
			<td>1. Virüs ekspresyonu yetersiz veya zayıftı.</td>
			<td>1. Aşağıdakileri kontrol etmeniz tavsiye edilir:</td>
		</tr><tr><td>2. Gözlemlenen virüs ekspresyonunun konumu, GRIN lensin implante edildiği pozisyonla eşleşmiyor (genel olarak, GRIN lensin implantasyon pozisyonu, istenen konuma kıyasla çok sığdır).</td>
			<td>a. Virüs saklama koşullarının uygun olduğundan emin olun.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>b. Virüs yerleştirme konumunun doğru olduğundan emin olun.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>c. Virüs konsantrasyonunun uygun olduğunu onaylayın.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>2. Bir sonraki cerrahi prosedür sırasında, GRIN lens implantasyonunun derinliği uygun şekilde arttırılabilir ve deney her yapıldığında tam derinlik dikkatlice kaydedilmelidir.</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Görüntüleme alanı, bazı bölgesel nöronal aktivite modellerini gösterir, ancak bireysel hücre düzeyinde açıkça görülebilen bir aktivite yoktur.</td>
			<td>1. Enjekte edilen virüsün hacmi aşırı derecede yüksekti.</td>
			<td>1. Virüsü seyreltin veya virüs enjeksiyonunun hacmini azaltın.</td>
		</tr><tr><td>2. Virüs ekspresyonunun konumu, GRIN merceğinin konumuyla uyumlu değildir (tipik olarak, GRIN lensi, virüs ifadesi için en uygun konumdan daha sığ bir derinliğe implante edilir).</td>
			<td>2. Bir sonraki cerrahi prosedür sırasında, GRIN lens implantasyonunun derinliği uygun şekilde arttırılabilir ve deney her yapıldığında tam derinlik dikkatlice kaydedilmelidir.</td>
		</tr><tr><td>Görüntüleme alanı içinde her zaman tutarlı bir şekilde parlak bir floresan sinyalini koruyan belirli hücreler vardır ve bu floresansın yoğunluğunda herhangi bir değişiklik yoktur.</td>
			<td>Virüs, tek bir hücre içinde aşırı eksprese edilir.</td>
			<td>Virüsü seyreltin veya virüs enjeksiyonunun hacmini azaltın.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Sorun giderme tablosu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Ameliyat geçirmiş fareler tarafından uzamsal hafıza görevinin normal edinimi. Grafik, her gün 20 dakikalık oturumda tamamlanan denemelerin sayısının niceliksel olarak gösterilmesini göstermektedir. Veriler ortalama ± SEM olarak temsil edilir. N = ameliyatlı grupta 3 fare ve ameliyatsız grupta 4 fare. İstatistiksel karşılaştırma için iki yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı. Kısaltma: ns = önemli değil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video S1: DG'de kalsiyum görüntülemenin temsili ham verileri. Bu video, 5 dakikalık bir süre boyunca kalsiyum aktivitesini göstermektedir. Video, orijinal hızın 10 katı hızda oynatılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Başlık plakasının tasarımı. Bu dosya, başlık plakası tasarımının 2B çizimini ana hatlarıyla belirtir. Başlık plakasının üretimi, çizime göre paslanmaz çeliğin kesilmesini içerir. Kenar çubuğundaki iki küçük deliğe M1.6 dişlerle dokunulmalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: 3D baskılı koruyucu kapağın tasarımı. Bu dosya, bir 3D yazıcı ile kullanılabilecek koruyucu kapak dilimlerinin gcode'unu sağlar. Bu protokolde baskı için hammadde olarak polilaktik asit plastik kullandık. Yandaki küçük delikler, montaj için başlık plakasındaki dişli deliklerin konumlarıyla eşleşir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: Minoskop tutucunun tasarımı. Bu dosya, bir 3D yazıcı ile kullanılabilen miniskop tutucu dilimlerinin gcode'unu sağlar. Silindirik delik, M4 vidalı bir stereotaksik tutucuya montaj için kullanılır. Yandaki deliklerin sıkmak için vida eklemek üzere tasarlanmıştır, ancak tutucu bu özellik olmadan kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 4: Ham kalsiyum görüntüleme video ön işleme için Arduino kontrol kodu ve komut dosyaları. Bu dosya, Arduino'yu kontrol etmek için komut dosyalarını ve kalsiyum görüntüleme verilerini ön işleme kodunu içerir. Arduino kodu, farenin doğrusal bir parkurun alternatif uçlarında su ödülleri için yalamayı öğrendiği davranış kurulumunu kontrol eder. Görevi öğrendikten sonra, fareler tekrar tekrar pistte ileri geri koşarlar. Kalsiyum görüntüleme ön işleme kodu, miniskop tarafından toplanan verilerden dosya formatı dönüştürme, hareket düzeltme, uzamsal aşağı örnekleme ve hücre sinyali çıkarma işlemlerini gerçekleştirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Hipokampusun dentat girusu, öğrenme ve hafızada temel ve farklı işlevleri yerine getirir. Bu protokol, serbestçe hareket eden farelerde dentat girustaki granül hücrelerinin in vivo kalsiyum görüntülemesi için bir dizi sağlam ve verimli prosedürü tanımlar.

Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

in-vivo-calcium-imaging-granule-cells-dentate-gyrus-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Kaynak: Shannonhouse, J.,  et al. İn Vivo Sağlam dorsal kök gangliyonlarındaki primer duyusal nöron ağlarındaki nöronal toplulukların kalsiyum görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2023). Video, transgenik bir farenin dorsal kök gangliyonlarındaki (DRG) nöronal aktiviteyi izlemek için in vivo bir kalsiyum görüntüleme tekniğini göstermektedir. DRG nöronları, kalsiyuma bağlandıktan sonra floresan yoğunluğunu artıran bir kalsiyum indikatörünü ifade eder. Bir arka pençeye uygulanan mekanik veya termal...

Bir farenin sağlam dorsal kök gangliyonlarındaki nöronal toplulukların in vivo kalsiyum görüntülemesi

Kaynak: Calvo-Rodríguez,  et al. Yaşlı hipokampal nöronlarda hücre altı Ca2+. J. Vis. Uzm. (2015).  Bu video, kısa ve uzun süreli sıçan hipokampal kültürlerinde sitozolik kalsiyum seviyelerini ölçmek için floresan görüntülemenin kullanımını göstermektedir. Genç ve yaşlı nöronları karşılaştırarak, yaşlı nöronlarda artan L tipi voltaj kapılı kalsiyum kanal yoğunluğunun ve uzun süreli aktivasyonun, nöronal yaşlanmanın ayırt edici bir özelliği olan kalsiyum aşırı yüklenmesine nasıl yol açtığını...

Kısa Süreli ve Uzun Süreli Sıçan Hipokampal Kültürlerinde İn Vitro Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Lee, H. et. al., Serbestçe Davranan Farenin Amigdalasında Başa Monte Minyatür Mikroskopla Başarılı İn vivo Kalsiyum Görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, gradyan kırılma indisi veya GRIN lens ve minyatür bir mikroskop kullanılarak bir farede in vivo kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir. Kurulum, sürtünmesiz bir mobil kafes sistemi içinde kafa sabitlemesini birleştirir, nöronları uyarır ve kalsiyum iyonu akışını tetikler. GRIN lens, beyindeki kalsiyum sinyalini yakalayarak nöronal...

Serbestçe Hareket Eden Bir Farede Gerçek Zamanlı Mikroendoskopik Kalsiyum Görüntüleme

Burada canlı, uyuşturuldulu bir laboratuvar faresinin genikül ganglionunun nasıl ortaya çıkarılacağını ve bu nöronların topluluklarının uyaranları tatmak için tepkilerini ölçmek için kalsiyum görüntülemenin nasıl kullanılacağını ve farklı uyarıcılarla birden fazla denemeye izin vermeyi sunuyoruz. Bu, hangi nöronların hangi şok tabancalarına yanıt verdiğine derinlemesine karşılaştırmalar sağlar.

Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Yetişkin farenin beyin ata tarafından beyin atmasını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Minyatür mikroskoplu gradyan-kırılma indeksi lens kullanılarak, in vivo zeytin nöral somata aktivitesini incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanılabilir.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, serbestçe davranan farelerde nöronal dinamikleri ve mikro devreleri incelemek için güçlü bir tekniktir. Bu protokol, bir miniskop kullanarak iyi in vivo kalsiyum görüntüleme elde etmek için beyin ameliyatları yapmayı açıklar.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Mevcut protokol, lomber-6 DRG nöron topluluklarının somatik ve viseral uyaranlara tepkilerini ölçmek için in vivo kalsiyum görüntülemeyi ana hatlarıyla belirtir. Farklı uyaranlara yanıt veren nöronlar arasında kapsamlı karşılaştırmalar yapılabilir. Bu protokol, akupunktur gibi viseral ağrı ve somatik stimülasyon mekanizmalarını araştırmak için değerlidir.

In vivo (İn canlı) Dorsal Kök Gangliyon Nöronlarının Somatik ve Viseral Uyaranlara Yanıtının Kalsiyum Görüntülemesi

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI), duyusal nöron sinyalinin sağlam, popülasyon düzeyinde bir analizini sağlar. Burada, sıçan trigeminal gangliyon nöron aktivitesinin in vivo GECI görselleştirmesine izin veren yeni bir yaklaşım geliştirdik.

Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

Bu protokol, sağlam trigeminal ganglion (TG) nöronlarının in vivo GCaMP kalsiyum görüntülemesini tanımlar. Bu tanım, TG maruziyet cerrahisini, TG nöronlarının in vivo konfokal mikroskopi görüntülemesini, TG nöronlarının mikroskobik görüntülemesi sırasında somatik uyaranların uygulanmasını ve in vivo GCaMP kalsiyum görüntüleme verilerinin analizini içerir.

In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi

Öğrenin, farelerde hipokampusun dentat girusundaki granül hücrelerde in vivo kalsiyum görüntülemesi için virüs enjeksiyonu ve GRIN lens implantasyonunu tek cerrahi prosedürde nasıl birleştireceğinizi. Bu yöntem, nöral kodlama ve bilişsel işlevlerdeki uzamsal temsilleri incelemek için yüksek kaliteli veri sağlar.

Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet