Name: Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Sertlik Ölçümü için Fare Retina Kılcal Damarlarının ve Subendotelyal Matriksin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Keşfedin fare retina kılcal damarlarının ve subendotelyal matriksin izolasyonunu, atomik kuvvet mikroskobu ile sertlik ölçümü için. Bu yöntem diyabetik retinopatide mekanik değişiklikleri anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü/NIH hibe R01EY028242 (K.G.'ye), Körlüğü Önleme Araştırmaları/Uluslararası Retina Araştırma Vakfı AMD için Yenilikçi Araştırma Yaklaşımları Katalizör Ödülü (K.G.'ye), Stephen Ryan Makula Araştırmaları Girişimi (RIMR) W.M. Keck Vakfı'ndan (Doheny Göz Enstitüsü'ne) Özel Hibe ve Ursula Mandel Bursu ve UCLA Lisansüstü Konseyi Çeşitlilik Bursu (IST'ye) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Research to Prevent Blindness, Inc.'den UCLA Oftalmoloji Bölümü'ne Sınırsız Hibe ile desteklenmiştir. Bu makaledeki içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Fare Retina Kılcal Damarlarında ve Subendotelyal Matrikste Sertlik Ölçümü

<ol><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+current+understanding%2C+mechanisms%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).</li>
<li>Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+pathological+changes+in+the+diabetic+retina%3A+Implications+for+targeting+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy.</a> Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).</li>
<li>Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+molecular+and+cellular+pathology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+retinal+vascular+inflammation+and+degeneration+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes.</a> Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+matrix+stiffening+by+lysyl+oxidase+enhances+RAGE-mediated+retinal+endothelial+activation+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes.</a> Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+stiffening+promotes+retinal+endothelial+activation+associated+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes.</a> FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).</li>
<li>Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+Mechanotransduction+pathways+that+control+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology.</a> Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).</li>
<li>Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stresses+and+translational+distortion+of+the+nucleus+during+fibroblast+migration+on+a+physiologically+relevant+ECM+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic.</a> Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).</li>
<li>Ghosh, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell+and+tissue+development%3A+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+cell+and+basement+membrane+architecture+contribute+to+sidestream+smoke-induced+choroidal+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+increases+choroidal+endothelial+stiffness+and+susceptibility+to+complement+injury%3A+Implications+for+choriocapillaris+loss+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell+stiffness+contributes+to+complement-mediated+injury+of+choroidal+endothelial+cells+in+a+monkey+model+of+early+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration.</a> J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Phys%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> J Vis Exp. (76), e50489(2013).</li>
<li>Beacham, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+extracellular+matrices+produced+by+cultured+and+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).</li>
<li>Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+stiffness+of+ex+vivo+mouse+aortas+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy.</a> J Vis Exp. (116), e54630(2016).</li>
<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+intimal+stiffening+enhances+endothelial+permeability+and+leukocyte+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration.</a> Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).</li>
<li>Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+trypsin+and+elastase+digestion+techniques+for+isolation+of+murine+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature.</a> Microvasc Res. 154, 104682(2024).</li>
<li>Chaqour, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+measurements+of+retinal+microvessel+stiffness+in+mice+with+endothelial-specific+deletion+of+CCN1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1.</a> Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).</li>
<li>Ashraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+density+of+deep%2C+intermediate+and+superficial+vascular+plexuses+are+differentially+affected+by+diabetic+retinopathy+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).</li>
<li>Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+D%3A+an+Macrophage-derived+factor+mediating+increased+endothelial+cell+permeability+with+implications+for+alteration+of+the+blood-retinal+barrier+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy.</a> FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

AFM, aort ve arterler gibi daha büyük damarların sertliğindeki hastalığa bağlı değişiklikleri ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır16. Bu bulgular, ateroskleroz17 gibi kardiyovasküler komplikasyonlarda endotelyal mekanobiyolojinin rolünün belirlenmesine yardımcı olmuştur. Bu bulgulara dayanarak, erken DR'de retinal mikrovasküler lezyonların gelişiminde endotelyal mekanobiyolojinin daha önce tanınmayan rolünü araştırmaya başladık. Bununla birlikte, bu arayıştaki başarı, retina kılcal sertliğinde diyabetin neden olduğu değişikliklerin doğru ölçümüne dayanır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, büyük damarlara benzer şekilde, retina kılcal damarlarının sertliğinin ve retinal EC tarafından salgılanan subendotelyal matrisin de AFM 4,5,6 kullanılarak doğrudan, doğru ve güvenilir bir şekilde ölçülebileceğini ortaya koymuştur.
Bu yaklaşım, tripsin sindirimi kullanılarak fare retina kılcal damarlarının hafif sabit gözlerden izole edilmesini içerir. Deneyime dayanarak, sabitlenmemiş gözlerden izole edilen kılcal damarlar (hipotonik yöntem kullanılarak) kırılgan olduğundan ve parçalandığından, bu da onları AFM sertlik ölçümü için uygun olmayan hale getirdiğinden, bu hafif sabitleme adımı gereklidir4. Tersine, diğer retinal tripsin sindirim protokolü18'de bildirilen daha güçlü fiksasyon ve bunun sonucunda ortaya çıkan kapsamlı tripsin sindirimi ihtiyacı, sıkı bağlantıların bozulmasıyla değerlendirildiği gibi kılcal yapısal bütünlüğü de tehlikeye atabilir. Bu nedenle, burada kullanılan hafif kılcal fiksasyon ve nazik tripsin sindirimi, aşırı formalin kaynaklı çapraz bağlamadan kaynaklanan sertlik artefaktlarını azaltmaya yardımcı olur ve güvenilir AFM sertlik ölçümü için kılcal damarların yapısal bütünlüğünü sağlar.
Alternatif bir yaklaşım olarak, yakın zamanda yapılan bir çalışmada, hafifçe sabitlenmiş retinal düz yuvalardan retina kılcal damarlarının AFM sertliği ölçümü bildirilmiştir19. Bu yaklaşım, sağlam retina içindeki retina kılcal damarları üzerinde AFM kuvvet girintileri gerçekleştirerek, yerinde sertlik ölçümünü mümkün kılar. Bununla birlikte, bu kılcal sertlik ölçümleri muhtemelen iç sınırlayıcı zarın sertliğini içerir. Ayrıca, bu yaklaşım, özellikle erken DR20'de etkilenen daha derinde yatan kılcal pleksusu dışarıda bırakırken, retinal düz bir montajda erişilebilen yalnızca yüzeysel kılcal damarların ölçümü ile sınırlıdır. Bu sorunlar, tüm retina katmanlarından damarları temiz bir şekilde (artık retina dokusundan yoksun) çıkaran bu yaklaşım kullanılarak ele alınabilir. Şu anda bu protokolü, koroid damarlarını erken AMD'nin hayvan modellerinden izole etmek için optimize ediyoruz. Bununla birlikte, protokolde kullanılan hafif formalin fiksasyonunun AFM ölçümlerinde çapraz bağlanma ile ilişkili bir sertleşme artefaktına neden olabileceğinin farkındayız. Bu nedenle, bu yaklaşım kullanılarak elde edilen vasküler sertlik değerlerini, mutlak sertlikten ziyade sertlikteki nispi değişiklikler (farklı deney grupları arasında) açısından yorumlamak ihtiyatlı olacaktır.
Hafif fiksasyon gerektiren retinal kapillerlerin aksine, retinal EC kültürlerinden elde edilen subendotelyal matriks herhangi bir değişiklik yapılmadan değerlendirilebilir. Bu, büyük ölçüde, kültür ortamına askorbik asit ilavesi (kollajen sentezini15 artıran), hücre dışı bırakma sırasında matris ayrılmasını önleyen cam lamellerin kimyasal modifikasyonu ve uzun süreli kültür süresi (10-15 gün) dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin bir kombinasyonundan kaynaklanan biriken matrisin sağlamlığından kaynaklanmaktadır. Daha da önemlisi, in vitro olarak görülen subendotelyal matriks sertliğindeki hiperglisemiye bağlı artışın, in vivoolarak görülen retinal kılcal damar sertliğinde diyabete bağlı artışla tutarlı olduğunu gösterdik 4. Matris sertliğindeki bir artışın, birlikte genel kılcal sertliği artıran üstteki retinal EC'lerin sertliğini (mekanik karşılıklılık nedeniyle) artırması beklendiğinden, bu şaşırtıcı değildir. Gerçekten de, yakın zamanda retinal EC'lerin diyabetik koşullar altında büyüdüğünde daha sert hale geldiğinigösterdik 4, muhtemelen Rho / ROCK'a bağlı aktin hücre iskeleti gerginliğindeki21 bir artış yoluyla. Bu bulgular aynı zamanda, erken AMD'nin rhesus maymun modelinde görülen koroidal EC sertleşmesinin, devam eden çalışmalarda test edilmekte olan bir fikir olan koroidal subendotelyal matris ve sağlam damarların12 artan sertliğini yansıttığını ima etmektedir. Genel olarak, sabitlenmemiş retinal subendotelyal matriks ve EC'lerdeki sertlik değişikliklerinin, hafif sabit sağlam retinal damarlarda görülen eğilimi yansıtması, hafif fiksasyon yaklaşımının geçerliliğini kanıtlamaktadır.
DR'nin hayvan modellerinden retina kılcal damarlarının doğrudan sertlik ölçümü, yalnızca DR yönetimi için yeni bir terapötik hedef olarak endotelyal mekanobiyolojinin oluşturulmasına yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda gelecekte DR hastalarında retina kılcal sertliğinin non-invaziv değerlendirmesi için yeni hassas görüntüleme teknikleri geliştirmek için güçlü bir gerekçe sağlar. Bu tür noninvaziv teknikler, diyabetin neden olduğu kardiyovasküler hastalıklarda yaygın olarak tespit edilen arteriyel nabız dalga hızındaki değişikliklere benzer şekilde, kılcal damar sertleşmesinden kaynaklanması beklenen kan akışındaki ince değişiklikleri potansiyel olarak tespit edebilir. Diyabetik donörlerden alınan post-mortem insan gözünden izole edilen retina kılcal damarlarının AFM sertlik ölçümleri bu konuda önemli bir kavram kanıtı sağlayacaktır. Tip 1 diyabet4'ün (streptozotosin) fare modelinde retina kılcal sertliğinin erken dönemde arttığı göz önüne alındığında, AFM'nin sertlik ölçen görüntüleme modalitelerinin doğrulanmasında başarılı kullanımı, erken DR patogenezi için klinik bir biyobelirteç olarak retina kılcal sertliğinin tanımlanmasına yol açabilir.

Retina kılcal damarları, retina homeostazını ve görme fonksiyonunu korumak için gereklidir. Gerçekten de, erken diyabetteki dejenerasyonları, diyabetli tüm bireylerin yaklaşık %40'ını etkileyen mikrovasküler bir durum olan diyabetik retinopatinin (DR) görmeyi tehdit eden komplikasyonlarının gelişiminde güçlü bir şekilde rol oynar1. Vasküler inflamasyon, DR'de retinal kılcal dejenerasyona önemli ölçüde katkıda bulunur. Geçmiş çalışmalar, diyabetin neden olduğu retinal vasküler inflamasyonda anormal moleküler ve biyokimyasal ipuçları için önemli bir rol olduğunu göstermiştir 2,3. Bununla birlikte, son çalışmalar, retinal vasküler inflamasyon ve dejenerasyonun çok önemli ancak daha önce tanınmayan bir belirleyicisi olarak retinal kılcal damar sertleşmesini tanımlayan DR patogenezi için yeni bir paradigma ortaya koymuştur 4,5,6.
Spesifik olarak, retinal kılcal damar sertliğindeki diyabetin neden olduğu artışa, retinal endotel hücrelerinde (EC'ler) kollajen çapraz bağlama enzimi lizil oksidazın (LOX) yukarı regülasyonu neden olur ve bu da subendotel matrisini (bazal membran) sertleştirir4,5,6. Matriks sertleştirme, sırayla, üstteki retinal EC'leri (mekanik karşılıklılık nedeniyle) sertleştirir, böylece retina kılcal sertliğinde genel artışa yol açar4. En önemlisi, bu diyabetin neden olduğu retina kılcal damar sertleşmesi tek başına retinal EC aktivasyonunu ve inflamasyon aracılı EC ölümünü teşvik edebilir. Retinal EC kusurlarının bu mekanik regülasyonu, mekanik ipuçlarının biyolojik bir yanıt üretmek için biyokimyasal sinyallere dönüştürüldüğü süreç olan değiştirilmiş endotelyal mekanotransdüksiyona bağlanabilir 7,8,9. Daha da önemlisi, değişen EC mekanik ipuçları ve subendotelyal matriks yapısı, erken yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile ilişkili koroidal vasküler dejenerasyonda da rol oynamaktadır10,11,12, bu da dejeneratif retina hastalıklarında vasküler mekanobiyolojinin daha geniş etkilerini kanıtlamaktadır.
Özellikle, retina kılcal damar sertleşmesi, retina iltihabının başlangıcı ile aynı zamana denk gelen diyabetin erken dönemlerinde meydana gelir. Bu nedenle, retinal kılcal sertlikteki artış, DR için hem terapötik bir hedef hem de erken tanısal bir belirteç olarak hizmet edebilir. Bu amaçla, retina kılcal damarlarının ve subendotelyal matriksin güvenilir ve doğrudan sertlik ölçümlerinin elde edilmesi önemlidir. Bu, hücrelerin, hücre dışı matrisin ve dokuların sertliğini doğrudan ölçmek için benzersiz, hassas, doğru ve güvenilir bir teknik sunan bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak elde edilebilir13. Bir AFM, sertliği girintili AFM konsolunun bükülme derecesini belirleyen numuneye çok küçük (nanoNewton seviyesinde) girinti kuvveti uygular - numune ne kadar sert olursa, konsol o kadar fazla bükülür ve bunun tersi de geçerlidir. Kültürlenmiş endotel hücrelerinin, subendotel matrislerinin ve izole fare retina kılcal damarlarınınsertliğini ölçmek için AFM'yi yaygın olarak kullandık 4,5,6,11,12. Bu AFM sertlik ölçümleri, endotelyal mekanobiyolojinin DR ve AMD patogenezinin anahtar belirleyicisi olarak tanımlanmasına yardımcı olmuştur. Görme araştırmalarında mekanobiyolojinin kapsamını genişletmeye yardımcı olmak için, burada izole fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin sertlik ölçümleri için AFM'nin kullanımı hakkında adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Retinal Kılcal İzolasyon< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 ve mikro; m PVDF şırınga filtresi</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td>Düşük Protein Bağlayıcı Durapore</td></tr><tr><td>10X Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Serum Kalsiyum % magnezyum içermez</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td>Nihai konsantrasyon 1X, pH 7.4</td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>Falcon Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpü</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>Rnaz-Dnaz içermez, Pirojenik Olmayan</td></tr><tr><td>20 mL Luer-Lok TIP şırınga</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 inç Tek Kullanımlık Borosilikat Cam / Steril Olmayan Pastör pipeti</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Doku Kültürü Kabı</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Kalem</td><td>Bilimsel Cihaz Laboratuvarı</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Bıçak tutucu</td><td>X-ACTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbon Çelik Cerrahi Bıçak # 10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>Dental Balmumu</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalin çözeltisi, nötr tamponlu, %10</td> <td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>Nihai konsantrasyon %5 (h/h)</td></tr><tr><td>Kimwipes - silecek mendili</td><td>Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Mikro spatula</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Ekonomi #7 Paslanmaz Çelik 115mm&nbsp; Cımbız</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>Faz kontrast mikroskobu</td><td>Nikon TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arıtıcı Mantık+ Sınıf II, Tip A2 Biyogüvenlik Kabini</td><td>Labconco</td><td>302380001</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>AmScope</td><td>SM-3 Serisi Zoom Trinoküler Stereomikroskop 3.5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus mikroskopi slaytı - Beyaz sekme - Ön temizlenmiş - 25x75x1.0 mm</td><td>FisherBrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tris Tamponu, 0.1M çözelti, pH 7.4 -</td><td>Tripsin çözeltisi için</td>Biyoteknoloji Sınıfı <td>VWR</td><td>E553-500ML</td> pH 8</tr><tr><td>Tripsin 1:250 toz Doku Kültürü Sınıf</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>%10 (a/h) tripsin çözeltisi</td></tr><tr><td>Su Moleküler Biyoloji Sınıf</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Subendotelyal Matris< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve magnezyum ile 1X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen IV antikor</td><td>Novus Biyolojikler</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Floromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller (12mm)</td><td>Fisher</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>Elektron mikroskobu Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>İnsan retinal endotel hücreleri (HREC)</td><td>Cell Systems Corp</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>MCDB131 orta</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fare retinal endotel hücreleri (mREC)</td><td>Cell Biologics</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>AFM Ölçümü< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ve mikro; m Prob</td><td>Bruker</td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>1 mikron uç yarıçaplı 19 mikron boyunda yarım küre prob, Yay sabiti 0.25N/m</td></tr><tr><td>70 nm LC probu</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>70nm uç yarıçaplı 19 mikron boyunda yarım küre prob, &nbsp; Yay sabiti 0.1N/m</td></tr><tr><td>&nbsp; kamera</td><td>XCAM ailesi</td><td>Toupcam</td><td>1080P HDMI</td></tr><tr><td>Masaüstü kamerayı çalıştırmak için</td><td></td><td>Asus Asus masaüstü</td><td>Intel i5-6600 CPU, 8GB RAM</td></tr><tr><td>Lamel için çanak tutucu</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>29mm cam alt tabak ile &nbsp; 14 mm mikro kuyu</td></tr><tr><td>Nanowizard 4</td><td>Bruker</td><td>Nanowizard 4</td><td>Yumuşak biyolojik numunelerin mekanoyapısal özelliklerinin (sertlik ve topografya) hassas ölçümü için optik mikroskop üzerine monte edilmiş Bioscience atomik kuvvet mikroskobu</td></tr><tr><td>Faz kontrast mikroskopu</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>10X objektifli ters mikroskop</td></tr></tbody></table>

atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sertlik Ölçümü için fare retina kılcal damarlarının ve subendotelyal matriksin İzolasyonu

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

Retinal kılcal dejenerasyon, diyabetik retinopatinin (DR) erken evrelerinin klinik bir özelliğidir. Son çalışmalarımız, diyabetin neden olduğu retina kılcal damar sertleşmesinin, retina kılcal damarlarının inflamasyon aracılı dejenerasyonunda çok önemli ve daha önce tanınmayan nedensel bir rol oynadığını ortaya koymuştur. Retina kılcal sertliğindeki artış, subendotel matrisini çapraz bağlayan ve sertleştiren bir enzim olan lizil oksidazın aşırı ekspresyonundan kaynaklanır. Erken evrede DR ile mücadelenin DR ilerlemesini ve buna bağlı görme kaybını önlemesi veya yavaşlatması beklendiğinden, subendotelyal matriks ve kapiller sertlik, erken DR yönetimi için ilgili ve yeni terapötik hedefleri temsil eder. Ayrıca, retina kılcal damar sertliğinin doğrudan ölçümü, hayvan ve insan deneklerde retina kılcal damar sertliğinin non-invaziv değerlendirmesi için yeni görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi için çok önemli bir klinik öncesi doğrulama adımı olarak hizmet edebilir. Bu görüşü göz önünde bulundurarak, burada atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin izolasyonu ve sertlik ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Fare retina kılcal damarları İzole retina kılcal damarlarının AFM sertlik ölçümü, mekanoyapısal bütünlüklerine potansiyel olarak zarar verebilecek numune işleme adımlarını içerir. Bunu önlemek ve böylece AFM ölçümlerinin fizibilitesini, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için, enükleasyonlu gözler, damar izolasyonundan önce gece boyunca 4 °C'de% 5 formalin içinde sabitlenir. Düşük formalin konsantrasyonu, düşük fiksasyon sıcaklığı, sınırlı fiksasyon süresi ve kornea ponksiyonu eksikliği olan bu hafif fiksasyon protokolü, kimyasal fiksasyonun neden olduğu olası çapraz bağlanma / sertleşme artefaktlarını en aza indirmek için geliştirilmiştir. Şekil 2B,C'de gösterildiği gibi, bu nispeten hafif fiksasyon, izole retina vaskülatürünün yapısal olarak sağlam ve AFM ölçümü için yeterince dayanıklı olmasını sağlar. Buna karşılık, sabitlenmemiş gözlerden (hipotonik yöntem kullanılarak)4 veya kısa süreli sabit gözlerden (8 saat boyunca) izole edilen retina damarları parçalanır veya çöker, bu da onları AFM ölçümü için uygun hale getirmez (Şekil 2B).
Retinal subendotelyal matriks Vasküler sertlik, vasküler hücrelerin ve bazal membranın (subendotelyal matris) birleşik sertliğini yansıtır4. Hücreler kendi sertliklerinde benzer bir değişiklik geçirerek matriks sertliğine adapte olduklarından, mekanik karşılıklılık9, subendotelyal matriks sertliği olarak adlandırılan bir süreç, genel vasküler sertliğin önemli bir belirleyicisi haline gelir. Matriks rijitliği ölçümü için homojen yoğunlukta bir subendotelyal matriks elde etmek önemlidir. Askorbik asit takviyeli kültür ortamında yetiştirilen insan retinal EC'leri için bu genellikle 10-15 gün sürer (Şekil 3A)4,5,6. Kültür periyodundaki bu farklılık, ticari olarak temin edilebilen primer retinal EC'lerdeki partiden partiye farklılıklardan kaynaklanabilir. Ayrıca, genellikle C57BL/6 farelerinden ticari olarak temin edilebilen retinal EC'lerin, birincil insan retinal EC kültürü ile karşılaştırıldığında daha yoğun bir matris biriktirdiğini ve böylece türe özgü farklılıkları gösterdiğini bulduk. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, faz kontrast görüntüleri matrisin yalnızca makro ölçekte brüt bir görünümünü sağlar. Bununla birlikte, daha ince nano-mikro ölçekli fibriler yapı, matris yapısal proteinleri kollajen IV ve fibronektine karşı antikorlarla immün olarak işaretlenmiş matrisin yüksek çözünürlüklü konfokal floresan görüntülerinde belirginleşir (Şekil 3B). Bu matris proteinlerinin ayrıca spesifik integrin reseptörlerine9 bağlanarak endotel hücrelerine öğretici ipuçları sağladığına dikkat edilmelidir.
AFM sertlik ölçümü Güvenilir ve hassas ölçümler için uygun konsol sertliğinin (yay sabiti, k) ve prob boyutunun seçilmesi çok önemlidir. Bu parametreler, biyolojik numunenin sertliğine ve boyutlarına uyacak şekilde seçilmelidir. Seçilen konsol AFM'ye monte edildikten sonra, kızılötesi lazer ışını konsolun ucuna odaklanmalı ve yansıyan lazer noktası fotodetektör üzerinde ortalanmalıdır. Bu lazer hizalama, konsol sapmasının hassas ve hassas bir şekilde algılanmasını ve sonuç olarak sertlik ölçümünü sağlar. Bir AFM sertlik ölçümü, z-piezo'nun konsolu numuneye doğru dikey olarak aşağı hareket ettirmesiyle başlar. Şu anda konsol sapması yoktur, bu da yaklaşma eğrisinin düz bir taban çizgisini oluşturur (Şekil 4A). Konsol probu numuneye temas edip girinti yaptığında, konsol bükülür ve fotodetektör üzerinde lazer sapmasına neden olur, bu da yaklaşma eğrisinin dikey sapması ile gösterilir. Numune üzerine önceden ayarlanmış bir girinti kuvveti (ayar noktası kuvveti) uygulandıktan sonra, konsol numuneden uzaktaki başlangıç konumuna (Z hedef yüksekliği) geri çekilir. Saptırılmış geri çekme eğrisi daha sonra numunenin Young modülünü (sertliği) hesaplamak için Hertz/Sneddon modeline takılır.
Şekil 4'te gösterilen temsili kuvvet girinti ölçümünden, diyabetik bir fareden (Şekil 4B) izole edilen bir retinal kılcal damardan elde edilen yaklaşma ve geri çekilme eğrilerinin, diyabetik olmayan bir fareden (Şekil 4A) elde edilenlerden önemli ölçüde daha dik olduğu açıktır. Kuvvet girinti eğrilerinin daha dik eğimi, kuvvet girintisine karşı daha yüksek numune direncinin neden olduğu daha büyük konsol sapmasını gösterir, bu da daha yüksek numune sertliğiniyansıtır 13. Gerçekten de, çoklu kuvvet girinti eğrilerinin müteakip veri analizi, fare retina kılcal damarlarının diyabette önemli ölçüde daha sert hale geldiğini ortaya koymuştur4. Ayrıca, konsol probu ile biyolojik numuneler arasındaki temasın, geri çekme eğrisinin taban çizgisinin ötesine uzatılmasından görüldüğü gibi, geri çekme sırasında negatif konsol sapmasına yol açan spesifik olmayan yüzey yapışmasına neden olduğu da belirtilmelidir (Şekil 4B). Ayrıca, hücreler, matris ve kan damarları gibi biyolojik numuneler doğası gereği viskoelastiktir ve bu nedenle kuvvet girintisini takiben bazı kalıcı deformasyona ve/veya görünür sertlikte değişikliğe uğrayabilir. Eğer öyleyse, bu yaklaşma ve geri çekilme eğrilerinin yanlış hizalanmasına (histerezis) yansıyacaktır. Gerçekten de, Şekil 4A ve Şekil 4B'nin karşılaştırılması, diyabetik olmayan farelerde daha yumuşak kılcal damarların kuvvet girintisinin, daha sert muadillerinde görülenden daha fazla histerezis ürettiği beklenen eğilimi doğrulamaktadır. Daha önce 5,6 bildirildiği gibi, retinal EC kültürlerinden elde edilen subendotelyal matrislerin sertliği (Young modülü) de yukarıda belirtilen şekilde hesaplanır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig01.jpg"> Şekil 1: Retina izolasyonu için bir fare gözü üzerinde yapılan kesi kesiminin şematik gösterimi. Optik siniri tutmak için cımbız kullanılarak, fare retinasını lensten ve ön kamaradan ayırmak için limbusun arkasında tam bir kesi yapmak için bir neşter kullanılır. Mor kesikli çizgi, dikey insizyonun yerini gösterir. Bu şema, bilimsel bir görüntü ve illüstrasyon yazılımı kullanılarak çizilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig02.jpg"> Şekil 2: AFM ölçümü için sağlam fare retina damarlarının izolasyonu için protokol optimizasyonu. (A) Stereoskop görüntüsü, kılcal izolasyon adımlarından önce hafifçe sabitlenmiş bir fare gözünden izole edilmiş sağlam bir retinayı göstermektedir. Ölçek çubuğu: 2 mm. (B) 4x büyütmede temsili faz kontrast görüntüleri, farklı izolasyon yöntemleri kullanılarak elde edilen fare retina damarlarını gösterir. İzole edilen damarların yapısal bütünlüğü ve dayanıklılığı karşılaştırıldığında, 4 ° C'de 24 saat boyunca% 5 formalin içinde sabitlenmiş enükleasyonlu gözlerden retinaların tripsin sindiriminin AFM sertliği ölçümü için en uygun retina vaskülatürünü verdiği bulundu. Bu yöntem kullanılarak izole edilen retina damarları, cam yüzey boyunca düzgün bir şekilde yayılan berrak bir vasküler ağ sergiledi. Ölçek çubuğu: 500 μm. (C) (B)'de gösterilene benzer şekilde, sağlam bir retina kılcal damar ağının yüksek büyütmeli (20x) görünümü, hafif sabit gözlerden elde edilen kılcal damarların yüksek yapısal bütünlüğünü doğrular. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakam4'ten değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig03.jpg"> Şekil 3: Birincil insan ve fare REC kültürlerinden elde edilen hücreden arındırılmış matrisler. (A) İnsan veya fare REC'lerinin 10 günlük (10 gün) veya 15 günlük (15 gün) kültürlerinin hücreden arındırılmasını takiben cam lameller üzerinde subendotelyal matris agregalarını gösteren 20x büyütmeli temsili faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 μm. (B) 15 günlük insan REC kültürlerinden elde edilen ve anti-kollajen IV ve anti-fibronektin antikorları ile etiketlenmiş hücreden arındırılmış matrislerin temsili yüksek büyütmeli (100x) konfokal floresan görüntüleri, yoğun bir nanofibriller kollajen IV ortaya koymaktadır ve fibronektin matrisi. Ölçek çubuğu: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig04.jpg"> Şekil 4: Fare retina kılcal damarlarının AFM sertlik ölçümünden kuvvet mesafesi eğrileri. Çizgi grafikler, (A) diyabetik olmayan veya (B) diyabetik bir fareden izole edilen bir fare retinal kılcal damarının bir yerinde tek bir kuvvet girinti ölçümünden temsili bir yaklaşım (açık renk) ve geri çekme (koyu renk) eğrisini gösterir. Bir SAA-SPH 1 μm yarıçaplı yarım küre konsol probu kullanılarak elde edilen kuvvet eğrileri, konsol-numune mesafesi (z-piezo tarafından kontrol edilir) ile konsol sapmasına neden olan uygulanan dikey kuvvet arasındaki ilişkiyi çizer. (A) Sarı ok, numuneye doğru z-piezo tahrikli konsol yaklaşımını, beyaz ok, konsol probunun numune ile temas ettiği temas noktasını ve yeşil ok, bir ayar noktası (tepe) girinti kuvvetine (*) kadar konsol sapmasını gösterir. (B) Diyabetik farelerden izole edilen bir retinal kılcal damardan elde edilen hem yaklaşım hem de geri çekilme eğrileri, diyabetik olmayan muadillerinden (A'da gösterilmiştir) belirgin şekilde daha dik bir eğim sergiler, bu da diyabetik farelerde daha yüksek kılcal sertliği gösterir. Ok ucu, taban çizgisinin altındaki geri çekme eğrisinde bir düşüşü gösterir ve bu, girinti sırasında prob ile numune arasındaki yapışmanın neden olduğu konsol probunun negatif sapmasını yansıtır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Yakın zamanda retina kapiller sertleşmesini diyabetle ilişkili retina disfonksiyonu için yeni bir paradigma olarak tanımladık. Bu protokol, fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin retinal endotel kültürlerinden izolasyon adımlarını detaylandırır ve ardından atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sertlik ölçüm tekniğinin bir açıklaması yapılır.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Sertlik Ölçümü için Fare Retina Kılcal Damarlarının ve Subendotelyal Matriksin İzolasyonu

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that ...

isolation-mouse-retinal-capillaries-subendothelial-matrix-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ekstraselüler matriksin sertliği kuvvetle yapışık hücrelerinin birden fazla davranışları etkiler. Matrix sertliği bir doku boyunca mekansal değişir ve çeşitli hastalık koşullarında değişiklik uğrar. Burada atomik kuvvet mikroskobu microindentation kullanarak fare akciğer dokusunun normal ve fibrotik sertliği mekansal farklılıklar karakterize etmek için yöntemler geliştirmek.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Aortların fareden izolasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak elastik modüllerinin ölçümü için ayrıntılı protokoller sunuyoruz.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Biz atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak eklem kıkırdağı hücresel düzeyde erken osteoartritik değişiklikleri araştırmak için bir yöntem saklıt.

Erken Osteoartrit tespit etmek için Atomik Kuvvet Mikroskobu Uygulaması

Normal ve hastalıklı karaciğerde kollajen bakımından zengin alanların elastik modüllerini atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Polarizasyon mikroskobunun eşzamanlı kullanımı, karaciğer bölümlerinde kollajen bakımından zengin alanların lokalizasyonu için yüksek mekansal hassasiyet sağlar.

Polarizasyon Mikroskobu ile Birleştirilmiş Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karaciğer Sertliğinin Ölçülmesi

Bu kağıt kültürü canlı hücreleri mekanik uyarılması için entegre bir atom operasyon okuyucu kuvvet optik görüntüleme mikroskop öğretmeyi hedefliyor. Bir adım-adım protokol sunulmuştur. Mekanik stimülasyonu canlı hücre yanıtı gösteren bir temsilci veri seti sunulmaktadır.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

Hücresel fonksiyonları katmanlarından sertlik etkisi modellenmiş...

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Bu video, siliyer epitelden fare gözün retina kök hücreleri izole kültür ve klonal retina küreler oluşturacak şekilde büyümeye nasıl göstereceğiz. Izole edilmiş kök hücre küre kardinal özelliklere sahip: kendini yenileme ve multipotentiality.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

Keşfedin fare retina kılcal damarlarının ve subendotelyal matriksin izolasyonunu, atomik kuvvet mikroskobu ile sertlik ölçümü için. Bu yöntem diyabetik retinopatide mekanik değişiklikleri anlamaya yardımcı olur.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Sertlik Ölçümü için Fare Retina Kılcal Damarlarının ve Subendotelyal Matriksin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet