Name: Tardigrad Hypsibius exemplariste qRT-PCR ile Bağıl Transkript Seviyelerinin Karşılaştırılması için Tek Hayvanlı, Tek Tüplü RNA Ekstraksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Keşfedin, Hypsibius exemplaris tardigradında tek hayvanlı RNA ekstraksiyonu ile qRT-PCR için hızlı ve verimli bir yöntem. Bu protokol, transkript seviyelerini düşük maliyetle analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66935/66935fig01.jpg"> 
Şekil 1: Tek bir tardigraddan RNA ekstraksiyonu için tek tüplü boru hattı. (A) Altı donma-çözülme döngüsü ve müteakip cDNA sentezi dahil olmak üzere tek bir tardigraddan RNA ekstraksiyonu protokolünü gösteren şema. Örnekler daha sonra RT-PCR ve qRT-PCR için kullanılabilir. (B) Suyun uzaklaştırılması için kullanılan mikropipet konikliğinin görüntüsü. Ölçek çubuğu: 2 mm. (C) Küçük bir su hacmindeki bir tardigradın parlak alan görüntüsü (noktalı çizgi). Başarılı bir ekstraksiyon için çoğu suyun gösterilen ölçüde uzaklaştırılması gerekir ve lizis tamponunun seyreltilmesini önler. Ölçek çubuğu: 50 μm. (D) Numuneleri güvenli bir şekilde hızlı bir şekilde dondurmak-çözmek için uzun forseps kullanarak numunelerin sıvı nitrojene daldırılmasını gösteren resim. İçeriğin bir kısmı BioRender'da oluşturuldu. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66935/66935fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
NOT: Şekil 1A, prosedürün bir şemasını göstermektedir. Ayrıntılı tardigrad ve alg kültürleme prosedürleri için daha önce yayınlanmışraporlara bakın 45,46,47.
1. Kaynak suyunun sterilizasyonu
<ol>
	<li>5 galonluk bir su sürahisinden 2 L kaynak suyunu (Ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın) 2 L'lik otoklava dayanıklı bir cam şişeye dökün.</li>
	<li>Kapağı otoklava dayanıklı şişeye yerleştirin ve az miktarda otoklav bandı ile kapatın. Şişeyi sıkmayın; Kapağı üstüne yerleştirin.</li>
	<li>Kaynak suyunu, kurutma adımı olmadan ıslak bir döngüde 50 dakika boyunca otoklavlayın.</li>
	<li>Suyun oda sıcaklığına (RT) gelmesine izin verin ve RT'de saklamadan önce kapağı sıkıca kapatın.</li>
</ol>
2. Cam mikropipet çekme (pipet çektirme ile)
<ol>
	<li>Bir cam mikropipeti (OD: 1 mm, ID: 0.58 mm, Uzunluk: 10 cm) bir mikropipet çekiciye sabitleyin. Pipet şeklini değiştireceği ve filamente zarar vereceği için ısıtma filamenti ile temastan kaçının.<ol>
		<li>Her filament ve pipet çektirmesi için pipetin çekilme miktarını ampirik olarak belirleyin. Bununla birlikte, optimizasyon için bir başlangıç noktası olarak hizmet etmek için 78 °C ve 182,2 g çekme ağırlığına sahip tek bir çekme adımı kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cam mikropipeti keskin uçlu iki cam mikropipete ayırmak için filamentin ısınmasına ve yerçekimine izin verin (Şekil 1B).</li>
	<li>Bu çekilmiş cam mikropipetleri, yerinde tutmak ve keskin uçların kırılmasını önlemek için balmumu veya kil içeren 100 mm'lik kapalı bir Petri kabında saklayın.</li>
</ol>
3. Cam mikropipet çekme (pipet çektirme olmadan)
<ol>
	<li>Düşük ayarda bir Bunsen brülörü veya başka bir kontrollü alev kaynağını yakın.</li>
	<li>Her iki elinizde bir ucu olan bir cam mikropipet alın.</li>
	<li>Cam erimeye başlayana kadar cam mikropipetin ortasını alevin üzerinde tutun. Ardından, iki ucu hızla ayırın. Bu, çok hassas iki keskin uç oluşturacaktır.</li>
	<li>Ucu bir çift steril ince forseps ile hafifçe kırın.</li>
	<li>Bu çekilmiş cam mikropipetleri, yerinde tutmak ve keskin uçların kırılmasını önlemek için balmumu veya kil içeren 100 mm'lik kapalı bir Petri kabında saklayın.</li>
</ol>
4. RNA ekstraksiyonu
<ol>
	<li>Kriyo güvenli bir kapta 0,5 L sıvı nitrojen elde edin. DİKKAT: Sıvı nitrojen kriyojeniktir ve cilde veya gözlere maruz kaldığında yanıklara neden olabilir. Tutarken koruyucu giysi, su sıçratan gözlük, nitril eldiven, kriyo eldiven, laboratuvar önlüğü ve kapalı burunlu ayakkabılar kullanın. Sıvıyı taşımadan önce kabın sıvı nitrojen için güvenli olduğundan emin olun. Bu adım için etanol-kuru buz banyosu kullanmak da mümkün olabilir.</li>
	<li>cDNA sentezi ana karışımı yapın: 1 μL rastgele heksamer primer, 2 μL DNaz, 4 μL 5x RT Tamponu, 1 μL Enzim Karışımı, 1 μL H2Ove 1 μL 10 mM dNTP içeren 10 μL'lik bir çözelti. Bu çözeltiyi buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>Tardigrad lizis tamponu hazırlayın (5 mM Tris (pH = 8)% 0.5 (h / v) Deterjan 1,% 0.5 (h / v) Deterjan 2, steril nükleaz içermeyen Suda% 0.25 mM EDTA). NOT: Bu solüsyon 6 ay boyunca tezgah üstünde saklanabilir. Bununla birlikte, steriliteyi koruyun ve potansiyel RNAse kirletici kaynaklardan kaçının.</li>
	<li>Ekstraksiyonlar için yeterli lizis tamponu (2 μL / tardigrad).</li>
	<li>Tardigrad lizis tampon çözeltisine RNAse inhibitörü 4 U / μL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.</li>
	<li>Çözeltiyi buz üzerinde saklamadan önce 5 saniye boyunca 2000 x g hızında bir tezgah üstü santrifüjde çözeltiyi RT'de vorteksleyin ve döndürün.</li>
	<li>Steril filtre uçlu bir P1000 pipet kullanarak deney için gerektiği kadar tardigradı kültürden çıkarın ve bunları 35 mm'lik steril bir Petri kabına yerleştirin. NOT: Herhangi bir sayıda tardigrad bu şekilde işlenebilir. Genellikle, ekstraksiyon için koşul başına üç tardigrad işlenir.</li>
	<li>Tardigradları 1 mL otoklavlanmış steril kaynak suyu ve steril filtre uçlu P1000 pipet kullanarak üç kez yıkayın. Bunları yavaşça yukarı ve aşağı pipetlemek, alg kirleticilerinin giderilmesine yardımcı olur.</li>
	<li>25x ila 50x büyütmede bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, steril filtre uçlu bir P10 pipeti kullanarak bu yıkanmış kültürden tek bir tardigradı yeni bir steril 35 mm Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Tek tardigradı 100 μL steril nükleaz içermeyen suda yıkamak için steril filtre uçlu bir P200 pipet kullanın. NOT: Bu yıkama adımı, ribonükleazlar da dahil olmak üzere kirleticileri daha fazla uzaklaştırmak için kullanılır.</li>
	<li>Yıkanmış tardigradı, steril filtre uçlu bir P10 pipeti kullanarak 1-2 μL steril nükleaz içermeyen su içinde temiz, steril bir PCR tüpünün dibine aktarın ve tardigradın ucun kenarına yapışmadığından emin olun.</li>
	<li>Tardigradı 25x büyütmede diseksiyon mikroskobu altında görselleştirin.</li>
	<li>Suyun suyun uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için, çekilen cam mikropipetin ucunu tüpün dışına hafifçe kırın. Deliğin suyu çekecek kadar büyük olduğundan, ancak tardigradı çekmeyecek kadar büyük olduğundan emin olun.</li>
	<li>Çekilmiş bir cam mikropipetin kılcal hareketini kullanarak, hayvan yaklaşık iki tardigrad uzunluğu çapında küçük bir su kabarcığı ile çevrili olana kadar suyu çıkarın.</li>
	<li>Su seviyesinin uygun olduğundan ve tardigradın sulu kaldığından emin olmak için diseksiyon kapsamı aracılığıyla su giderme işlemini izleyin. NOT: Şekil 1C , ne kadar suyun çıkarılması gerektiğine dair bir örnek sunar. Bu kritik bir adımdır. Kurumasını önlemek için tardigradı küçük bir su kabarcığı çevreleyecektir, ancak lizis tamponunun seyreltilmesini önlemek için mümkün olduğunca fazla su çıkarılmalıdır. Kalan su seviyelerinin bir örneği için lütfen Şekil 1C'ye bakın.</li>
	<li>Suyu çıkardıktan hemen sonra, tüpün dibine 2 μL tardigrad lizis tamponu ekleyin, kısaca girdap yapın ve tüpü bir masa üstü santrifüj üzerinde 2000 x g'da 5 saniye boyunca RT'de santrifüjleyin.</li>
	<li>Tardigradları içeren numuneleri hemen bir PCR tüp rafına yerleştirin ve raf tarafından sıkıca tutulduğundan emin olun.</li>
	<li>Bir çift uzun kaba forseps kullanarak rafı kavrayın ve numuneleri içeren rafı tamamen donana kadar sıvı nitrojene hafifçe batırın (Şekil 1D).</li>
	<li>Rafı sıvı nitrojenden çıkarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Numunenin çözülmesine izin verin (~ 45 s ila 1 dakika sürer). Numuneyi her 15 saniyede bir buzdan çıkararak ve gözle görülür şekilde inceleyerek izleyin. Örnek gözle görülür şekilde şeffaf hale geldikten sonra bir sonraki adıma geçin.</li>
	<li>4.18-4.19 adımlarını beş kez daha tekrarlayın. Maksimum lizis ve ekstraksiyon için toplam altı donma-çözülme döngüsü gereklidir (Şekil 2A,B).</li>
	<li>Donma-çözülme tamamlandığında, numuneleri buzun üzerine yerleştirin ve hemen bir sonraki adıma geçin. Numuneleri bu noktada depolama için dondurmayın, çünkü bu, cDNA hazırlığı için mevcut RNA'yı azaltacaktır.</li>
</ol>
5. cDNA sentezi
<ol>
	<li>Tardigrad lizat içeren PCR tüpüne 2 μL cDNA sentezi ana karışımı ekleyin. Tüpü kısa bir süre hafifçe vurun ve numuneleri buz üzerinde değiştirmeden önce bir masa üstü santrifüj ile 5 saniye boyunca 2000 x g'da RT'de döndürün.</li>
	<li>Numuneleri bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve 25 ° C'de 10 dakika boyunca tavlama primerlerine, ters transkripsiyon gerçekleştirmek için 55 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve son olarak enzimleri 85 ° C'de 5 dakika boyunca ısıyla inaktive edin.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, tüpü hemen buzun üzerine yerleştirin ve 21 μL steril nükleaz içermeyen su ekleyerek numuneyi toplam 25 μL hacme seyreltin. Düşük kopya sayılı transkriptler için, bu seyreltme adımını ampirik olarak belirlendiği şekilde değiştirin.</li>
</ol>
6. qPCR (Kısmi Çözünürlük)
<ol>
	<li>Daha büyük miktarlarda tardigraddan hazırlanan toplam RNA'yı kullanarak astar setinin tavlama sıcaklığını belirleyin, örneğin, Boothby, 201843'te sunulan toplu ekstraksiyon yöntemi.</li>
	<li>qRT-PCR'yi çalıştırmadan önce optimum tavlama sıcaklığını belirlemek için bir PCR sıcaklık gradyanı çalıştırın (bu protokolde kullanılan tüm PCR ayarları için Tablo 1 ve Tablo 2'ye bakın).</li>
	<li>Bir tüp indikatör boya süper karışımını buz üzerinde çözdürün ve ışıktan izole edin. Buz üzerine 96 oyuklu bir qPCR plakası yerleştirin ve istenen kuyucuk sayısına 5 μL süper karışım, 2 μL su, her bir primerden 1 μL (10 μM) ve 1 μL cDNA ürünü yerleştirin.</li>
	<li>PCR plakasını plaka contası ile kapatın ve astar seti için uygun bir tavlama sıcaklığı kullanarak qRT-PCR'yi çalıştırın (bu belgede kullanılan tüm qRT-PCR ayarları için Tablo 3'e bakın).</li>
</ol>
7. Nicelik belirleme ve sonuçların yorumlanması
<ol>
	<li>Sonuçları kantitatif olarak, ifadesinin empoze edilen koşullar boyunca sabit olması beklenen bir veya daha fazla kontrol temizlik geni ile karşılaştırın. Bu çalışma için aktin geni kullanıldı.</li>
	<li>Her kuyucuk için Ct değerlerini veya döngü eşiğini elde edin ve kontrol temizlik gen reaksiyonlarının Ct değerleriyle karşılaştırın. Aşağıdaki denklemi kullanarak gen ifadesindeki kıvrım değişimini hesaplayın: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq01.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq02.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq03.jpg" style="margin: auto;"> NOT: Fold gen ekspresyonu her transkript ve tardigrad için 2- (ΔΔCt)48 olarak çizilir.</li>
	<li>Ct değerinden transkript numarasının kabaca bir tahminini elde etmek için aşağıdaki denklemi kullanın: 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq04.jpg" style="margin: auto;"> N, transkript sayısıdır ve 2, varsayılan PCR verimliliği veya PCR48 döngüsü başına floresanstaki kat artışıdır.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Bireysel tardigradlarda qRT-PCR için optimize edilmiş RNA ekstraksiyonu

<table><tbody><tr><td>10 ve mikro; l Premium Bariyer Uçları Düşük Bağlayıcı, Raflı, Steril</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401</td><td>Steril Filtre Uçlu P 10 Pipet olarak anılır& İpuçları</td></tr><tr><td>1000 ve mikro; L&nbsp; Birinci Sınıf Pipet Uçları, Düşük Bağlayıcı, Raflı, Steril</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-165RS</td><td>Steril Filtre Uçlu P 1000 Pipet olarak adlandırılır& İpuçları</td></tr><tr><td>200 ve mikro; L&nbsp; Premium Bariyer Uçları Düşük Bağlayıcı, Raflı, Steril</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-412</td><td>Steril Filtre Uçlu P 200 Pipet olarak anılır&nbsp; İpuçları</td></tr><tr><td>4 Yıldız Düz Güçlü Orta Nokta Cımbız&nbsp;</td><td>Excelta&nbsp;</td><td>00-SA-DC</td><td>Uzun forseps</td></tr><tr><td>96 Kuyulu PCR Rafı, Çeşitli Kapaklı, 5 Raf/Birim</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-202A</td> olarak <td>anılır PCR Rafı</td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp; 3M KURŞUNSUZ OTOKLAV BANDI 1 "</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC0802040</td><td>Otoklav Bandı olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Otoklav Bandı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td>PCR Plaka Contaları olarak anılır</td></tr><tr><td>Benchling v8</td><td>Benchling</td><td>N/A</td><td>Benchling olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>BioRadHard-Shell 96 Kuyulu PCR Plakası</td><td>BioRad&nbsp;</td><td>HSS9641</td><td>PCR Plakası olarak adlandırılır&nbsp;</td></tr><tr><td>BULWARK FR Laboratuvar Önlüğü:&nbsp;</td><td>Tahılcı&nbsp;</td><td>26CF64</td><td>Laboratuvar Önlüğü</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad Thermocycler olarak anılır&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td>Thermocycler olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>CFX Optik Modüllü C1000 Touch Bio-rad Termodöngüleyici&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1845097</td><td>qPCR thermocycler olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroccoccum hypnosporum.&nbsp; &nbsp;</td><td>Carolina</td><td>152091</td><td>Alg</td></tr><tr><td>Corning olarak anılır&nbsp; PYREX Yeniden Kullanılabilir Medya Saklama Şişeleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1E</td><td>2 L Otoklav Güvenli Cam</td></tr><tr><td>Şişe Daigger & Şirket Vortex-Genie 2 Laboratuvar Mikseri&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>3030A</td><td>Vortexer olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Direct-zol Mikro Hazırlık&nbsp;</td><td>Zymo Araştırma&nbsp;</td><td>R2060</td><td>RNA ekstraksiyon kiti olarak adlandırılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont 5 Biyoloji Cımbız</td><td>Güzel Bilim Aletleri&nbsp;</td><td>11254-20</td><td>İnce forseps</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>S311-500&nbsp;</td><td>EDTA&nbsp olarak anılır;</td></tr><tr><td>FIJI v 2.14.0/1.54f&nbsp;</td><td>ImageJ,N</td><td>/A</td> pippette Çektirme için <td>FIJI/ImageJ Filament olarak anılır</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>PC-10H</td><td>Filament</td></tr><tr><td>Fisherbrand Ekonomi Darbe Gözlüğü</td> olarak anılır <td>Fisher Scientific</td><td>19-181-501</td><td>Sıçrama gözlüğü olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam Mikropipet OD 1mm ID 0.58, Uzunluk 10 cm</td><td>TriTech Research</td><td>GD-1&nbsp;</td><td>Cam mikropipet olarak adlandırılır</td></tr><tr><td>Hypsibius exemplaris Z151 Suşu&nbsp;</td><td>Carolina</td><td>133960</td><td>Tardigrades&nbsp; veya H. exemplaris&nbsp; olarak anılır;</td></tr><tr><td>Sıvı Azot Dewar 1 L</td><td>Agar Scientific&nbsp;</td><td>AGB7475</td><td>Kriyo-güvenli kap olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Maxima H Eksi İlk İplikli cDNA Sentez Kiti&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1651</td><td>cDNA Sentezi Ana Karışımı olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Narishige Çift Kademeli Cam Mikropipet Çektirme&nbsp;</td><td>Tritech Araştırma</td><td>&nbsp; PC-10</td><td>Mikropipet çektirme olarak adlandırılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Nitril Eldivenler</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-000-314</td><td>Nitril Eldiven olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>PETRI KABI, PS, 35/10 mm, HAVALANDIRMALI</td><td>Grenier</td><td>627102</td><td>35 mm Petri kabı olarak adlandırılır&nbsp;</td></tr><tr><td>PIPETMAN P10, 1&ndash; 10 ve mikro; L, metal ejektör</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td>P 10 pipet</td></tr><tr><td>PIPETMAN P1000, 100&ndash olarak anılır; 1000 ve mikro; L, Metal ejektör</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td>P 1000</td></tr><tr><td>Pipetman P200, 20&ndash olarak anılır; 200 ve mikro; L, Metal İtici</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F144058M</td><td>P 200 Pipet Pound olarak adlandırılan</td></tr><tr><td>bu 4 renkli modelleme kili&nbsp;</td><td>Amerikan Bilim Fazlası</td><td>&nbsp; 96517P001</td><td>Clay&nbsp olarak anılır;</td></tr><tr><td>Prizma v10.0&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>N/A Bir Prizmaya</td><td>Atıfta Bulundu&nbsp;</td></tr><tr><td>RNAse-İçermeyen, 8 Şerit 0.2 mL PCR Tüpleri, kapaklı&nbsp;</td><td></td><td>Steril PCR Tüpü</td>RNasin Ribonükleaz İnhibitörü Promega olarak adlandırılan <td>invitrojen</td> AM12230</tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td>N2111</td><td>RNAse inhibitörü olarak adlandırılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaynak suyu&nbsp;</td><td>Nestlé Pure Life</td><td>44221229</td><td>Kaynak Suyu Olarak Adlandırılır</td></tr><tr><td>SSOAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO RAD</td><td>1725271</td><td>İndikatör Boya Süper Karışım olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Optik ve aydınlatmalı Stereo-Mikroskop Sistemi&nbsp;</td><td>Diseksiyon Mikroskobu</td>Supertek Scientific olarak adlandırılan <td>TriTech Research</td><td>SMT1</td></tr><tr><td>; Tirrill Brülörleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S09572B</td><td>Bunsen Burner&nbsp;</td></tr><tr><td>Masa Üstü Santrifüj Kalitron</td><td></td><td>&nbsp; DW-41-115-YENİ</td><td>Masa Üstü Santrifüj olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Tempshield&nbsp; Cryo-Gloves</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-305</td><td>Cryo Gloves olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Termo Bilimsel&nbsp; Nunc Petri Kapları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-099</td><td>100 mm Petri kabı olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-500&nbsp;</td><td>Tris veya Tris Base olarak anılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>93443</td><td>Deterjan 1&nbsp;</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma aldrich</td><td>P1379-500&nbsp;</td><td>Deterjan 2 olarak anılır</td></tr><tr><td>Su - PCR/RT-PCR sertifikalı, nükleaz içermeyen</td><td>Growcells</td><td>PCPW-0500</td><td>Steril Nükleaz İçermeyen Su olarak adlandırılır</td></tr></tbody></table>

tardigrad hypsibius exemplaris'te qrt-pcr ile bağıl transkript seviyelerinin karşılaştırılması için tek hayvanlı, tek tüplü rna ekstraksiyonu

Single-Animal, Single-Tube RNA Extraction for Comparison of Relative Transcript Levels via qRT-PCR in the Tardigrade Hypsibius exemplaris

Tek tardigrad RNA ekstraksiyonunun geliştirilmesi ve optimizasyonu Tardigradlarda RNA ekstraksiyonu için Ly ve ark., 201542 protokolünü uyarlayan STST sistemi, preparatın miktarını ve kalitesini en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir (Şekil 1A). RT-PCR, aktin transkriptleri için gerçekleştirildi ve ekzon 1 ve 2'yi kapsayan 527 bp'lik bir bölgeyi amplifiye ederek transkript verimini ölçtü (bu primerler için diziler Tablo 1'de</stron...

Tardigrad Hypsibius exemplaris'te qRT-PCR ile Bağıl Transkript Seviyelerinin Karşılaştırılması için Tek Hayvanlı, Tek Tüplü RNA Ekstraksiyonu

The tardigrade Hypsibius exemplaris is an emerging model organism renowned for its ability to survive environmental extremes. To explore the molecular ...

single-animal-single-tube-rna-extraction-for-comparison-relative

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila uçuş kasları, kas gelişimi ve fizyolojisi için model bir sistem olarak kullanılır. Bu video, yetişkinlerin uçuş kaslarını açıklar ve pupalardan RNA dizilimi için uygun olan dolaylı uçuş kaslarının geliştirilmesini incelemek için bir protokolü vurgular.

Drosophila Geç Pupa İndirekt Uçuş Kası (IFM) Diseksiyonu: Yüksek Verimli Doku Toplama Yöntemi

Diseksiyon yaygın doku içindeki DNA, RNA ve protein incelenmesi için kullanılmıştır. Lazer yakalama mikroskobu (LCM) en sık kullanılan yöntem, ancak, yeni bir freze tekniği, mesodissection, son zamanlarda kullanılabilir. Biz mesodissected formalin sabit parafin Mycobacterium tuberculosis granülomlarının gömülü doku slaytlar RNA çıkarma göstermektedir.

Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emAkciğer granülomlara Gömülü Formalinle Sabit Parafin dan&gt; Özel Transkript

Ribozom Afinite Saflaştırması (TRAP) çevirisi, mRNA'nın hücre tipine özgü translasyonunu yakalayabilir. Burada, Drosophila embriyolarının nadir hücre popülasyonlarında mRNA'nın izolasyonuna adanmış ilk TRAP protokolünü rapor ediyoruz.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Gerçek zamanlı PCR aracılığıyla kıyı çökeltilerinden bakteriyel 16S rRNA genlerini ve transkriptlerini ölçmek için bir protokol sağlanır. Metodoloji, DNA ve RNA'nın birlikte ekstraksiyonunu içerir; DNA'sız RNA'nın hazırlanması; ve standart eğri yapısı dahil olmak üzere RT-q-PCR yoluyla 16S rRNA geni ve transkript miktar tayini.

Gerçek zamanlı PCR ile Kıyı tortulları ve Niceleme 16S rRNA Genler ve Transkriptler eşzamanlı DNA-RNA Ekstraksiyon

Mikroskobik organizmaların genomik sıralama sırasında kontaminasyon büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. İşte, bir tardigrade tek bir örnekten genom genomik DNA tüm genom amplifikasyon olmadan bulaşma riskini en aza indirmek için olduğu kadar az 50 pg ile sıralamak için bir yöntemi göstermektedir.

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Burada, varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve yorumların kolaylaştırmak amacıyla bir protokol RNA, DNA ve protein aynı örnekten izolasyonu için mevcut.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

Bu protokol, Sipunculus nudus coelomic sıvısındaki mRNA ekspresyon düzeylerini ve hedef genlerin mekansal desenlerini saptamak için yerinde hibridizasyon yaklaşımını etkin bir şekilde tanımlar.

Sipunculus nudus Coelomic Sıvı için yerinde Hibridizasyon

Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.

Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

Bu protokol, NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü çeviri ribozomal mRNA'ları izole etmeyi amaçlamaktadır.

Hücre Tipine Özgü RNA'ları, Hücre Sıralama Olmadan Dondurulmuş Heterojen Doku Örneklerinden İzole Edin

Mevcut protokol, tortricid haşere böceklerinin laboratuvarlarda yetiştirilme yöntemini açıklamaktadır. Böceklerin cinsiyetini ayırt etme ve yüksek verimli dizileme için nükleik asitleri çıkarma prosedürleri, iki tortricid zararlısı kullanılarak oluşturulmuştur.

Tortricidae Zararlı Böceklerinde Kütle Yetiştirme ve Moleküler Çalışmalar

Keşfedin, Hypsibius exemplaris tardigradında tek hayvanlı RNA ekstraksiyonu ile qRT-PCR için hızlı ve verimli bir yöntem. Bu protokol, transkript seviyelerini düşük maliyetle analiz etmeyi sağlar.

Tardigrad Hypsibius exemplariste qRT-PCR ile Bağıl Transkript Seviyelerinin Karşılaştırılması için Tek Hayvanlı, Tek Tüplü RNA Ekstraksiyonu (Video) | JoVE Journal

Tardigrad Hypsibius exemplaris'te qRT-PCR ile Bağıl Transkript Seviyelerinin Karşılaştırılması için Tek Hayvanlı, Tek Tüplü RNA Ekstraksiyonu

Daha fazla video keşfet