İskemik İnme Sonrası Subakut ve Kronik Zamanlarda Transdüksiyonlu Hücrelerde Nörod1'in Ektopik Ekspresyonunun Araştırılması için AAV Sistemleri ve Fare Modelleri

İskemik inme için potansiyel bir tedavi olarak nörojenik transkripsiyon faktörlerinin AAV aracılı ektopik ekspresyonunu araştırıyoruz. Odak noktamız, inme sonrası subakut ve kronik fazlar sırasında GFAP eksprese eden hücrelerdeki Neurod1 ekspresyonunun transdüksiyonlu nöronları artırıp artırmadığını ve motor fonksiyon iyileştirmeleri ile ilişkili olup olmadığını görmektir. Son bulgular, korteksteki gen ekspresyonunun aynı AAV ile bölgeye göre değiştiğini göstermektedir Araştırmamız, GFAP promotörünün, medial prefrontal kortekste motor kortekse göre daha aktif olduğunu buldu, bu da transdüksiyonlu hücrelerin spesifik promotörlere farklı tepki verdiğini gösteriyor.

Bu nedenle, nörojenik transkripsiyon faktörlerini içeren tedaviler hedef beyin bölgesine göre uyarlanmalıdır. Mevcut zorluklar, ET-1'in enjeksiyon oranları ve beyin bölgeleri arasındaki transdüksiyon etkinlikleri gibi değişkenlere bağlı olarak inme lezyonu boyutundaki değişkenliği içerir. Beyin bölgeleri ve fare suşları boyunca AAV titreleri ve tropizm, inme sonrası ektopik Neurod1 ekspresyonunun hücresel değerlendirmesini etkileyerek transdüksiyon verimliliklerini etkileyebilir.

Astrositi nöronlara dönüştürmedeki ana zorluk, yeniden programlanmış nöronları önceden var olanlardan ayırt etmektir. Laboratuvarımız, yeni araçlar geliştirerek bu yeniden programlamanın in vivo olarak gerçekleştiğini doğrulamayı amaçlamaktadır. Sonuç olarak, nöronal transkripsiyon faktörünün ektopik ekspresyonunun beyin hasarı olan hayvanlarda iyileşmeyi nasıl artırdığını anlamaya çalışıyoruz.

Başlamak için, anestezi uygulanmış hayvanı odadan çıkarın ve temiz bir yüzeye yerleştirin. Farenin cerrahi bölgesini temizledikten sonra, burnunu stereotaksik burun konisine yerleştirin ve kulak çubukları kullanarak kafatasını sabitleyin. 10 numara neşter bıçağı kullanarak, gözlerin orta noktasının arkasından parietal kemiğe kadar sagital düzleme paralel dikey bir kesi yapın.

Ardından, kafatasını ortaya çıkarmak için cildi nazikçe geri çekin. Ardından, kafatasındaki fasyayı bozmak için bir Q-ucu kullanın ve bregmayı tamamen ortaya çıkarmak için kafatasının kurumasını bekleyin. Yüksek hızlı bir stereotaksik matkap kullanarak, sağ duyusal motor korteksteki koordinatlarda üç çapak deliği açın.

Ardından, matkabı 0,375 inç uzunluğunda bir iğne ile donatılmış 26 gauge bir şırınga ile değiştirin. Steril PBS içinde çözülmüş 1.5 mikrolitre 400 mikromolar endotelin-1 solüsyonunu şırıngaya yükleyin. İğnenin ucunda bir düşüş gözlemlemek için küçük bir hacimde endotelin-1 bırakın ve iyi bir akış sağlayın.

İğnenin ucunu kafatasını geçecek şekilde dura mater'ı delmeden orta çapak deliğine indirin. Hizalandıktan sonra, iğneyi beynin içine bir milimetre indirin. Hamilton şırıngasını kullanarak, bir seferde 0.1 mikrolitre dağıtın ve sonraki 0.1 mikrolitreyi enjekte etmeden önce bir dakika bekleyin.

İğnenin enjeksiyonlar arasında ve sonrasında tıkanmasını önlemek için, iğne ucunda bir damla görünene kadar küçük bir hacimde endotelin-1 bırakın. Steril bir Q-ucu kullanarak, enjeksiyondan önce fazla endotelin-1'i silin. Son olarak, yarayı kapatmak için 4-0 steril bir dikiş kullanarak kafatasının üzerindeki cildi dikin.

Endotel 1 ile tedavi edilen fareyi uyuşturduktan sonra, fareyi stereotaksik çerçeveye aktarın. Cerrahi makas kullanarak yara üzerindeki dikişleri kesin. Forseps ile kabuğu çıkarın ve kafatasını ortaya çıkarmak için cildi geri çekin.

Ardından, kafatası yüzeyini kurutmak ve çapak deliklerini bulmak için steril bir Q ucu kullanın. Stereotaksik cihazın manipülatör kollarını ayarlayın. 0,375 inç uzunluğunda bir iğne ile 26 gauge şırınga taşıyan bir iğne tutucu yerleştirin.

Şimdi, şırıngaya 3.4 mikrolitre AAV çözeltisi yükleyin. İğnenin ucunu kafatasını geçecek şekilde ilk, en ön çapak deliğine indirin. İğnenin dura materyali delmediğinden emin olun, ardından beyne bir milimetre indirin.

Hamilton şırıngasını kullanarak, daha önce gösterildiği gibi bir seferde 0.1 mikrolitre dağıtarak bir mikrolitre AAV çözeltisi enjekte edin. Daha sonra 4-0 Polysorb polyester sütür kullanarak yarayı kapatmak için kafatasının üzerindeki cildi dikin. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kurtarma alanındaki temiz, önceden ısıtılmış bir hayvan barınağı kafesine aktarın.