Name: Transepitelyal Elektriksel Empedans İzleme ile Gözenekli Substrat Bazlı Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Keşfedin gözenekli substrat bazlı elektroporasyon ve transepitelyal elektriksel empedans izleme yöntemlerini. Bu teknik, yüksek hücre canlılığı korunarak madde iletimini optimize eder ve ara süreçleri karakterize eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>A431 Hücrelerinde Elektroporasyon Analizi ve İletim Tahmini için TEEI Yöntemi

<ol><li>Brooks, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+highly+controllable+methods+for+in+vitro+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery.</a> Small. 16 (51), e2004917(2020).</li>
<li>Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+by+membrane+disruption%3A+Mechanisms%2C+strategies%2C+and+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts.</a> Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).</li>
<li>Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+electroporation-mediated+molecular+uptake+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability.</a> Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).</li>
<li>Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+electric+field+and+anomalous+heating+caused+by+exponential+pulses+with+aluminum+electrodes+in+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+damage+and+cargo+delivery+in+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation.</a> Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanoscale+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanoscale electroporation.</a> Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).</li>
<li>Patino, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-throughput+localized+electroporation+workflow+with+deep+learning-based+analysis+for+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering.</a> Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).</li>
<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
<li>Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+membrane-based+culture+substrate+for+localized+in+situ+electroporation+of+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells.</a> Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).</li>
<li>Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+numerical+and+experimental+investigation+of+localized+electroporation-based+cell+transfection+and+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling.</a> ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalent+circuit+model+for+localized+electroporation+on+porous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates.</a> Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+impedance+increase+following+porous+substrate+electroporation+enables+label-free+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery.</a> Small. 20 (25), 2310221(2023).</li>
<li>Vindiš, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer+into+mammalian+cells+using+commercial+cell+culture+inserts+with+porous+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate.</a> Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+with+real-time+impedance+assessment+using+a+constriction+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel.</a> Micromachines. 11 (9), 856(2020).</li>
<li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).</li>
<li>Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tight+junctions+and+loss+of+barrier+function+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).</li>
<li>Hunter, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+RJ+%22Zeta+potential+in+colloid+science%3A+Principles+and+applications%22">Zeta potential in colloid science: Principles and applications</a>. 2, Academic Press. (2013).</li>
<li>Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetics+in+microdevices+for+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%2FASME+Trans+Mechatron%22%5BJournal%5D)">Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications.</a> IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).</li>
<li>Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+cell+swelling+for+osmotic+imbalance+induced+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation.</a> Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).</li>
<li>Fox, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: A review.</a> Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).</li>
</ol>

Elektroporasyon, hücrelerin bir elektrik alanına maruz bırakıldığı, hücre zarında proteinler, RNA ve DNA dahil olmak üzere kargolarıngeçebileceği geçici gözenekler oluşturduğu bir tekniktir 1,2. En yaygın kullanılan versiyon toplu elektroporasyondur (BEP). BEP, bir küvetin milyonlarca hücre içeren bir elektrolit ile doldurulması, elektrolitin yüksek voltaja maruz bırakılması ve yükün difüzyon veya endositoz1 yoluyla hücrelere girmesine izin verilmesiyle gerçekleştirilir. BEP'in yüksek verim ve ticari olarak temin edilebilen çok sayıda sistem dahil olmak üzere birçok avantajı vardır. Ancak, BEP dağıtımında sınırlamalar vardır. Elektrotlara göre tutarsız hücre konumlandırması ve bitişik hücrelerden gelen elektrik alan koruması, BEP 3,4 sırasında elektrik alanına maruz kalmada önemli değişkenliğe neden olur. BEP için gereken yüksek voltaj ayrıca hücre canlılığı üzerinde önemli bir olumsuz etkiye sahiptir5. 2011'dekibaşlangıcından bu yana6, gözenekli substrat elektroporasyonu (PSEP) adı verilen bir elektroporasyon yöntemine artan bir ilgi olmuştur, ancak bazen lokalize elektroporasyon ve nano veya mikro elektroporasyon 1,7,8 dahil olmak üzere başka isimlerle anılmaktadır. BEP'in hücre süspansiyonunun aksine, PSEP gözenekli bir substrata yapışan hücreler üzerinde gerçekleştirilir. İnsan hücre hatlarının9 çoğunluğu için sadece yapışık bir durum tercih edilmekle kalmaz, aynı zamanda substrattaki gözenekler de elektrik akımına odaklanır ve transmembran elektrik potansiyelini (TMP) hücre zarının10,11 belirli bölgelerine lokalize eder. Bu lokalizasyon, uygulanan voltajda önemli bir azalmaya, hasarı azaltmaya ve hücre canlılığını artırmaya izin verir. Bu etki kombinasyonu, hücre zarı gözenek gelişimini kontrol etmeye yardımcı olarak daha tutarlı ve verimli bir teslimat sağlar 1,5,12.
Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, ilk olarak Vindis ve ark.14 tarafından tanıtılan, ticari olarak temin edilebilen gözenekli membran eklerini13 (Şekil 1A,B) tutmak için altı kuyulu, altın kaplama elektrot dizisine sahip bir PSEP cihazı tanıtıldı. Cihaz, gerçek zamanlı olarak13 olarak transepitelyal elektrik empedansı (TEEI) olarak bilinen hücre tek tabakası boyunca darbeler uygulayabilir ve elektrik empedansını ölçebilir. Cihazın kullanıcı arayüzü, elektroporasyon dalga formu ve polaritesi üzerinde tam kontrol sağlar. Daha da önemlisi, gerçek zamanlı empedans ölçümleri, etiketsiz teslimat15 olarak bilinen bir kavram olan pahalı reaktiflere veya floresan işaretleyicilere ihtiyaç duymadan teslimat sonuçlarını tahmin etmek için kullanılabilir.
PSEP platformu iki ana özel elektrik bileşeninden oluşur: darbe üreteci ve TEEI ölçüm ekipmanını barındıran cihazın ana gövdesi ve gözenekli alt tabakaların yerleştirildiği ve elektroporasyonun gerçekleştiği elektrot dizisi. Tüm özel elektronikler ve 3D baskılı bileşenler için diyagramlar GitHub'da bulunabilir: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Özel elektroniklere ek olarak, platformun düzgün çalışması için bir bilgisayar da gereklidir. Özel yazılımın çalışması için MATLAB (sürüm 2021a veya üzeri) ve analiz için verileri depolamak ve verilere erişmek için Microsoft Excel gerekir. Program, özel elektronikleri kontrol eder ve ayarları yapmak için grafik kullanıcı arayüzü (GUI) sağlar. Bu programlar ayrıca GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI'da da kullanıma sunuldu.
Ön veriler, bu işlemin farklı yapışık hücre türleri için mümkün olduğunu göstermektedir (Şekil 1C), ancak bu makale yalnızca Brooks ve ark.13 tarafından bu hücre hattı için optimal olduğu tespit edilen parametreleri kullanarak A431 hücrelerinin hazırlanmasını tartışacaktır. Ek olarak, propidyum iyodür (PI) kargosu sitotoksik olduğundan, ilki dağıtım verimliliğini ölçmek için yüksek konsantrasyonlu bir PI transfeksiyon ortamı ve ikincisi daha uzun zaman ölçeklerinde TEEI'yi ölçmek için yalnızca hücre kültürü ortamı olmak üzere iki deney gerçekleştirilir. Bu deneyler, sonuçların ilişkilendirilmesine izin veren aynı elektroporasyon dalga formlarını kullanır (Şekil 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig01.jpg"> Şekil 1: Elektrot dizisi montaj şeması ve temel veriler. (A) Elektrot dizisinin bir kuyusu içindeki bir ekin CAD modeli. (B) Elektrot dizisinin CAD modeli. (C) Seçili hücre hatları için PSEP'e bağlı empedans artışı, hücre hattı başına n = 3. Hata çubuğu: ortalamanın standart hatası. (D) Teslimat verimliliği vs. TEEI korelasyon verilerini artırır. Dağıtım verimliliği, dağıtım deneylerinden hem PI hem de kalsein görüntülerinde etiketlenen hücre sayısının Hoechst ile tanımlanan toplam hücre sayısına bölünmesiyle hesaplandı. Hücre sayısı, voltaj başına n = 6 olan özel bir CellProfiler işlem hattı kullanılarak belirlendi. Hata çubuğu: (x ve y ekseni) ortalamanın standart hatası. Bu figür Brooks ve ark.13'ten izin alınarak çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL Konik Santrifüj Tüpü</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>2 Çipli Tek Kullanımlık Hemositometre</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Doku Kültürü Şişesi</td><td>fisherbrand</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>A431 Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>Sınıf II Tip A2 Biyogüvenlik Kabini</td><td>Labgard</td><td>NU-543-600</td><td></td></tr><tr><td>Özel Bileşenler</td><td>YangLab</td><td></td><td>https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Santrifüj Tüpü (50 mL)</td><td>fisherbrand</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>A5670401</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Aspirasyon Sistemi</td><td>vakuubrand</td><td>20727403</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 240i</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Plazma Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FIBRP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Ters Floresan Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>491916-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>Labomed</td><td>TCM 400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cytiva</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tüpü 200 ve mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>72.737</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Pipet (0.2-2 & mikro; L)</td> <td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00002</td><td></td></tr><tr><td>Pipet (100-1000 & mikro; L)</td> <td>fisherbrand Elite</td><td>FBE01000</td><td></td></tr><tr><td>Pipet (20-200 & mikro; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00200</td><td></td></tr><tr><td>Pipet (2-20 & mikro; L)</td> <td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>Propidium İyodür</td><td>İnvitrojen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Reaksiyon Tüpü 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Thincert (24 kuyulu)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>662 641</td><td>0.4 ve mikro; m gözenek çapı, 2x106 cm-2 gözenek yoğunluğu, şeffaf PET</td></tr><tr><td>Doku Kültürü Plakası (24 oyuklu)</td><td>fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20mL</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

transepitelyal elektriksel empedans İzleme ile gözenekli substrat bazlı elektroporasyon

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

Verilen protokol, özellikle A431 hücre hattı ve PI kargosu için elektroporasyonun ara süreçlerini incelemek ve teslimat tahminleri yapmak için TEEI ölçümlerini kullanmak için bir yöntem oluşturur. Bu protokolün modifikasyonu makalede daha ayrıntılı olarak tartışılmış olsa da, belirli değerler değişebilse de, yanıttaki genel eğilimlerin tutarlı kaldığını belirtmek önemlidir. Örneğin, ilk taban çizgisinin altına düşen TEEI verileri hücre ölümüne karşılık gelirken, TEEI değerindeki minimumun üzerindeki maksimum artış, dağıtım verimliliğinekarşılık gelir 13. Bu genel eğilimler ve etkileri aşağıda incelenmiştir.
Şekil 2A'da gösterildiği gibi, PSEP platformu kullanılırken bir dizi TEEI ölçümü ve hücre görüntüleme eğilimi ortaya çıkabilir. Bu protokolün ideal sonucu, Şekil 2Ai'de gösterilen optimize edilmiş sağlıklı verilere benzer bir eğri üretmektir. Bu, ideal sonuç olarak karakterize edilir, çünkü taban çizgisinin altına düşme yoktur, bu da eğer varsa, çok az hücre ölümüne işaret eder. Ek olarak, optimize edilmiş sağlıklı eğri, TEEI'de minimumdan en büyük artışa sahiptir ve bu da yüksek derecede teslimat verimliliğini gösterir13. Bu çıkarımlar, ihmal edilebilir hücre ölümünü ve sağlıklı, tamamen birleşmiş bir hücre tek tabakasını ortaya çıkaran hücre tek tabakasının PSEP sonrası görüntülenmesi ile desteklenir (Şekil 2Aiii). Ayrıca, aynı PSEP dalga biçimlerini kullanan başarılı bir teslimat deneyi, Şekil 2B'de gösterilen görüntülerle karakterize edilebilir. Uygun elektroporasyon, dalga formu uygulaması ve kargo konsantrasyonu, yüksek derecede teslimat tutarlılığı ve hücre canlılığı ile sonuçlanır.
Hücre tek tabakasının sağlığı ve birleşmesi, TEEI tabanlı dağıtım tahminlerinin başarılı bir şekilde uygulanması için kritik öneme sahiptir16,17. Optimize edilmiş bir dalga formuyla bile, sağlıksız veya eksik bir hücre tek katmanı, Şekil 2Aii'deki optimize edilmiş sağlıksız verilerle gösterildiği gibi, azalmış bir TEEI yanıtı ile sonuçlanır. Bununla birlikte, bu sonuç için görüntülerin (Şekil 2Avi) hala Brooks ve ark.13 tarafından verilen TEEI yanıtının yorumuna karşılık geldiğine dikkat edin. Taban çizgisinin altında herhangi bir düşüş yoktur, bu da sıfıra yakın hücre ölümünü gösterir (Şekil 2C, D). Ek olarak, minimumdan azaltılmış artış, tek katmandaki daha az hücre toplam PI dağıtımını azalttığından, teslimat verimliliği üzerinde olumsuz bir etkiye karşılık gelir (Şekil 2C,D).
Optimize edilmemiş bir dalga formu uygulanırsa, TEEI yanıtında daha da önemli düşüşler görmek mümkündür. Toplam enerjiye ve uygulandığı zaman dilimine bağlı olarak, optimize edilmemiş dalga formları, düşük verimlilikten hücre tek tabakasının neredeyse tamamen yok olmasına kadar değişen sonuçlar üretebilir (Şekil 2Ai,iii,v). Hem optimize edilmemiş hem de çok optimize edilmemiş eğriler, taban çizgisinden önemli bir azalma gösterir ve bu da önemli hücre ölümünü gösterir. Bununla birlikte, giderek daha fazla optimize edilmeyen dalga biçimleri, hücre geri kazanımını engelleyerek dağıtım verimliliğinin azalmasına neden olur.
Dağıtım verimliliği, dağıtım deneylerinden hem PI hem de kalsein görüntülerinde etiketlenen hücre sayısının Hoechst ile tanımlanan toplam hücre sayısına bölünmesiyle hesaplandı. Ölüm, TEEI ölçüm deneylerinde PI ile işaretlenen hücrelerin alınması ve Hoechst ile tanımlanan toplam hücre sayısına bölünmesiyle hesaplandı. Hücre sayısı, her iki ölçüm için de özel bir CellProfiler işlem hattı kullanılarak belirlendi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig02.jpg"> Şekil 2: TEEI yanıt eğrileri ve yaygın durumlar için görüntüleme. (A) (i) Optimize edilmiş ve optimize edilmemiş koşullar için TEEI değişim yüzdesini gösteren TEEI yanıt verileri. (ii) Optimize edilmiş dalga biçimi koşulları altında sağlıklı ve sağlıksız tek katmanlar arasındaki TEEI yanıtı karşılaştırması. (III-V) Hücre ölümünü (kırmızı) ve canlı hücreleri (yeşil) gösteren optimize edilmiş ve optimize edilmemiş dalga formu koşulları için potansiyel sonuçların temsili görüntülemesi. (vi) Hücre ölümünü (kırmızı), canlı hücreleri (yeşil) gösteren optimize edilmiş dalga formu koşulları uygulandıktan sonra sağlıksız tek tabakanın temsili görüntülemesi. (B) Başarılı PI dağıtımını (kırmızı), canlı hücreleri (yeşil) ve çekirdek konumlarını (mavi) gösteren resimler. Tüm görüntüler netlik için aydınlatıldı. Ölçek çubukları: 1000 μm. (C) TEEI, verilen voltajlar için PSEP öncesi taban çizgisinden PSEP sonrası minimuma düşer ve PSEP sonrası minimumdan PSEP sonrası tepe noktasına yükselir. (D) Verilen voltajlar için dağıtım verimliliği ve hücre ölüm yüzdeleri. Hata çubukları SEM'i temsil eder (n = 6). (C,D) Brooks ve ark.13'ten izin alınarak çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Transepitelyal Elektriksel Empedans İzleme ile Gözenekli Substrat Bazlı Elektroporasyon

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other ...

porous-substrate-based-electroporation-with-transepithelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Organik Elektrokimyasal Transistor canlı hücreler ile entegre ve mide-bağırsak epitelyal bariyer boyunca iyon akışı izlemek için kullanılır. Bu çalışmada, kalsiyum kenetleme maddesi EGTA (etilen glikol-bis (beta-aminoetil eter)-N, N, N ', N'-tetra asetik asit varlığı ile indüklenen sıkı birleşme bozulması ile ilişkili iyon akışında bir artış, asit), ölçülür.

Organik Elektrokimyasal Transistör Bariyer Doku bozulması ve Algılama

Bu protokol Electric Cell-substrat Empedans Algılama, hücre eki, çoğalması, hareketliliği ve farmakolojik ve toksik uyaranlara hücresel yanıtların ölçümü için yapışık hücrelerin empedans spektrumu kaydetmek ve analiz etmek için bir yöntemi incelemektedir. Endotelial geçirgenliğin ve hücre-hücre ve hücre-yüzey kontaktların değerlendirilmesi tespiti vurgulanmıştır.

Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

Burada, transepitelyal/endotel elektriksel direnç ölçümleri için piyasada bulunan çubuk elektrotlarla kullanılabilen programlanabilir çıkış frekansına sahip ucuz bir volt-ampermetrenin nasıl kurulabileceğini gösteriyoruz.

Programlanabilir Çıkış Frekansı Ile Kendi Kendine Yapılmış Volt-Ampermetre Kullanarak TEER Ölçümlerini Gerçekleştirmek Için Basit Bir Yaklaşım

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Bu protokol, çip üzerinde laboratuvar, mikroakışkan elektroporasyon cihazı oluşturmak için gereken mikrofabrikasyon tekniklerini açıklar. Deney düzeneği, sürekli bir akışta kontrollü, tek hücre düzeyinde transfeksiyonlar gerçekleştirir ve popülasyon tabanlı kontrol ile daha yüksek verimlere genişletilebilir. Hücre zarı geçirgenliğinin derecesini gerçek zamanlı olarak elektriksel olarak izleme yeteneğini gösteren bir analiz sağlanmıştır.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Uyarılabilir hücrelerin tepkilerini in vitro olarak incelemek için protokol, genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking HEK hücrelerinin basit bir uyarılabilir hücre modelinde elektroporasyona bağlı aksiyon potansiyeli üretimindeki değişikliklerin yanı sıra ilgili parametrelerin otomatik olarak çıkarılması ile transmembran voltajındaki değişikliklerin optik olarak izlenmesini açıklar.

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Bu protokol, elektroporasyon protokollerinin yüksek verimli analizi için üç boyutlu bir doku taklidi içinde transfekte edilmiş hücrelerin uzamsal dağılımını kullanarak tersinir ve tersinmez elektroporasyon eşiklerini ölçmek için hesaplamalı modelleme kullanır.

Elektroporasyon eşiklerinin miktarının belirlenmesi için yüksek verim yeteneğine sahip üç boyutlu doku modeli

Burada, epitel dokusu homeostazının elektromekanik regülasyonunu incelemek için benzersiz bir iki katmanlı mikroakışkan cihaz üretmek için bir protokol sunuyoruz. Cihaz, doku düzlemine dik olarak statik fizyolojik elektrik akımları uygulayarak hücre-hücre yapışmasını, çoğalmasını ve ekstrüzyonunu etkiler. Canlı hücre görüntüleme ve mekanik stres ölçümleri, bu süreçlerin mekanizmalarını ortaya çıkarır.

İki katmanlı mikroakışkan cihaz kullanarak doku homeostazının elektromekanik kontrolünün ortaya çıkarılması

Keşfedin gözenekli substrat bazlı elektroporasyon ve transepitelyal elektriksel empedans izleme yöntemlerini. Bu teknik, yüksek hücre canlılığı korunarak madde iletimini optimize eder ve ara süreçleri karakterize eder.

Transepitelyal Elektriksel Empedans İzleme ile Gözenekli Substrat Bazlı Elektroporasyon

Daha fazla video keşfet