Name: Bağırsak İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması için optimize edilmiş protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Öğrenin, fare bağırsağı için İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması yöntemini. Bu protokol, bağırsak hücre biyolojisi ve fizyolojisi araştırmalarında tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından ACE'ye verilen K01 DK121869 tarafından desteklenmiştir ve bu yayın kısmen T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) ve SAD & RS'ye HCS köşe taşı hibeleri tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Güney Carolina Tıp Üniversitesi'nden (MUSC) ACE'ye başlangıç fonları tarafından desteklendi ve MUSC Sindirim Hastalığı Araştırma Çekirdek Merkezi (P30 DK123704) ve Sindirim ve Karaciğer Hastalığında COBRE (P20 GM120475) tarafından desteklendi. Görüntüleme, MUSC'deki hücre ve moleküler görüntüleme çekirdeği kullanılarak gerçekleştirildi.

Bağırsak dokusunun yüksek kalitede immün boyanması için verimli Swiss Roll yöntemi

<ol><li>Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiating+intestinal+epithelial+cell%3A+Establishment+and+maintenance+of+functions+through+interactions+between+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures.</a> Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).</li>
<li>Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieger%2C+J+%22Animal+models+of+allergic+disease%3A+Methods+and+protocols%22">Animal models of allergic disease: Methods and protocols</a>. , Springer US. New York, NY. (2021).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+the+immunohistochemical+detection+of+infectious+agents+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).</li>
<li>Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+time+and+enzymatic+digestion+on+immunohistochemical+demonstration+of+bromodeoxyuridine+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochemis%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).</li>
<li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li>
<li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+masking+during+fixation+and+embedding%2C+dissected%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen masking during fixation and embedding, dissected.</a> J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).</li>
<li>Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+fixation%2C+antibody+clones%2C+and+signal+amplification+on+steroid+receptor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis.</a> Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bswiss+roll%26%2334%3B%3A+A+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The &#34;swiss roll&#34;: A simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+area+assessment+of+the+murine+intestinal+tract+as+a+prerequisite+for+oral+dose+translation+from+mouse+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man.</a> Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).</li>
<li>Lunnemann, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecum+axis+%28cecax%29+preservation+reveals+physiological+and+pathological+gradients+in+mouse+gastrointestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium.</a> Gut Microbes. 15 (1), 2185029(2023).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting+and+floating+method+for+paraffin-embedded+tissue+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning.</a> J Vis Exp. (139), e58288(2018).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeldman%2C+AT+%22Histopathology%3A+Methods+and+protocols%22">Histopathology: Methods and protocols</a>. , Springer New York. New York, NY. (2014).</li>
<li>Yang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+mechanism+of+mucosal+barrier+erosion+in+the+pathogenesis+of+acquired+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis.</a> iScience. 26 (10), 107883(2023).</li>
<li>Dooley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+5b+is+required+for+proper+localization+of+the+intermicrovillar+adhesion+complex+in+the+intestinal+brush+border%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).</li>
<li>Danan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transit+amplifying+cells+require+mettl3+for+growth+factor+signaling%2C+kras+expression%2C+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.04.06.535853 (2023).</li>
<li>Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+i+promotes+islet+beta-cell+function+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration.</a> J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).</li>
<li>Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+inherent+niches+in+3d+multicellular+msc+spheroids+reconfigures+metabolism+and+enhances+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential.</a> Cells. 10 (10), 2747(2021).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd36+inhibits+beta-catenin%2Fc-myc-mediated+glycolysis+through+ubiquitination+of+gpc4+to+repress+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colitis+modeling+using+dextran+sulfate+sodium+%28dss%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss).</a> J Vis Exp. (35), e1652(2010).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> J Vis Exp. (113), e54161(2016).</li>
<li>Le Naour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+method+for+histological+analyses+of+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue.</a> MethodsX. 9, 101630(2022).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+tissue+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse tissue fixation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), 073403(2014).</li>
<li>Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. aP. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+preparation+techniques+for+histological+analysis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse.</a> Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).</li>
<li>Boenisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heat-induced+antigen+retrieval+following+inconsistent+formalin+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).</li>
<li>Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+three-dimensional+spatial+structure+in+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome.</a> PLoS One. 12 (11), e0188257(2017).</li>
<li>Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+role+of+paneth+cells+in+the+small+intestine+by+lineage+ablation+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice.</a> J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).</li>
<li>Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+antigen+retrieval+protocols+on+the+immunohistochemical+detection+of+epigenetic+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications.</a> Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).</li>
<li>Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Bolognesi, M. aO., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+validated+for+routinely+processed+tissues+stain+frozen+sections+unpredictably%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably.</a> Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Burada, bağırsak mimarisini korumak ve doğru immün boyamayı teşvik etmek için İsviçre rulo tekniğini kullanarak doku fiksasyonu için optimize edilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik bağırsak fizyolojisi ve hücre biyolojisini içeren çok çeşitli araştırma sorularını araştırmak için kullanılabilir19. Optimize edilmiş birkaç İsviçre haddeleme yöntemi yayınlanmıştır ve çok faydalıdır 20,21. Bu tekniğin bir avantajı, bağırsağın filtre kağıdı üzerinde doğru bir şekilde açılma kolaylığıdır. Bu, dokunun düz bir şekilde sabitlenmesine izin vererek, yuvarlanma sırasında dokunun içe doğru kıvrılmasını önler, bu da özellikle kalınlaşmış muskularis ile iltihaplı dokuyu analiz ederken yararlıdır. Ek olarak, güvenilir sonuçlar elde etmede doku kesitinin kritik rolünü vurgulamak önemlidir. Uygun kesitleme, doku mimarisinin korunmasını sağlar ve doğru immün boyamayı kolaylaştırır, sonuçta aşağı akış analizlerinin başarısına katkıda bulunur11. Optimize edilmiş yaklaşım, diğer protokollere kıyasla daha az zordur ve farklı bireyler arasında tutarlı sonuçlar verir. Bu yazıda ortaya konan teknik aynı zamanda iyi korunmuş doku mimarisi, çok yönlülük ve çeşitli antikorlar kullanılarak yüksek oranda tekrarlanabilir immün boyama sağlar.
Bu protokolün kritik bir yönü, sabitleme ve işlem süresidir. Uygun olmayan doku fiksasyonu ve işlemesi histokimyasal analizleri bozabilir. Aşırı sabitlenmiş doku kırılgan hale gelirken, az sabitlenmiş doku çok yumuşak kalır. Hem aşırı hem de az sabitlenmiş dokuların kesitlenmesi zordur ve immün boyamayı tehlikeye atar. Filtre kağıdına diseke edildikten sonra, ölüm sonrası değişiklikleri azaltmak için doku hemen formalin içine yerleştirilmelidir22. Bu protokolde murin dokusu gece boyunca formalin içinde sabitlenir. Birkaç çalışmada bu fiksasyon süresi20,23,24 kullanılmıştır. Bununla birlikte, Boenisch ve ark. immünoboyamanın formalin içinde sabitlenmiş dokuda 4 güne kadar tutarlı olduğunu göstermiştir25. İstenen analizlere bağlı olarak sabitleme süresinin ve fiksatifin optimizasyonu gereklidir. Örneğin, Carnoy fiksatifi genellikle mukus boyama26 için tercih edilir. Fiksatif seçimi ve fiksasyon süresinin süresi, deneysel yaklaşımlarına bağlı olarak her araştırmacı tarafından optimize edilmelidir. Doğru ve tutarlı işlem süreleri sağlamak için otomatik bir doku işlemcisinin kullanılması önerilir. Laboratuvarımız, bağırsak dokusunu rulo halinde yerinde tutmak için küçük pimler kullanır. Pimler olmadan, işlem sırasında doku açılabilir. Bu pimler oldukça küçük ve keskin olduğu için önlem alınması gerekir. Doku işlemeden önce pimin keskin ucunu çıkarmak için tel kesiciler kullanmanızı öneririz. Bazı histoloji çekirdekleri, pimli dokuyu kabul etmeyecektir; Bu nedenle, kullanmadan önce kontrol etmek en iyisidir. Alternatif bir yaklaşım,27'yi işlemeden önce dokuyu sabitlemek için agar kullanmaktır veya ruloların korunmasına yardımcı olmak için kasetlerde kaset süngerleri kullanılabilir.
İmmün boyama, her antikor için optimizasyon gerektiren bir protokoldür. Mümkün olduğunda nakavt onaylı antikorların kullanılması önerilir. Doku fiksasyonu ve işlemesi için bu yöntem, doğrulanmamış antikorlar kullanıldığında arka plan sinyaline kıyasla antikor bağlanmasının kolay tanımlanmasına izin vererek, net boyama ile sonuçlanır. Fiksatif seçim, antijen alımı ve antikor seyreltmesi antikorun özgüllüğünü etkileyebilir. Araştırmacıların, her antikor için fiksasyon, antijen alımı ve kuluçka süresini ayarlayarak protokolü dikkatli bir şekilde değerlendirmelerini ve optimize etmelerini öneririz. En iyi sonuçları elde etmek için, antikorlar optimal konsantrasyonu belirlemek için çeşitli seyreltmelerde ve farklı antijen alma tamponlarında test edilmelidir. Epitop alımı, fiksasyon sırasında oluşan metilen köprülerini kırarak immün boyamayı iyileştirir. Bu protokolde, proteolitik kaynaklı epitop alımı yerine ısıya bağlı epitop alımı kullanılır, çünkü enzim sindiriminin doku morfolojisini bozma olasılığı daha yüksektir28. En yaygın ısı kaynaklı epitop alma tamponları sitrat tamponu, tris-HCl ve tris-EDTA'dır ve sitrat tamponu doku morfolojisi üzerinde en nazik olanıdır29. Tampon seçimi değişir ve her antikor için belirlenmelidir. Birçok antijen geri alma tamponu, bloke edici çözelti ve antikor seyrelticisi ticari olarak mevcuttur. Ancak, bu çözümler son derece pahalı ve maliyet engelleyici olabilir. Maliyet etkinliğini sağlamak için yaygın antijen alma solüsyonları ve bloke edici ve antikor seyreltici solüsyonların tariflerini sağladık. 
Bu yöntemin bir sınırlaması, fiksasyon ve işlemenin dokuyu değiştirebilmesi ve epitopları maskeleyebilmesidir. Alternatif bir yaklaşım, taze donmuş dokuyu immün boyamaktır. Taze donmuş doku, toksik fiksatiflere maruz kalmaktan kaçınmaya, protein yapısını korumaya ve bazı epitopların erişilebilirliğini iyileştirmeye izin verecek şekilde dondurulur. Bununla birlikte, doku mimarisi ve morfolojisi, sabit ve parafine gömülü dokulardan daha zayıftır. Taze donmuş dokuyla ilgili diğer zorluklar arasında, donmuş blokları ve slaytları bölümlere ayırmak ve depolamak için gereken malzemeler ve lojistik yer alır. İsviçre rulolarının bağırsak dokusu şeritlerine karşı analizi, daha önceki bir raporda30 açıklandığı gibi, villus yüksekliği ve genişliğindeki farklılıkları ve lamina propriadaki bağışıklık hücrelerindeki farklılıkları gösterir. Bu sonuçlar, bağırsak İsviçre rulolarının, deneyler planlanırken göz önünde bulundurulması gereken bazı bağırsak özelliklerini değiştirdiğini göstermektedir. Ek olarak, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokuya spesifik olarak bağlanan birçok antikor, taze donmuş dokuda iyi lekelenmediğinden, antikor yeniden doğrulaması gereklidir31.
Bağırsak dokusunun immün boyanması, gastrointestinal hücre biyolojisi ve fizyolojisi ile ilgili çok çeşitli soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu teknik, bağırsak iltihabı ortamında, bakteriyel enfeksiyonu takiben ve kanserin ilerlemesi sırasında epitel değişikliklerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada sunulan yöntem, bağırsak dokusunun korunması için idealdir, çünkü uygun maliyetlidir, teknik olarak zorlayıcı değildir ve yüksek oranda tekrarlanabilirdir. En iyi sonuçları elde etmek için, deneysel tasarıma ve test edilen hipoteze dayalı olarak bu protokolde belirtilen adımların optimizasyonunu teşvik ediyoruz.

Bağırsağın hücresel mimarisi, bağırsak dokusu immün boyama için korunurken yapısal bütünlüğünün korunmasında benzersiz bir zorluk teşkil eder. İnce bağırsak, villus1 olarak bilinen uzun parmak benzeri yapılardan oluşur. Bu villuslar genellikle gömme işlemleri sırasında malform hale gelir. Araştırmacıların, bağırsağın tüm bölgelerinin yanı sıra bağırsağı oluşturan katmanların (yani muscularis propria, mukoza ve serosa) görselleştirilmesine izin vererek, enine kesitler elde etmek için bağırsakları düzgün bir şekilde gömme tekniklerine sahip olmalarını sağlamak, sağlam deneysel analiz için çok önemlidir2. Yetersiz fiksasyon, aşırı fiksasyon ve yanlış doku kullanımı doku bütünlüğünü tehlikeye atarak bağırsak epitelinde yanlışlıkla hasara neden olur 3,4. Bu adımlar sırasında bağırsak epiteline zarar vermek, immünohistokimya protokollerinin ve kullanılan antikorların etkinliğinden bağımsız olarak, immünofloresan gibi sonraki analizlerin kalitesini önemli ölçüde azaltabilir.
İmmün boyama, uygun doku fiksasyonu gibi, biyomedikal araştırmanın önemli bir parçasıdır. İyi yapıldığında, immün boyama, hücresel yapı ve fonksiyonun daha önce bilinmeyen yönlerini aydınlatabilir. Parafin bölümlerinin immünofloresan boyaması, fiksasyon ve parafin gömme işleminden kaynaklanan fizikokimyasal modifikasyonlar nedeniyle zor olabilir5. Fiksasyon ve parafin gömme, ilgilenilen epitopların immünofloresan tespitine müdahale edebilecek antijen maskelemesi ile sonuçlanır6. Gecikmiş fiksasyon proteolitik bozulmaya neden olabilir, bu da kritik epitoplarınzayıflamasına veya hiç boyanmamasına neden olur 7. Ek olarak, antikorlar genellikle yüksek düzeyde arka plan ile yanlıştır. Tutarlı ve spesifik antikor bağlanmasını ve yüksek sinyal-gürültü oranını destekleyen immün boyama protokolleri, araştırmacılar için değerli bilgiler sağlayabilir. 
Burada, bağırsak dokusu fiksasyonu, İsviçre rulo hazırlığı8 ve immünoboyama yoluyla yüksek kaliteli immünofloresan görüntüler elde etmek için tasarlanmış kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bağırsağın bütünlüğünü korumaya yönelik kılavuzları vurgulayan protokol, araştırmacılara immünofloresan görüntüleme çalışmalarının kalitesini ve güvenilirliğini artırmak için sağlam bir metodoloji sağlamayı amaçlamaktadır. Ayrıca, protokolü kısıtlı fonlara sahip olabilecek laboratuvarlar için daha erişilebilir hale getirmek için filtre kağıdı ve ev yapımı antijen alımı, bloke edici çözümler ve antikor seyrelticileri dahil olmak üzere uygun maliyetli kaynakları kullanmaya çalıştık. Tüm deneysel protokollerde olduğu gibi, araştırmacılar mevcut protokolü deneysel yaklaşımlarına ve ilgi alanlarına göre optimize etmelidir.

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>Selüloz filtre kağıdı</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>Kalın Whatman kağıdı</td></tr><tr><td>Şarjlı cam slaytlar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>Lamel</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon pimleri boyutu 00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>Dondurucu eldivenleri</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma bloğu</td><td>Premiere</td><td>XH-2001</td><td>Slayt Isıtıcı</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>64111-04</td><td>Temizleme reaktifi</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik kalem</td><td>Millipore 402176</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>Büyük kasetler</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>Fare üzerinde fare engelleme reaktifi</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>MKB-2213</td><td>Fare üzerinde fare bloğu</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>Düdüklü Tencere</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong altın antifade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Montaj ortamı</td></tr><tr><td>Ters hareket forseps</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Sürgülü Raf</td><td>Tissue-Tek</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Slayt Boyama Seti</td><td>Tissue-Tek</td><td>62540-01</td><td>Solvente Dayanıklı Tabaklar ve Metal Çerçeve</td></tr><tr><td>Küçük kasetler</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat dihidrat</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Teleostein Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>Engelleme tamponu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>Mendil</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTIN</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

bağırsak İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması için optimize edilmiş protokol

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

Bağırsak, ince ve kalın bağırsaklardan oluşan karmaşık bir organdır. İnce bağırsak ayrıca duodenum, jejunum ve ileum olarak ikiye ayrılabilir. Bağırsağın her anatomik bölgesi, hücresel yapıdaki farklılıklarla yansıtılan benzersiz bir işleve sahiptir. Bağırsaktaki değişikliklerin araştırılması, farklı doku bölgelerinin ve hücresel değişikliklerin derinlemesine analizini gerektirir. Bağırsakları incelemek ve büyük doku parçalarını görselleştirmek için, araştırmacılar genellikle bağırsak İsviçre ruloları olarak bilinen bir teknik kullanırlar. Bu teknikte bağırsak her anatomik bölgeye ayrılır ve düz bir yönelimde sabitlenir. Daha sonra, doku dikkatlice yuvarlanır ve parafin gömme için işlenir. Uygun doku fiksasyonu ve oryantasyonu genellikle gözden kaçan bir laboratuvar tekniğidir, ancak aşağı akış analizi için kritik öneme sahiptir. Ek olarak, bağırsak dokusunun yanlış İsviçre yuvarlanması, kırılgan bağırsak epiteline zarar verebilir ve bu da immün boyama için düşük doku kalitesine yol açabilir. Sağlam hücresel yapılara sahip iyi sabitlenmiş ve düzgün yönlendirilmiş dokunun sağlanması, bağırsak hücrelerinin en iyi şekilde görüntülenmesini sağlayan çok önemli bir adımdır. Bağırsağın tüm bölümlerini tek bir parafine gömülü blokta içerecek şekilde İsviçre ruloları yapmak için uygun maliyetli ve basit bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, bağırsak epitelinin çeşitli yönlerini incelemek için bağırsak dokusunun optimize edilmiş immünofloresan boyamasını da tarif ediyoruz. Aşağıdaki protokol, araştırmacılara bağırsak dokusu fiksasyonu, Swiss-roll tekniği ve immünoboyama yoluyla yüksek kaliteli immünofloresan görüntüleri elde etmek için kapsamlı bir kılavuz sağlar. Bu rafine yaklaşımları kullanmak, bağırsak epitelinin karmaşık morfolojisini korur ve bağırsak fizyolojisi ve patobiyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Daha önce tarif edildiği gibi hematoksilen ve eozin (H&amp;E) boyaması yapıldı12. Optimize edilmiş yöntemi kullanarak, bağırsak İsviçre ruloları, ince bağırsağın ve kalın bağırsağın üç segmentini de tek bir slaytta içeriyordu. Tüm bağırsağın bir slayt üzerine yerleştirilmesi, araştırmacıların bağırsağın tüm bölümlerindeki değişiklikleri analiz etmelerine olanak tanır ve reaktiflerin bölümlendirilmesi ve boyanmasında maliyet tasarrufu sağlar (Şekil 1). Ayrıca, immün boyama sırasında tüm bağırsak segmentlerini aynı anda aynı solüsyonlara maruz bırakmak, doğru sonuçların sağlanmasına yardımcı olur. H&amp;E mikrografı, ince bağırsak ve kalın bağırsağın tüm bölümlerinin korunmuş bağırsak mimarisini gösterir (Şekil 2). Duodenal villus ölçümü, bu İsviçre roll yöntemi ile karşılaştırıldığında, açılmamış bağırsak dokusunda villus yüksekliğinde anlamlı bir fark göstermedi, bu da bağırsağın açılmasının doku mimarisini bozmadığını düşündürmektedir (Şekil 2D). Bağırsak İsviçre rulolarının immün boyama, bağırsağın çeşitli katmanlarının yanı sıra tüm villöz kript eksenini gösterir. Floresan görüntüler, birincil ve ikincil antikor boyamasından düşük arka plan seviyelerini gösterir ve epitelde bulunan tek tek hücreleri açıkça gösterir. Şekil 3 , farklı bağırsak segmentlerinin morfolojisini ve goblet hücreleri (MUC2 pozitif hücreler)13, apikal zar (γ-ACTIN)14, epitel hücrelerinin lateral zarı (E-KAHERİN)15 ve çekirdekler için boyamayı göstermektedir. Bu protokol, proliferatif hücreler (PCNA)16, interstisyum (LAMININ; Şekil 4A) 17, lizozomal alan (LAMP1)14 ve epitel (β-KATENİN; Şekil 4B) 18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg"> Şekil 1: Bağırsak İsviçre rulolarının hazırlanması ve işlenmesi için iş akışı. (A) Bağırsak segmentleri PBS içeren bir şırınga ile yıkanır ve daha sonra PBS'de yıkanır. (B) Islak bağırsak dokusu daha sonra kuru filtre kağıdına yerleştirilir. (C) Bağırsak, filtre kağıdı üzerinde uzunlamasına kesilir ve (D) hafifçe yayılır. (E) Açılan bağırsağın üzerine bir parça filtre kağıdı serilir ve bağırsak, filtre kağıdı arasına nazikçe sıkıştırılır ve zımbalanır. Bağırsak segmentleri gece boyunca sabitlenir ve (F) forseps kullanılarak yuvarlanır. (G) Bağırsak, ters hareket forsepsinden nazikçe çıkarılır ve (H) rozet görünümündedir. (I, J) Bağırsak dokusu sabitlenir ve büyük bir kasete yerleştirilir. (K) Dört bağırsak segmentinin tümü, doku işleme ve gömme için aynı kasete yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg"> Şekil 2: Bağırsağın dört segmentinin tümünün hematoksilen ve eozin boyanması. (A) Döşeme taraması, duodenum, jejunum, ileum ve kolonun ayrı ayrı İsviçre ruloları ile tüm bağırsağı tek bir slaytta görselleştirme yeteneğini gösterir. (B) Bir bağırsak İsviçre rulosunun mikrografı ve (C) villus ve kript mimarisini göstermek için daha yüksek büyütme girişi. (D) İnce bağırsak villus uzunluğunun ölçülmesi, İsviçre rulo dokusu ile açılmamış doku arasında anlamlı bir fark göstermez. Ölçek çubukları = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg"> Şekil 3: Bağırsağın dört segmentinin tümünün immünofloresan boyanması. Yetişkin C57BL / 6J kontrol fareleri, çekirdekler (camgöbeği), lateral membran markörü, E-KAHERİN (yeşil), MUC2 (sarı) ile tanımlanan goblet hücreleri ve apikal fırça kenarlığı markörü, γ-ACTIN, (macenta) için immün boyandı. Ölçek çubukları = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg"> Şekil 4. Bağırsakta immünofloresan boyama. (A) Fare bağırsağının immünofloresan boyanmasının temsili bir mikrografı, çekirdekleri (camgöbeği), proliferatif hücreleri, PCNA'yı (yeşil) ve lamina propria, LAMININ'i (macenta) vurgular. (B) Bağırsakta çekirdekleri (camgöbeği), hücre zarı belirteci β-KATENİN (yeşil) ve lizozom belirteci LAMP1'i (macenta) tanımlayan immünofloresan görüntü. Ölçek çubukları = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bağırsak, sindirim ve emilim için hayati önem taşır. Her bölge -duodenum, jejunum, ileum, kolon- benzersiz hücresel yapılar nedeniyle farklı işlevlere hizmet eder. Bağırsak fizyolojisini incelemek, titiz bir doku analizi gerektirir. Bu protokol, İsviçre rulo tekniğini kullanarak doku fiksasyonunu ve işlenmesini ana hatlarıyla belirtir ve uygun doku koruması ve oryantasyonu yoluyla doğru immün boyamayı sağlar.

Bağırsak İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması için optimize edilmiş protokol

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

optimized-protocol-for-intestinal-swiss-rolls-immunofluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, serbest yüzen fare jejunum kriyokesitlerinde bağırsak tutam hücrelerini görselleştirmek için immünofloresan tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bağırsak villusları içinde, luminal uçta yeşil floresansın genişletilmiş bir kırmızı kökçük kütlesi ile birlikte lokalizasyonu, tutam hücrelerinin varlığını gösterir.

Jejunum Kriyoseksiyonlarında Tutam Hücrelerini Görselleştirmek için İmmünofloresan Tabanlı Bir Yöntem

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Bağırsak epitel kök hücreler (ISCs) Paneth hücreleri ile iç içe. Bu hücreler ISCs destekleyen ve antibakteriyel koruma sağlamak ISC, soyunu ayırt edilirler. İşte biz Paneth hücrelerinin bağırsak epithelia sürdürmek çok önemli bir rol oynadığını kurmak için transgenik fare koşullu modellerini nasıl kullandıklarını göstermektedir.

Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller<em&gt; Cre-lox</em&gt; Fare Modelleri

Doğru kimlik ve bağırsak mukoza zarının üzerinde epitel hücreleri konumu farklı hücre soyları tanımlamak için gereklidir. bağırsak dokuların uygun görüntüleme maksimum çözünürlük ile protein ekspresyonu belirlenmesi için çok önemlidir. Bu çalışma işleme fare bağırsak dokuları için en uygun yöntem ve koşulları belirginleştiren amaçlamaktadır.

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Biz iletişim kuralları izolasyon-in vivo dokusundan bağırsak 3D yapılar için mevcut ve organoids ve detay farklı fiksasyon ve protokolleri IMMUNO-etiketleme için Mikrotubul, en iyi duruma getirilmiş boyama vitro Bodrum matris gömülü, centrosomal ve bileske proteinler de gibi hücre kök hücre proteini Lgr5 de dahil olmak üzere işaretler.

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

Kuga vd fosforilasyon-durum belirli antikor aktin bağlayıcı protein tirozin 1798 (pY1798) fosforile girdin karşı tutam hücreleri (TCs) etiketlemek için kullanılabilir keşfetti. Bu iletişim kuralı serbest yüzer değişir cryosections pY1798 antikorlar ile immünfloresan boyama kullanarak TCs güçlü görselleştirme sağlar.

Serbest dalgalanma fare değişir Cryosections hücrelerde bağırsak tutam görselleştirmek için Anti-fosfo-girdin antikor kullanımı

Ücretsiz bilgisayar destekli bir sistem kullanılarak bağırsak iltihabının sistematik olarak puanlanması, ülser ve enflamatuar değişikliklerin varlığı ile karakterize kolit modellerindeki histopatolojik değişiklikleri nicel olarak karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Histolojik kolit skoru değerlendirmesi klinik gözlemleri güçlendirir ve veri yorumlamayı kolaylaştırır.

Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi

Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Ayrıntılı protokolümüz, insan bağırsak mukozasını 3D yapılar ve çeşitli hücre tipleri ile simüle eden, mikrobiyal kolonizasyona yanıt olarak bağışıklık tepkilerinin ve hücresel fonksiyonların derinlemesine analizini sağlayan gelişmiş çip üzerinde bağırsak modelinin oluşturulmasını ve kullanımını özetlemektedir.

Bağırsak mukozal bağışıklık tepkilerini analiz etmek için immünokompetan çip üzerinde bağırsak modeli

Bu protokol, fare bağırsağı için geliştirilen "Swiss roll" tekniğinden modifiye edilmiş tüm mide bağışıklık boyama yöntemini açıklar.

Değiştirilmiş İsviçre Roll Tekniği Kullanarak Fare Mide Kası Katmanlarının Geliştirilmiş Mekansal Haritalanması

Öğrenin, fare bağırsağı için İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması yöntemini. Bu protokol, bağırsak hücre biyolojisi ve fizyolojisi araştırmalarında tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Bağırsak İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması için optimize edilmiş protokol

Daha fazla video keşfet