Name: Konakçıya Yönelik Tedavileri İlerletmek için Enfeksiyonda İmmünometabolik Devreler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Keşfedin, Leishmania major enfeksiyonunda immünometabolik devreleri sentetik devrelerle modüle ederek parazit eliminasyonunu ve sitokin ekspresyonunu nasıl iyileştirebilirsiniz. Bu yöntem, enfeksiyon hastalıkları için yeni immünoterapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, araştırmamızı desteklediği için Pune'daki Biyoteknoloji Araştırma ve Yenilik Konseyi - Ulusal Hücre Bilimi Merkezi (BRIC-NCCS) Direktörüne ve BRIC-NCCS Biyoinformatik Tesisine teşekkür eder.

Leishmaniasis Tedavisi için Tetrasiklin Kontrollü Sentetik Devrelerin Tasarlanması

<ol><li>Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism%3A+Towards+a+better+understanding+the+mechanism+of+parasitic+infection+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity.</a> Front Immunol. 12, 661241(2021).</li>
<li>Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-metabolic+interactions+between+Leishmania+and+macrophage+host%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host.</a> Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).</li>
<li>Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-metabolic+profile+of+human+macrophages+after+Leishmania+and+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection.</a> PloS one. 14 (12), e0225588(2019).</li>
<li>Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+From+systems+biology+to+improve+knowledge+of+Leishmania+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infection+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance.</a> Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670(2021).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-metabolic+signaling+in+leishmaniasis%3A+insights+gained+from+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinfo+Adv%22%5BJournal%5D)">Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling.</a> Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125(2023).</li>
<li>Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+circuit+of+inositol+phosphorylceramide+synthase+in+Leishmania+a+chemical+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach.</a> J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+for+combating+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology for combating leishmaniasis.</a> Front Microbiol. 15, 1338749(2024).</li>
<li>Volpedo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+live+attenuated+centrin+gene-deleted+Leishmania+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates.</a> Pathogens. 11 (4), 431(2022).</li>
<li>Almeida, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis%3A+Immune+cells+crosstalk+in+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trop+Med+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization.</a> Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276(2023).</li>
<li>Duarte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+type+II+dehydrogenase+is+essential+for+parasite+viability+irrespective+of+the+presence+of+an+active+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118(2021).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+identifies+genes%2Fpathways+associated+with+experimental+resistance+to+paromomycin+in+Leishmania+donovani%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol+Drugs+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani.</a> Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).</li>
<li>Bolintineanu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+changes+in+tetracycline+repressor+binding+upon+mutations+in+the+tetracycline+operator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Eng+Data%22%5BJournal%5D)">Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator.</a> J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+circuit+for+buffering+gene+dosage+variation+between+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells.</a> Nat Comm. 12 (1), 4132(2021).</li>
<li>Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+the+design+of+synthetic+gene+networks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells.</a> FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Rabhi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+Leishmania+infected+mice+macrophages%3A+a+metabolic+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763(2012).</li>
<li>Renkema, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDHA+mutations+causing+a+multisystem+mitochondrial+disease%3A+novel+mutations+and+genetic+overlap+with+hereditary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Human+Gene%22%5BJournal%5D)">SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors.</a> Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+channelizing+protein-peptide+interactions+pipeline+for+host-parasite+paradigm+in+IL-10+and+IL-12+reciprocity+by+SHP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466(2022).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC+sequencing+identifies+sleepy+macrophages+during+reciprocity+of+cytokines+in+L.+major+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection.</a> Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823(2024).</li>
<li>Costello, A., Badran, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biological+circuits+within+an+orthogonal+central+dogma%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma.</a> Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).</li>
<li>Cooling, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+virtual+biological+parts%3A+a+repository+of+modular+modeling+components+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology.</a> Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).</li>
<li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+genetic+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Principles of genetic circuit design.</a> Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).</li>
<li>Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChan%2C+VW+%22The+effect+of+increasing+plasmid+size+on+transformation+efficiency+in+Escherichia+coli%22">The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli</a>. , (2002).</li>
<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Comm. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-dependent+metalloprotease+1+promotes+apoptosis+of+RAW264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+J+Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages.</a> Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).</li>
<li>Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+adenovirus+infection%3A+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells.</a> J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).</li>
<li>Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+RAW264.7+cells+with+a+luciferase+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene.</a> J Vis Exp. (100), (2015).</li>
<li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031(2021).</li>
<li>Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-On+systems+for+doxycycline-inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression.</a> Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).</li>
<li>De Boeck, J., Verfaillie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inducible+overexpression+systems%3A+how+to+induce+your+gene+of+interest+without+inducing+misinterpretations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations.</a> Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methoxyl+Aesculetin+abrogates+lipopolysaccharide-induced+inflammation+by+suppressing+MAPK+and+AP-1+pathways+in+RAW+264.7+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells.</a> Int J Mol Sci. 17 (3), 315(2016).</li>
<li>Tomiotto-Pellissier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+Leishmaniasis%3A+Broadening+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons.</a> Front Immunol. 9, 2529(2018).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Elde edilen sonuçlar, sentetik bir devrenin tasarımı ve uygulanması için kanalize edilen boru hattının verimliliğinin altını çizmektedir. Bu sentetik devrenin inşası, leishmaniasis gibi bulaşıcı hastalıklar için hassas ilaç geliştirmeye yönelik bir adımdı. Genetik parçaların in silico montajı ve deterministik simülasyon yoluyla, TetON sisteminin ayırt edici modülatör etkisi izlendi. Devrenin etkisi, özellikle, TetR ve SDHA/GFP'nin karşılıklı iki durumlu ifadesine yol açmış olabilir. SDHA'nın ekspresyonu periyodikti, bu da sadece doksisiklin varlığında ekspresyonunun arttığını gösterebilir. Bir dönem boyunca ifade desenlerindeki olası değişiklikleri gözlemlemek için, 100'lük bir zaman birimi seçildi. Sonuçlar, sentetik devrenin TetR ve SDHA/GFP için periyodik davranış gösterdiğini, muhtemelen ortogonal doğasınaatfedilebilir 21 olduğunu belirlemektedir. iGEM parça kayıt defterinden genetik parçaların montajı, sentetik devrelerin22 oluşturulması için gerekli genetik bileşenleri sağladığı için çok önemli bir rol oynadı. Genetik parçaların modüler olarak düzenlenmesi önemlidir, çünkü devrenin translasyonu ve işleyişi etkilenebilir, bu da hücrelerde verimsiz ekspresyona ve modülatör etkiye yol açabilir23.
Vektörün boyutunun çok büyük olmamasını sağlamak için sentetik devrenin kesici uç boyutu yaklaşık 1,3 kb idi, bu da dönüşüm verimliliğini potansiyel olarak azaltabilir24. Uygun bir vektörün seçilmesi kritik bir adımdır, çünkü bakteri sistemindeki kopya sayısını artırmak ve yüksek plazmit kopyası elde etmek için gerekli olan genetik parçalara sahip olması gerekir ve ifade mekanizması memeli sistemine iyi uyum sağlamalıdır25. pEGFP-N1 vektörü, RAW264.7 hücre hattında iyi karakterize edilmiştir ve çoklu klonlama bölgesi26 ile kompakt bir plazmit yapısına sahiptir. Spektrofotometrik tahmin ve AGE ile doğrulanan yüksek konsantrasyonlu ve saf plazmid üretimini sağlamak için plazmit izolasyonu için laboratuvarda standartlaştırılmış tampon çözeltileri kullanıldı. Sentetik devrenin pEGFP-N1 vektörüne yerleştirilmesi, kısıtlama sindirimi yoluyla doğrulandı ve numuneler AGE ve dizileme üzerinde analiz edildi. AGE sonuçları, 1.3 kb'lik bir kesici uç bandını, 4.7 kb'lik bir pEGFP-N1 vektör bandını ve tüm sentetik devrenin 6 kb'lik bandını temsil etti. 
DNA'nın 1:1, 1:2 ve 2:1 oranı kullanılarak transfeksiyon: PEI oranları gerçekleştirildi, burada gözlenen 1:1 oranı hücre morfolojisini bozmadan en iyi sonucu verdi (veriler gösterilmemiştir). Transfekte hücrelerin seçimi için 400 μg/mL - 1000 μg/mL G418 konsantrasyonu kullanılması önerilir27. Transfekte edilmiş hücrelerin seçimi için 500 μg / mL'lik bir G418 kullanıldı, çünkü hücre büyümesinden veya transfekte edilmiş hücrelerin morfolojisinden ödün vermeden transfekte edilmemiş hücrelerin büyümesini etkili bir şekilde baskıladı (veriler gösterilmemiştir). Transfeksiyon verimliliğinde, özellikle farklılaşmaya uğrayabilen ve transfekte edilmesi zor hale gelebilen makrofaj hücre hatlarında hücre fenotipinin önemi göz önüne alındığında, transformasyon28 için RAW264.7 hücre hattının düşük bir geçiş sayısı kullanıldı. Hücre geçiş sayıları da transfeksiyon verimliliğinde kritik bir faktör olabilir. Yüksek bir geçiş sayısı, verimsiz transfeksiyona29 yol açabilir. Dox, TetR'ye yüksek bağlanma verimliliği, uygun doku dağılımı, düşük toksisitesi ve 24 saat30'luk yarı ömrü nedeniyle Tet-ON indüksiyon sistemi için tercih edilen indükleyicidir. Transfeksiyon sonrası, hücreler 24 saat boyunca dox ile indüklendi ve GFP ekspresyonu için gözlendi. RAW264.7 hücreleri için, sentetik devre indüksiyonu için kullanılan dox konsantrasyonu 1 μg/mL idi ve bu da önerilen 1-2 μg/mL31 aralığına düşüyor (veriler gösterilmemiştir). Bununla birlikte, indüksiyon sonrası SDHA konsantrasyonunun düzenlenmesi belirlenmemiştir. Genel olarak, hücre geçiş sayısının, DNA: PEI konsantrasyonunun, memeli transfeksiyon seçim belirteç konsantrasyonunun ve doksisiklin indüksiyon konsantrasyonunun belirlenmesi ve standardizasyonu, transfeksiyon işleminde çok önemli faktörlerdir.
Enfeksiyon sonrası sentetik devrenin farklı zaman noktalarında indüksiyonunu takiben, hücre içi parazit yükünde önemli bir azalma gözlenmiştir. Enfekte ve IMTI numuneleri arasındaki parazit yüklerinin karşılaştırılması, muhtemelen SDHA ekspresyonuna atfedilebilecek sentetik devre ile indüklenen hücrelerde daha düşük bir yük ortaya çıkardı. SDHA ekspresyonu NO üretimi ile ilişkili olduğundan, IMTI hücrelerinin, NO üretildiğinde RAW264.7 hücre hattında meydana gelen düzensiz ve pürüzlü bir morfolojik forma sahip olduğu gözlenmiştir32. 6 saatlik enfeksiyon sonrası IL-10 ve IL-12 seviyeleri en yüksekti, çünkü her iki sitokinin de bu zaman noktasında yukarı regüle edildiği bildirildi, bu da IL-10'u IL-1219'dan daha fazla üretmek için fenotipik modifikasyona uğradı. IL-10 ve IL-12 seviyeleri transfeksiyon sonrası ve IMTI örneklerinde önemli ölçüde değişmediğinden, proinflamatuar ve antiinflamatuar sitokin yanıtlarını tespit etmek için sitokin profillemesi yapıldı. 
TNF-α, IFN-γ ve TGF-β ekspresyon seviyeleri 6 saatlik enfeksiyon, IMT ve 24 saatlik IMTI örneklerinde tanımlandı. Hücre içi parazitleri ortadan kaldırmak için, TNF-α ve IFN-γ, NO üretimi yoluyla oksidatif patlamaları indükledikleri için esas olarak gereklidir. M2 polarize makrofajlar, proinflamatuar sitokinleri33 aşağı regüle eden TGF-β eksprese eder. 24 saatlik IMTI örneği, TGF-β'den daha fazla TNF-α ve IFN-γ ekspresyonu gösterdi, bu da makrofajların, transfeksiyon ve L. major ile enfeksiyon üzerine, pro-inflamatuar sitokin eksprese eden fenotipe polarize olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle çalışma, sentetik bir devre ile transfeksiyon sırasında indüklenen fenotipik değişiklikler hakkında fikir verir ve enfeksiyon dinamiklerini vurgular. Sentetik devrelerin terapötik olarak etkisi, indüksiyonlarının anti-inflamatuar sitokin ile karşılaştırıldığında pro-inflamatuar sitokin ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdığı için araştırılabilir. Bu nedenle, çalışma sadece sentetik devre yapımı ve dağıtım boru hattını kurmakla kalmadı, aynı zamanda Leishmania'ya meydan okuyan konakçı hücrelerde pro-inflamatuar sitokinlerin yukarı regülasyonu yoluyla bir leishmaniasis modelinde terapötik potansiyelini de gösterdi.

Bütüncül, bütünleştirici tıbbın ilerlemesi, bağışıklık hücrelerindeki metabolik değişiklikler ile bulaşıcı hastalıklarda bağışıklık hücresi fenotipini modüle etme yetenekleri arasında tanımlanan önemli bir bağlantıdır. İmmüno-metabolizma, insanlarda yaygın bulaşıcı hastalıkların patogenezini aydınlatmak için yeni bakış açıları sunar. Ayrıca, müdahale1 için yeni hedefler belirleyerek aşıların ve ilaçların geliştirilmesi için umut verici teknikler sağlar. Bağışıklık hücrelerinin metabolik olarak yeniden programlanması, leishmaniasis dahil olmak üzere çeşitli bulaşıcı hastalıklarda tanımlanır. Leishmania spp. Leishmania majör (L. majör) kutanöz leishmaniasis'e (CL) neden olan leishmaniasis'e neden olmaktan sorumludur. L. majör parazitler, hücre içi parazitler olarak çoğalma ve hayatta kalma için, özellikle makrofajlarda, konakçı hücrelerin metabolizması üzerinde önemli bir etki ortaya çıkarır2. Makrofajlar tipik olarak, M1 hücrelerinin nitrojen türlerinin metabolizması yoluyla yüksek proinflamatuar sitokin sekresyonuna ve nitrik oksit (NO) üretimine sahip olduğu klasik olarak aktive edilmiş (M1) veya alternatif olarak aktive edilmiş (M2) alt kümelere polarize olabilir. M2 hücreleri, yüksek seviyelerde anti-inflamatuar sitokinler sergiler ve nitrojen metabolizması3 yoluyla yüksek arginaz aktivitesi gösterir. Bu nedenle, her iki fenotip de sadece bağışıklık tepkileri ile değil, aynı zamanda metabolik yolakları açısından da farklılık gösterir.
Leishmaniasis'in sistem biyolojisi, ilaç tasarımı ve geliştirilmesi yoluyla yeni terapötikler tasarlamak için moleküler hedefleri belirlemeyi amaçlamaktadır. Sinyal ağlarının ve metabolik yolakların yeniden yapılandırılması, leishmaniasis'in bütüncül bir model olarak anlaşılmasına yardımcı olur ve hastalıklı durumu yönlendiren temel bileşenin tanımlanması için içgörü sağlar. Matematiksel modelleme, leishmaniasis4'ün karmaşıklıklarını anlamak için en çok tercih edilen uygulamalı analitik yaklaşımlardan biridir. İmmünometabolik ağlar ve matematiksel modeller, paraziti ortadan kaldırmak için ifade edilen M1 fenotipinin önemli bir bileşeni olarak süksinat dehidrojenazın (SDHA)tanımlanmasını sağladı 5. Sentetik biyolojinin leishmaniasis'te teşhis, aşı geliştirme ve terapötiklerde uygulamaları vardır. İmmün yanıt modülasyonunu hedefleyen metabolizma, sentetik biyoloji araçları ile sağlanabilir. Sfingolipid metabolizmasını düzenleyen ve konak immün sinyalizasyonunu değiştiren inositol fosforil seramid sentazın modülasyonu için, L. majör enfeksiyon modeli 6,7'nin içsel sağlamlığını sentetik olarak ayarlamak için iki durumlu davranışa sahip bir genetik devre kullanıldı. Bu nedenle, sistemler ve sentetik biyoloji, Leishmania model sisteminde hassas tıbbın geliştirilmesi için model tabanlı bir genetik mühendisliği platformu sağlayabilir.
M1 fenotipi, inflamatuar sitokinlerin ve metabolik yolların üretiminin parazit eliminasyonunu sinerjik olarak arttırdığı immüno-metabolik sinyal ağlarının ekspresyonu ile işaretlenir. M1 polarizasyonu, İnterlökin-12 (IL-12), interferon-gama (IFN-γ) ve Tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) gibi proinflamatuar sitokinlerin üretimini gösterir. M1 fenotipinde yüksek oranda zenginleştirilmiş metabolik yollar arasında glikoliz, pentoz fosfat yolu ve kesik trikarboksilik asit döngüsü (TCA döngüsü) bulunur5. Kesilmiş TCA döngüsü, parazit eliminasyon makinelerini artan süksinat ve sitrat seviyeleri yoluyla yönlendirir ve bu da NO3 üretimine rehberlik eder. SDHA ile süksinat birikimi, IL-1β8 üretimini indükleyen transkripsiyon faktörü hipoksi ile indüklenebilir faktör 1-alfa'nın (HIF-1α) aktivasyonuna yol açar. M2 fenotipinde, İnterlökin-10 (IL-10), Transforme edici büyüme faktörü beta (TGF-β), İnterlökin-4 (IL-4) ve İnterlökin-13 (IL-13) gibi anti-inflamatuar sitokinlerin üretimi ile birlikte yağ asidi oksidasyonu, glutamin kullanımında artış ve glikozun artmış oksidatif fosforilasyonu gözlenir3. M2, ayırt edici bir özellik olarak uzamış mitokondri sergiler ve bu da enerji üretiminde verimliliğin artmasına yol açar. TCA döngüsünü beslemek için substrat olarak yağ asitleri, glikoz ve glutamin kullanırlar, böylece parazit büyümesini ve çoğalmasını teşvik etmek için daha yüksek oranda oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretirler9. Kesilmiş TCA yoluyla süksinat birikiminden sorumlu SDHA enzimi, yalnızca NO üretimini teşvik etmekle kalmaz, aynı zamanda elektron taşınması yoluyla süksinat bağımlı bir oksijen tüketimini de başlatır10. Leishmania ile enfekte makrofajlarda, SDHA 2.17 kat aşağı regüle edilir, bu da aerobik solunumun da aşağı regüle edilebileceğini gösterir11. Proinflamatuar sitokin aracılı NO üretimini indüklemek ve parazit eliminasyonunu teşvik etmek için süksinat tüketimini artırmak için SDHA ekspresyonu esastır.
Sentetik devre, uzay-zamansal düzeyde sağlıklı fenotipi geri yükleyebilecek iki durumlu bir salınım elde etmek için hastalıklı sistemi değiştirebilecek hassas hedefli tedaviler sunar. Sentetik devre iletimi ve ifadesi, sistemi dinamik ve sağlam hale getirir. Sentetik biyolojinin ilerlemesine katkıda bulunan önemli bir faktör, karmaşık mimarilerin ve özel işlevlerin oluşturulmasını sağlamak için genetik parçaları ve elementleri modüler bir şekilde bir araya getirme yeteneğinde yatmaktadır12. Geleneksel ekspresyon teknikleriyle ilişkili kısıtlamalar, tetrasiklin operon bazlı indüklenebilir plazmit sentetik devrelerinin ortaya çıkmasını teşvik etmiş, böylece plazmitin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine ve çeşitli hücre tipleri arasında kolay dağıtıma izin vermiştir13. Tetrasikline duyarlı baskılayıcı (TetR) proteini, bir dimer olarak mevcut olduğunda, tet operonuna (TetO) güçlü bağlanma afinitesi gösterir ve transkripsiyonu etkili bir şekilde baskılar. Bununla birlikte, ligandı olan doksisiklin (dox) etkileşimi üzerine, TetR yapısal bir değişikliğe uğrar, bu da TetO'dan ayrışmasına neden olur ve sonuç olarak transkripsiyonun engellenmeden ilerlemesine izin verir. Bu devre, protein translasyon kontrolü14 sergileyebilir. Bu nedenle, tanımlanan metodoloji aracılığıyla, tasarlanan tetrasiklin operon tabanlı indüklenebilir plazmit sentetik devresinin pEGFP-N1 vektöründe SDHA'yı eksprese etmesi sağlandı. Devrenin dönüşüm verimliliğinin ve veriminin değerlendirilmesi, teslimatın yeterliliği hakkında içgörüler sağladı. Vektörün kısıtlama sindirimi yoluyla, klonlama verimliliğinin belirlenmesi doğrulandı. Ayrıca, Transfekte edilmiş hücrelerde doksisiklin dozuna bağlı yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu için Balb / c farelerinin peritoneal makrofajlarından türetilen transfekte edilmiş bir RAW264.7 fare makrofaj hücre hattı gözlenmiştir. Ek olarak, transfekte edilmiş hücrelerdeki parazit eliminasyon etkisi, sentetik devrenin bir ifadesi ile doğrulandı. Ayrıca, pro-inflamatuar sitokinlerin indüksiyonu ve ekspresyonu gözlendi, bu da sentetik devrenin işleyişi ile doğrudan ilişkili olan sentetik devre transfekte edilmiş ve indüklenmiş hücrelerde enfeksiyon zaman noktasında bir artış yoluyla yönlendirildi.

<table><tbody><tr><td>10 & mu; L uçları</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X kısıtlama tamponu</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Kısıtlama sindirimi</td></tr><tr><td>1 mL uçlar</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>1 mL tüp</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &; L ipuçları</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 şişe</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>4 ',6-diamidino-2-fenilindol</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>nükleer boyama</td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60mm plakalar</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt Camgöbeği / Turuncu Yükleme tamponu</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td> AGE 96 kuyulu lamel alt plakası <td>için numunelerin yüklenmesi</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>Konfokal görüntüleme ve transfeksiyon için</td></tr><tr><td>96 kuyulu mikro test plakası düz tabanlı kuyular</td><td>AGE için Tarson</td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz jel elektroforez düzeneği</td><td>GeNei</td><td>93</td><td>için AGE</td></tr><tr><td>Bakteriyel laminer akış</td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120765</td><td>Dönüşüm için</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Hücre kültürü laminer hava akışı</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>Genetix</td><td>90020</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>Hücre yayıcı</td><td>Fischer </td><td></td> 1.5 mL tüpler için Bilimsel 12822775 <td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td></td><td>50</td> mL şahin için Eppendorf EP5404000537 <td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>RNA izolasyonu için ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Chlorofrom</td><td>Fischer Scientific</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü ThermoFischer</td><td>Scientific</td><td>3110</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>için Küvet</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td>Plazmit konsantrasyonunun tahmini</td></tr><tr><td>CYTIVA IQ 500 jel görüntüleyici</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>AGE için DEPC</td></tr><tr><td>TEDAVI EDİLMİŞ H2O 1000 ML</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>RNA izolasyonu için</td></tr><tr><td>Doksisiklin</td><td>Merck</td><td>33429</td><td>Transfekte edilmiş hücrelerin indüksiyonu için</td></tr><tr><td>Kuru ısıtma bloğu</td><td>Labnet</td><td></td><td>Restriksiyon enzimlerinin transformasyonu ve inaktivasyonu için</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı</td><td>Ulusal hücre bilimi</td><td></td> merkezi <td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>AGE için</td></tr><tr><td>Etilendiamin tetraasetik asit</td><td>Fischer Scientific</td><td>12635</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Evos parlak alan mikroskobu</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td> <td>sentetik devrenin inşası için</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>FV31S-SW yazılımı</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Görüntü elde etme</td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>Transfeksiyon için</td> <td>1563411</td></tr><tr><td>Klonlama için Gibson montaj yöntemi</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>Sentetik devre yapımı</td></tr><tr><td>Graphpad prizma</td><td>Graphpad</td><td></td><td>İstatistiksel analiz</td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>cDNA sentezi için</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4368814</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>13825</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>Dönüşüm ve koloni seçimi için</td></tr><tr><td>Luria Bertini suyu</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td>E.coli</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td> kültürü için <td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Mikro Filtre Dikey Laminer Hava Akışı</td><td>Mikrofilt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Hızlı 8 Tüplü Şerit,</td><td>qRT-PCR için</td>0.1 mL <td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td></tr><tr><td>MicroAmp Optik 8 Kapaklı Şeritler</td><td>qRT-PCR</td><td>için ThermoFischer Scientific</td><td>4323032</td></tr><tr><td>Mikrodalga fırın</td><td>LG</td><td>MC-7649DW</td><td>AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 için (IFN-&gama;)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman probları</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman probları</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman probları</td></tr><tr><td>Fare ELISA Kiti ELISA Kiti IL-10</td><td>ELISA Fare için ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Kiti IL-12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td> Dokunmatik Ekranlı <td>ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky için + & mu; </td><td>ELISA</td>MX-M Mikroplaka Karıştırıcılar için Drop Plate <td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td></tr><tr><td>96 kuyulu Hücre Kültürü Plaka Karıştırıcı Ayarlanabilir 0-1500 rpm Laboratuvar Çalkalayıcı Karıştırıcı</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi Sentetik</td><td>devre inşası için</td>bilgi <td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer odası</td><td>Marienfeld superior</td><td>640010</td><td>Hücre sayımı için</td></tr><tr><td>Havalandırmasız 25cm2 şişe</td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Paraziti kültürlemek için</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>Kısıtlama enzimi</td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Biyotasarım</td><td>1QIA</td><td>Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 yazılımı</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Görüntü işleme</td></tr><tr><td>Olympus FV 3000</td><td>Olympus</td><td></td><td>Konfokal görüntüleme için</td></tr><tr><td>OPTI-MEM ortamı</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>ortamı Transfeksiyon</td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vektörü için sentetik devre ile klonlanmış</td><td>Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin</td><td>ThermoFischer Bilimsel</td><td>15070063</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>Polietilenimin</td><td>Transfeksiyon için</td><td>MERCK</td><td>764965</td></tr><tr><td>Potasyum Asetat</td><td>Fischer Bilimsel</td><td>YBP364500</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP366</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Güç kaynağı paketi</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>AGE için</td></tr><tr><td>Standart Biyolojik parçaların</td><td>Kayıt Defteri https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td>sentetik devre</td></tr><tr><td>inşası için RNAiso Plus</td><td>Takara</td><td>38220090</td><td>RNA izolasyonu için</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFischer Bilimsel</td><td>12091021</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Ulusal hücre bilimi</td><td></td> merkezi <td>Parazit kültürü için</td></tr><tr><td>Shaker inkübatörü</td><td>REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>E.coliSodyum klorür kültürlemesi için</td></tr> <tr><td></td><td>Qualigens</td><td>Q27605</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Fischer Scientific</td><td>15895</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibasic</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>Tampon / Reaktif hazırlık</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Plazmit konsantrasyonunun tahmini</td></tr><tr><td>Spin win</td><td>Trason</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StepOne plus Real Time PCR sistemi</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>272006777</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>StepOne yazılım sürümü 2.3</td><td>için Yaşam teknolojileri</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X) için, AmpErase UNG yok</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>Tinker hücresi</td><td></td><td></td><td>Sentetik devre yapımı ve simülasyonu</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA merdiveni</td><td>AGE için</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Tris-asetat-EDTA</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>Tampon / Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Hücre sayımı için</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Kısıtlama enzimi</td></tr></tbody></table>

konakçıya yönelik tedavileri İlerletmek için enfeksiyonda İmmünometabolik devreler

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

İmmüno-metabolizma, leishmaniasis'in ilerlemesinde çok önemli bir belirleyicidir. Sentetik biyoloji temelli yaklaşım, leishmaniasis'i tetikleyen konakçı ile ilişkili faktörleri hedef alan terapötik müdahaleye yönelik bir adım olarak büyük ilgi görmüştür. Sentetik biyoloji, biyolojik sistemleri hassas bir şekilde modüle etmek ve hücrelere yeni işlevler kazandırmak için genetik bileşenlerin ortogonal ve modüler bir şekilde mühendisliğini gerektirir. Sunulan çalışmada, indüklenebilir tetrasiklin kontrollü (TetON) bazlı bir sentetik devrenin geliştirilmesi için sistematik bir boru hattının aydınlatılması, hücre içi Leishmania parazitlerinin ortadan kaldırılmasını kolaylaştırmak için terapötik bir ajan olarak süksinat dehidrojenazın verilmesini amaçlamıştır. Ana hatlarıyla belirtilen protokol, sentetik bir devrenin tasarımını ve müteakip doğrulamasını açıklar. Önerilen strateji aynı zamanda sentetik devrelerin plazmit omurgasına bir dağıtım aracı olarak dahil edilmesine odaklanmaktadır. Ek olarak, sentetik devrelerin iletimi için poliks bazlı nano parçacıklar kullanan dağıtım makineleri, hücresel morfolojiden ödün vermeden murin makrofaj hücre hatlarında kullanıldı. Yöntemin standardizasyonu, transfekte edilmiş hücrelerin seçilmesi ve sentetik devre ekspresyonu için optimal indüksiyon konsantrasyonunun belirlenmesi için yapılmıştır. Gözlemler, enfekte hücrelere kıyasla transfekte edilmiş hücrelerde hücre içi parazit yükünde belirgin bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. Pro-inflamatuar sitokinler, parazit eliminasyonunu teşvik etmek için bir mekanizma olarak sentetik devre transfekte edilmiş ve indüklenmiş hücrelerde enfeksiyon sonrası eksprese edildi. Bu, hastalığın ilerlemesi ile ilişkili konakçı faktörleri hedef alarak leishmaniasis'te güçlü bir yaklaşım olarak sentetik biyoloji temelli yöntemin altını çizmektedir.

Sentetik devreyi ifade etmek için sentetik devreyi oluşturan genetik parçaların düzenlenmesi (Şekil 1A)'da gösterilmiştir. Karşılık gelen parçalar, Şekil 1B'de gösterilen ortogonal ve modüler bir şekilde pEGFP-N1 vektöründe klonlandı. Sentetik devrenin simülasyonu, hem SDHA'da hem de tetrasiklin baskılayıcısında salınım dinamiklerini ortaya çıkardı. Bu gözlem, periyodik dalga fonksiyonları ile karakterize edilen karşılıklı bir ifade modeli önermektedir. SDHA konsantrasyonundaki artış, doksisiklin indüksiyonuna bağlanabilirken, TetR ekspresyonu, azalan doksisiklin seviyelerinden kaynaklanabilir (Şekil 1C). İn silico olarak gözlemlenen SDHA ve TetR'nin indüklenebilir salınım ekspresyonu göz önüne alındığında, pEGFP-N1 plazmit vektörü aracılığıyla sentetik devrenin verilmesi için bir strateji tasarlanmış ve uygulanmıştır.
Çalışma için tanımlanan iGEM parçaları arasında sırasıyla TetO için BBa_K1493803, Kozak dizisi için BBa_K4344028, TetR için BBa_C0040 ve P2A için BBa_K1537016 yer almaktadır. SDHA için NCBI katılım kimliği NM_025848'dir. Bu bileşenler, toplam 1317 baz çiftini kapsayan doksisiklin ile indüklenebilir bir TetON sentetik devresi oluşturmak için bir araya getirildi (Ek Dosya 1). TetO, bir DNA düzenleyici eleman olarak işlev gördüğünden, dizisi çevrilmedi. 5' TetR'den P2A'nın 3' ucuna kadar uzanan, SDHA'nın akış aşağısında konumlandırılan Kozak dizisinin aşağı akışındaki dizi, translasyonun in silico doğrulaması için seçildi. Gözlem, tüm dizi uzunluğu boyunca kesintisiz çeviri sağlayan dahili durdurma kodonlarının yokluğunu ortaya çıkardı (Ek Dosya 2). 1317 bp içeren sentetik bir devrenin düzenleyici parçaları, EGFP'nin 5' yukarısında olan NotI ve XhoI kısıtlama bölgeleri arasına yerleştirildi (Şekil 1B). Sıralama sonuçları, ekleme dizisinin plazmidde klonlandığını vurgular (Ek Dosya 3).
E. coli DH5α suşuna bir immüno-metabolik devrenin sokulması, bakteriyel transformasyon sırasında seçici bir belirteç olarak kullanılan antibiyotik olan kanamisine direnç gösteren dönüştürülmüş kolonilerin büyümesine yol açtı. Seçim plakasında bol miktarda transforme olmuş koloni varlığı daha yüksekti, bu da yetkin hücrelerin, kullanılan transformasyon protokolünün verimliliğinin bir göstergesi olan yüksek bir dönüşüm potansiyeli sergilediğini gösteriyor (Şekil 1D).
Tek bir koloni izole edildi ve plazmidin izolasyonu için kanamisin ile desteklenmiş 10 mL LB içinde tohumlandı. 10 mL'lik bir kültürden elde edilen plazmit verimi Tablo 1'de detaylandırılmıştır. Bu prosedür için plazmit izolasyonu için standart bir yöntem kullanıldı. Tampon çözeltileri, plazmit izolasyonundan bir gün önce taze olarak hazırlandı ve inkübasyon koşulları, plazmit verimini en üst düzeye çıkarmak için optimize edildi. Elde edilen plazmit konsantrasyonu 1 μg/μL'yi aştı, 260/280 ve 260/230 oranları sırasıyla 1.8 ve 2.0'ı aştı. Bu bulgular, izole edilen plazmitlerin yüksek saflıkta olduğunu ve proteinler, EDTA, karbonhidratlar ve fenol gibi kirleticilerden yoksun olduğunu göstermektedir.
İzole edilmiş sentetik devre için elektroforetik hareketlilik kayması değerlendirildi. Restriksiyon sindirimi, sentetik devrenin yerleştirildiği restriksiyon bölgeleri olduğu için NotI ve XhoI restriksiyon enzimleri kullanılarak gerçekleştirildi. % 1 agaroz jel üzerinde, 1500 bp'ye yakın bir bant ve 4 kb ile 5 kb arasında bir bant gözlendi. Kesici uç boyutunun 1317 bp olduğu göz önüne alındığında, 1500 bp'deki bant muhtemelen kesici uca karşılık gelir. pEGFP-N1 vektörünün boyutu 4,7 kb'dir. Bu nedenle, 5 kb'ye yakın bandın pEGFP-N1 vektörü olduğu varsayılır. Sonuç olarak, dağıtım vektörü içinde tam ve sağlam bir sentetik devrenin mevcut olduğuna dair bir çıkarım yapıldı. Ek olarak, sindirilmemiş bozulmamış sentetik devre için yaklaşık 6 kb'lik bir bant tespit edildi, bu da pEGFP-N1 vektörünün plazmit vektörü içinde yaklaşık 1.3 kb'lik bir ek barındırdığını gösteriyor (Şekil 1E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg"> Şekil 1: Sentetik devrenin tasarımı ve doğrulanması. (A) Genetik parçaların ve düzenleyici bileşenlerin bir araya getirilmesiyle sentetik devrelerin temsili. (B) SDHA ve TetR'nin 100 zaman biriminde periyodik ifadesini gösteren deterministik simülasyon grafiği. (C) Kanamisine dirençli E. coli DH5α'nın sentetik devre dönüştürülmüş kolonileri. Birim, deterministik bir simülasyon olduğu için 100 zamanlı bir birimdir. (D) NotI ve XhoI kısıtlama enzimleri kullanılarak bozulmamış ve kısıtlama sindirilmiş sentetik devrenin agaroz jel elektroforezi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plazmit konsantrasyonu (μg/mL)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr><tr><td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr><tr><td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr><tr><td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Plazmit izolasyonundan sonra elde edilen sentetik devre yapısının verimi. Tablo, μg/mL cinsinden plazmit konsantrasyonunu, 260/280 ve 260/230 oranlarını göstermektedir.
Kontrol ve enfekte hücrelerde, gözlenen floresan yoğunluğu GFP için düşüktü. Bununla birlikte, sentetik devrenin 1:1 oranında plazmit ve PEI ile 500 μg/mL G418 ile transfeksiyonu ve 1 μg/μL dox ile indüksiyonunun IMT hücrelerinde yüksek GFP ekspresyonunu indüklediği gözlenmiştir. 6 saatlik IMTI hücrelerinde, GFP ekspresyonu IMT örneğinden daha düşük olmasına rağmen, GFP ekspresyonu da önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 2A, B). Ayrıca, 12 saat IMTI, 18 saat IMTI ve 24 saat IMTI örneklerinde GFP ekspresyonunda bir artış gözlendi. Bu artış, konut paraziti17 tarafından makrofajlarda daha yüksek metabolik değişimlere neden olabilecek enfeksiyon zamanındaki bir artışa bağlı olabilir. Hücre içi SDHA seviyeleri, enfeksiyon zamanındaki artışa bağlı olarak etkilenebilir18. Bu IMTI örneklerine dox eklendiğinden, sentetik devreler yoluyla SDHA seviyeleri artmış olabilir, böylece SDHA ekspresyonunda bir artışa yol açmış olabilir.
Makrofajlardaki konut parazitlerinin sayısını belirlemek için DAPI boyaması yapıldı. 6 saat L. majör enfekte makrofajlarda, gözlenen hücre içi parazit sayısı makrofaj başına 6 hücre idi, bu da makrofaj başına 1-2 hücre içi parazit içeren 6 saatlik IMTI örneğine kıyasla daha yüksektir. Transfeksiyon ve dox indüksiyonundan sonra, enfeksiyonun farklı zaman noktalarında hücre içi parazit yükünde önemli bir azalma gözlenmiştir (Şekil 2C). Gözlemler, sentetik devrelerin SDHA ekspresyonunu uyararak parazit ortadan kaldırıcı etkilere sahip olabileceğini düşündürdü.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg"> Resim 2: Konfokal lazer tarama mikroskobu. Kontrol, enfekte, IMT ve IMTI örneklerinin görüntüleri. (A) Kontrol, 6 saat enfekte ve IMT için 50 μm, 6 saat IMTI için 20 μm, 12 saat IMTI, 18 saat IMTI, 24 saat IMTI için 10 μm ölçek çubuğu ile tüm deneysel numunelerde GFP'nin ekspresyon analizi. Kullanılan kanallar DIC, DAPI, GFP ve tüm kanalların birleştirilmiş görüntüleriydi. (B) GFP ekspresyonu için tüm deneysel örneklerin (n=3) Tukey'in düzeltme testi ile tek yönlü ANOVA (p &lt; 0.05 anlamlı kabul edilir) Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. (C) (A)'dan (n=3) alınan örnekler için 100 makrofaj hücresinde parazit yükünün Tukey düzeltme testi ile tek yönlü ANOVA analizi yapıldı (p &lt; 0.05 anlamlı kabul edilir). Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tüm örneklerin ortamında IL-10 ve IL-12 seviyelerinin saptanması, IL-10 ve IL-12 konsantrasyonunun enfeksiyondan 6 saat sonra en yüksek olduğunu ve 24 saatlik enfeksiyon sonrası sitokin seviyelerinde aşağı regülasyon olduğunu ortaya koydu. Sentetik devrelerin transfeksiyonu ve indüksiyonu üzerine IL-10 ve IL-12 seviyelerinde anlamlı bir fark yoktu. Ayrıca, IMTI zaman noktası örneklerinde IL-10 ve IL-12 seviyelerinde anlamlı olmayan bir fark vardı (Şekil 3). 6 saatlik enfekte numunenin IL-10 ve IL-1219,20 ekspresyonunu gösterdiği bildirilmiştir, IL-10 ve IL-12'de anlamlı olmayan bir fark gözlemlemek, sentetik devrenin diğer sitokinler üzerindeki etkisini araştırmamızı sağlamıştır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg"> Şekil 3: IL-10 ve IL-12'nin ELISA'sı, farklı örneklerin ortamındaki salgı seviyelerini belirlemek için. Örnekler (n = 2) kontrol, 6 saat enfekte, 24 saat enfekte, IMT, 6 saat IMTI, 12 saat IMTI, 18 saat IMTI, 24 saat IMTI'yi içerir. İki yönlü varyans analizi ile Tukey düzeltme testi analizi yapıldı (p &lt;.05 anlamlı kabul edildi). Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
6 saatlik enfekte, IMT ve 24 saatlik IMTI örneklerinde TNF-α, IFN-γ ve TGF-β transkript seviyelerinin saptanması, enfeksiyon ve IMT örneklerine kıyasla 24 saatlik IMTI örneğinde TNF-α'da 2,5 kat arasında anlamlı bir artış gözlendiğini ortaya koymuştur (Şekil 4). 24 saatlik IMTI örneğinde, enfeksiyon ve IMT örneklerine kıyasla IFN-γ seviyelerinde 35 kat artış gözlendi. TGF-β seviyeleri, 24 saatlik IMTI numunesinde 1.5 kata kadar önemli bir artış göstermelerine rağmen, nispi kat değişikliği TNF-α ve IFN-γ ile karşılaştırıldığında daha düşüktü, bu da pro-inflamatuar sitokinlerin 24 saatlik IMTI numunesinde önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini düşündürdü.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg"> Şekil 4: sitokinlerin qRT-PCR analizi. (A) TNF-α, (B) IFN-γ ve (C) TGF-β 6 saat enfekte, IMT ve 24 saat IMTI örnekleri için (n = 2). Tek yönlü varyans analizi ile Tukey düzeltme testi yapıldı (p &lt; 0.05 anlamlı kabul edildi). Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Sentetik devreyi oluşturmak için bir araya getirilen genetik parçaların nükleotid dizisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: TetR, P2A ve SDHA'yı ifade eden çevrilmiş sentetik devre dizisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: pEGFP-N1 plazmidinde klonlanmış sentetik devrenin dizileme sonucu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, tetrasiklin kontrollü tabanlı indüklenebilir sentetik devrenin tasarlanması, inşası ve teslimi için bir protokol sunulmaktadır. Sentetik devrelerin parazit eliminasyonu ve sitokin ekspresyonu üzerindeki etkisi, sunulan boru hattının kanalize edilmesiyle incelenebilir. Bu protokol, bulaşıcı hastalıklarda sentetik devre tabanlı terapötikler üzerinde çalışan araştırmacılar için geçerlidir.

Konakçıya Yönelik Tedavileri İlerletmek için Enfeksiyonda İmmünometabolik Devreler

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

immunometabolic-circuits-infection-for-advancing-host-directed

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Monositler, aktive edildiğinde glikolitik metabolizmaya dayanan insan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ayrılmaz bileşenleridir. Taze tam kandaki toplam monositler ve monosit alt popülasyonları tarafından glikoz taşıyıcı ekspresyonunu ve glikoz alımını ölçmek için bir akış sitometrisi protokolü tanımladık.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Bu protokol, Listeria monocytogenes EGD suşu ile (L. monocytogenes) C57BL / 6J fareleri aşılamak için ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, doğal katil T (NKT) hücreler tarafından interferon-y (IFN-γ) tepkilerini ölçmek açıklamaktadır ve adaptif T sonrası enfeksiyon lenfosit. Bu protokol ayrıca patojen modifiye LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra farelerde hayatta kalma çalışmaları yürütmek açıklamaktadır.

Deneysel Enfeksiyon<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak

Bu iletişim kuralı ex vivo karakterizasyonu immunomodulators, kızamık virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama kullanarak ifade oncolytic virüslerin ve nesil için ayrıntılı bir iş akışı açıklar. Uygulama ve uyarlama diğer vektör platformları ve transgenes klinik çeviri için roman immunovirotherapeutics gelişimi hızlanır.

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Biz bir insan periferik kan mononükleer hücre (PBMC) - çeviriimmün-onkoloji araştırma için insanlaşmış ksenogreft fare modeli dayalı açıklar. Bu protokol, I-O terapi değerlendirmesi için benzer modellerin oluşturulması ve karakterizasyonu için genel bir kılavuz görevi görebılabilir.

Çevirisel İmmüno-onkoloji (I-O) Araştırma için İnsani Periferik Kan Mononükleer Hücre (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Modeli

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Tam kan bazlı immünolojik testler, tanı ve araştırma amaçları için antijene özgü bağışıklığı analiz etmek için kolay ve kaynak açısından verimli bir araç sağlar. Bu makale, pediatrik hastalar ve küçük hayvanlar için düşük hacimli bir versiyon da dahil olmak üzere, mantar ve viral patojenlere karşı konak bağışıklığının kapsamlı analizi için ikili ko-stimülasyonlu optimize edilmiş bir tam kan bazlı protokol sağlar.

Fungal ve Viral Patojenlere Karşı Konak Bağışıklığının Antijene Özgü Analizi için İkili Ko-stimülasyonlu Tam Kan Testi

Bu rapor, otomatik bir slayt boyayıcı üzerinde multipleks immünofloresan (mIF) testleri için otomatik bir protokolü açıklar. Translasyonel araştırmalarda çok sayıda doku slaytında özel mIF tahlilleri için ideal olan standart yüksek verimli doku otomatik boyalayıcıları ve tam slayt floresan görüntüleyiciler üzerinde uzamsal proteomiklerin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterir.

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Mevcut protokol, önceden tedavi edilmiş tümör hücreleri ile allojenik bir ko-kültür sisteminde insan T hücresi stimülasyonunun ex vivo analizine izin veren deneysel bir iş akışını açıklamaktadır.

Önceden İşlem Görmüş Tümör Hücrelerinin Allojenik Ko-Kültür Ortamında İnsan T Hücresi Aktivitesinin Analizi

Bu makalede, hücresel öz-montaj hücre kökenli doku halkaları oluşturmak için çok yönlü bir yöntem özetlemektedir. Düz kas hücreleri içine numaralı seribaşı halka şeklinde agaroz kuyuları agrega ve 7 gün içinde sağlam bir üç boyutlu (3D) dokular oluşturmak için sözleşme. Milimetre ölçekli doku halkaları mekanik test için elverişli ve doku montaj için yapı taşları olarak hizmet.

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Bu protokol hücreleri izleyebilirsiniz özel tasarımlı electrotactic odalarında 2D ve 3D ortamlar oluşturmak için kullanılan yöntemler,...

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Keşfedin, Leishmania major enfeksiyonunda immünometabolik devreleri sentetik devrelerle modüle ederek parazit eliminasyonunu ve sitokin ekspresyonunu nasıl iyileştirebilirsiniz. Bu yöntem, enfeksiyon hastalıkları için yeni immünoterapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olur.

Konakçıya Yönelik Tedavileri İlerletmek için Enfeksiyonda İmmünometabolik Devreler

Daha fazla video keşfet