İnsan Beyni Organoidlerinin Kütle Spektrometresi Kullanılarak Moleküler Görüntülenmesi

Gelişmekte olan insan beyninin metabolomiklerini inceledik. İn vivo araştırmak için bir meydan okuma. Bunu ele almak için in vitro beyin organoidleri modelleri ve gelişmiş özel metabolomik teknikler kullanıyoruz.

Organoid karakterizasyonu için son yıllarda ileri ana teknoloji tabanlı teknolojiler hızla uygulanmıştır ve bu eğilimin devam etmesi beklenmektedir. Kütle spektometrisi görüntüleme veya MSI kullanan son metabolomik çalışmalar, nadir durumlar ve kişiselleştirilmiş tıptaki uygulamalar da dahil olmak üzere insan gelişimi ve hastalığının moleküler mekanizmalarını anlamada organoid modellerin avantajlarını göstermektedir. Moleküler görüntüleme sırasında organoidlerin moleküler bütünlüğünü ve morfolojisini korumak zordur, hassas numune işleme ve hazırlama gerektirir. Bunu ele almak için, beyin organoidlerinin yüksek çözünürlüklü çoklu MALDI MSI analizi için özel bir teknik geliştirilmiştir. Güvenilir yüksek kaliteli veriler sağlamak için görüntüleme koşulları, matrisülasyon ve doku koruma arasındaki kütle spektrumunu optimize eder. Bu kapsamlı protokol, yüksek çözünürlüklü MSI potansiyelini gösterir ve araştırmacılara organoidlerin metabolomik topografyasını ayrıntılı olarak araştırmak için bu teknolojiyi tam olarak kullanmaları için ihtiyaç duydukları kaynakları sağlar.

Araştırmamız, beyin organoidlerindeki belirli hücre tipleriyle ilişkili metabolit olan nörojenez hakkındaki anlayışımızı duyuracaktır. Bu ayrıntılı metabolik profilleme, sadece bu metabolitlerin beyin gelişimindeki kuralını aydınlatmakla kalmayacak, aynı zamanda nörogelişimsel bozuklukları taklit eden terapötik müdahaleler için potansiyel hedefi de belirleyecektir.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen beyin organoidlerini içeren şişeyi inkübatörden çıkarın. Geniş delikli uçlar kullanarak, organoidleri şişeden tabağa aktarın. Organoidleri kalsiyum klorür içermeyen DPBS ile üç kez yıkayın ve ortamı durulamak için magnezyum klorür kullanın. Ardından, DPBS'deki tuzları çıkarmak için damıtılmış suyla hızlı bir şekilde durulayın. Soğuk balık derisinden elde edilen 10 miligram jelatini 100 mililitre DPBS içeren bir şişeye ekleyin. Karışımı iki saat boyunca 70 ila 80 santigrat derecede ısıtın ve karıştırın. Ardından, kabarcıkları çıkarmak için çözeltiyi 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre taşıyın. Küçük bir pipet ucu kullanarak organoidi plastik bir kalıbın ortasına sabitleyin. %10'luk jelatin gömme solüsyonunu, organoid tamamen daldırılana kadar kalıba yavaşça dökün. Kalıbı kuru buz üzerinde soğuk %100 etanol içeren bir Petri kabına yerleştirin. Tamamen donduğunda, rengin katı beyaza dönüşmesiyle kanıtlandığında, organoid jelatin bloğunu Petri kabından çıkarın. Bloğu alüminyum folyoya sarın veya teneke bir kaba koyun. Kriyo bölümü için hazır olana kadar bloğu kapatın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kriyo kesiti için, organoid içeren plastik blokları 10 ila 15 dakika boyunca eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış kriyo odasına yerleştirin. Daha sonra kriyotomda, organoidleri 14 mikrometrelik bölümlere ayırın ve Kütle Spektrometresi Görüntüleme veya MSI için indiyum kalay oksit kaplı cam slaytlara monte edin. Slaytları görüntülemeye kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, beyin organoid bölümleriyle monte edilmiş indiyum kalay oksit kaplı slaytı eksi 80 santigrat dereceden çıkarın. Yüzeydeki atmosferik suyun yoğunlaşmasını en aza indirmek için slaytı 20 dakika kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, ısıtılmış bir pnömatik püskürtücü kullanarak, organoid bölümlere %70 metanol içinde mililitre NEDC başına 10 miligram püskürtün. Beyin organoid metabolitlerini görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü bir MALDI MSI platformu elde etmek için, çift iyon hunisi arayüzlü iyon kaynağını bir kütle spektrometresine monte edin. 349 nanometre dalga boyuna, bir kilohertz tekrarlama oranına ve yaklaşık 1,3 ila 1,4 mikro jul darbe enerjisine sahip bağlı bir Q anahtar frekansı üçlü ND lazer kullanın. Aşırı örneklemeyi önlemek için lazeri yaklaşık 15 mikrometre çapında bir nokta boyutuna odaklayın. Numuneyi MALDI enjektör aşamasına takın. Yüksek basınçlı iyon hunisini 7,4 ila 7,5 Torr'da ve düşük basınçlı iyon hunisini 1,6 ila 1,8 Torr'da çalıştırın ve bakımını yapın. 780 voltta 191 kilohertz radyo frekansı voltajlarını tepeden tepeye ve 604 voltta 80 kilohertz'i yüksek basınçlı iyon hunilerine tepeden tepeye uygulayın. Düşük kütle aralığındaki küçük metabolitlere karşı duyarlılığı artırmak için, MALDIDMSI kaynağının düşük ve yüksek basınç hunisindeki RF genliklerini sırasıyla yaklaşık% 20 ve 15'e düşürün. Kütle çözünürlüğünü 70.000 olarak ayarlayın. Ardından alanı ve piksel başına 25 mikrometre piksel boyutunu seçin. Ana şarj aralığını hem negatif hem de pozitif iyon modlarında 80 ila 900 arasında ayarlayın. Otomatik kazanç kontrolünü kapalı tutun, ardından enjeksiyon süresini 250 milisaniyeye ayarlayın ve profil modunda furier dönüşümü kütle spektrumları elde edin. Kütle spektrometresi spektral verilerini doğrudan uyumlu yazılıma aktarın. Evrişim algoritmasını kullanarak temel düzeltme yapın ve toplam iyon sayısını kullanarak verileri normalleştirin. Ana yük oranı görüntülerini kütle kusuru ve piksel kapsamına göre ayırt etmek için 0,01 veya 5:00 PPM'ye eşit bir delta ana şarjı bölme genişliği kullanarak ham veri dosyalarından iyon görüntülerinin özellik listesini oluşturun. Tek tek metabolit iyon türlerinden sahte renk veya RGB görüntüler oluşturun. Metabolitleri tanımlamak için MALDI MSI'dan elde edilen ham veri dosyalarının ana yük oranı listesini İnsan Metabolom Veritabanına yükleyin. 60 günlük insan beyni organoidlerinde Krebs döngüsü ile ilgili metabolitler, balık jelatini gömülü MSI kullanılarak mekansal olarak haritalandı.