Name: Retinal Organoidlerin Mikroglia ile Birleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Keşfedin retinal organoidler ve mikroglia ile ortak kültür modeli oluşturmayı. Bu yöntem, retina dejeneratif hastalıkların patogenezini anlamak ve tedavi stratejileri geliştirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82101145) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (Z200014) tarafından desteklenmektedir.

Bu çalışma, Capital Medical Üniversitesi, Pekin Tongren Hastanesi Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. HESC'nin hücre hattı H9, WiCell Araştırma Enstitüsü'ndendi. Deneyden önce hücre kültürü ortamını oda sıcaklığında (RT) 30 dakika önceden ısıtın.
1. İnsan mikrogliasının oluşumu
<ol><li>Hücre yoğunluğu %80-90'a ulaşana kadar hESC'leri kök hücre ortamında kültürleyin. Her kuyucuğa en az 1 x 106 hücre tohumlayın.</li>
	<li>Kök hücre ortamını aspire edin ve hücreleri 1x DPBS (1 mL / 6 oyuklu plakanın oyuğu) ile durulayın. Bir sonraki adım 2 x 107-1 x 108 hücre gerektirir. Yeterli değilse, aşağıdaki adımları uygulamak için 2-5 kuyucuklu hücreleri birleştirin.</li>
	<li>37 ° C'lik bir inkübatörde (1 mL / 6 oyuklu plakanın 1 mL / oyuğu) yaklaşık 5 dakika boyunca 0.5 mM EDTA çözeltisini kullanarak kök hücre kolonilerini ayırın.</li>
	<li>5 dakika sonra koloni morfolojisini kontrol edin. Koloni kenarları gevşek boşluklarla hafifçe kıvrıldığında, hücreler farklılaşmaya ve EDTA'yı aspire etmeye hazırdır. Değilse, hücreleri 37 ° C'de 1-2 dakika daha inkübe edin. 8 dakikadan daha uzun süre kuluçkaya yatırmayın.</li>
	<li>6 μL 10 mM ROCK inhibitörü Y-27632 çözeltisi ile 6 mL Ortam A (Tablo 1) kullanarak her bir oyuktaki hücreleri nazikçe durulayın. Hücreleri durulamaya yardımcı olmak için tabağın altına hafifçe vurun. Günü 0. gün olarak ayarlayın. NOT: Hücreleri pipetlemeyin. Hücreler ertesi gün embriyoid cisimcikleri (EB'ler) oluşturacaktır.</li>
	<li>24 saat sonra, EB oluşumunu doğrulamak için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. EB'leri 10 mL'lik bir pipet ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpe toplayın ve EB'lerin 5 dakika içinde dibe çökmesini bekleyin.</li>
	<li>Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve EB'leri 6 mL taze Ortam A ile yeniden süspanse edin ve bunları 6 oyuklu plakadan oluşan yeni bir düşük yapışma kuyusuna aktarın. 37 °C'lik bir inkübatörde kültür. NOT: 1. günde kuyu transferinin amacı, EB oluşumu sürecinde hücre büyümesinin durumunu etkileyebilecek çok sayıda ölü hücrenin etkisini azaltmaktır.</li>
	<li>Taze Orta A'yı 4. güne kadar her gün yenileyin (6 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu).</li>
	<li>4. günde, 10 cm'lik bir tabağı% 5 CO2, 37 ° C'lik bir inkübatörde en az 1 saat boyunca 3 mL% 0.1 balık jelatin çözeltisi ile kaplayın. NOT: Kaplama süresi 1 saatten az ise, aşağıdaki adımların gerçekleştirilmesi zordur.</li>
	<li>EB'leri 10 mL'lik bir pipet ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpe dikkatlice toplayın ve EB'lerin 5 dakika içinde dibe çökmesini bekleyin.</li>
	<li>% 0.1 jelatin çözeltisini çıkarın ve 10 cm'lik kabı 5-6 mL 1x DPBS ile bir kez durulayın. DPBS'yi çıkarın.</li>
	<li>EB'leri 15 mL santrifüj tüpte 15 mL Orta B (Tablo 1) ile nazikçe yeniden süspanse edin ve bunları kaplanmış 10 cm'lik tabağa aktarın. 1 hafta boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde kültür. NOT: İlk 7 gün içinde tabağı hareket ettirmeyin.</li>
	<li>49. güne kadar (15 mL / 10 cm tabak) haftada bir kez taze Orta B ile yenileyin ve hücreleri haftada bir kez mikroskop altında inceleyin. NOT: 49. günden sonra, kültür kabındaki süpernatantta birkaç salgı hücresi bulunabilir.</li>
	<li>Süpernatan hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri 2 mL taze Orta B ile yeniden süspanse edin ve 6 oyuklu plakadan oluşan yeni bir düşük yapışma kuyusuna aktarın. % 5 CO2, 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin. NOT: Önümüzdeki 7 gün içinde plakayı hareket ettirmeyin. Mikroglia, düşük yapışma kuyusunun dibine yapışabilir.</li>
	<li>56. günde, Orta C (Tablo 1) (2 mL / 6 oyuklu plaka) ile değiştirin. Mikroglia, düşük yapışma özelliğinin dibine iyi yapışır ve mikroskop altında dallanmış görünecektir. NOT: Orta C'yi her 3 günde bir değiştirerek (2 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu), mikroglia yaklaşık 15 gün boyunca Orta C'de yetiştirilebilir.</li>
</ol>2. İnsan RO'larının üretilmesi ve RO'ların mikroglia ile birlikte kültürlenmesi
<ol><li>Hücre yoğunluğu %80-90'a ulaşana kadar hESC'leri kök hücre ortamında kültürledi. Her kuyucuğa en az 1 x 106 hücre tohumlayın.</li>
	<li>Kültür hücresine Dispase (1 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu) ekleyin. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Dispase çözeltisini kuyudan aspire edin.</li>
	<li>Kuyuya Orta D (Tablo 1) (1 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu) ekleyin. Hücreyi 10 μL'lik bir pipetle küçük parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Tüm hücre parçalarını ve ortamı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde nazikçe toplayın.</li>
	<li>200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Hücreleri 200 μL soğuk matriste nazikçe yeniden süspanse edin. 1.5 mikrosantrifüj tüpünü 20 dakika boyunca bir inkübatöre taşıyın. Matris oda sıcaklığında (RT) katılaşacağı için hızlı çalışın. İnkübatörde 20 dakika sonra, matris katılaşacaktır.</li>
	<li>15 mL Orta D ile 10 cm'lik bir tabak hazırlayın. Orta D ile Matrisi tekrar süspanse edin ve Petri kabını hafifçe sallayın.</li>
	<li>Ardından, çanağı 5 gün boyunca bir kuluçka makinesine koyun. Plakayı hareket ettirmeyin. Günü 0. gün (RO) olarak ayarlayın. Hücreler 3 gün içinde yapışacaktır.</li>
	<li>5. günde (RO'lar) ve 10. günde (RO'lar), ortamı Orta D ile yenileyin.</li>
	<li>12. günde (RO'lar), ortamı çıkarın ve her yemeğe 5 dakika boyunca 3 mL Dispase ekleyin.</li>
	<li>Dispase'ı aspire edin ve 15 mL Orta E ekleyin (Tablo 1).</li>
	<li>Mikroglia hasadı: 56. günde (MG'ler), Orta C'yi nazikçe aspire edin, Accutase (6 oyuklu bir plakanın 1 mL / oyuğu) ekleyin ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Mikroglia hücrelerini 5 mL'lik bir pipet ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpe toplayın. Hücreleri RT'de 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı nazikçe aspire edin ve mikrogliayı 1 mL Orta E ile askıya alın. 12. günde sindirilmiş RO'lara mikroglia ekleyin. NOT: 12. günde (RO'lar), hücreler yapışkandır. 13. günde (RO'lar), hücreler Orta E'de asılı olarak bulunur. Ortam, 12. günden (RO'lar) 19. güne (RO'lar) sarıya dönerse, ortamı Orta E ile yenileyin.</li>
	<li>19. günde (RO'lar), plakayı hafifçe döndürerek organoidleri yemeğin ortasına toplayın. Medium E'yi nazikçe aspire edin ve medium'u Medium F ile yenileyin.</li>
	<li>Orta F ile organoidleri yeni bir süspansiyon kabına aktarın.</li>
	<li>Ortamı haftada bir kez değiştirin ve deneyler için organoidleri seçin.</li>
</ol>

Mikroglia ile Entegre Retinal Organoidler: Retina Hastalıklarının İncelenmesi İçin Bir Model

<ol><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).</li>
<li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+induction+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (170), e62298(2021).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+pu.1-+and+irf8-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).</li>
<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>O'koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+function+is+distinct+in+different+anatomical+locations+during+retinal+homeostasis+and+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration.</a> Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).</li>
<li>Margeta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+impairs+the+response+of+neurodegenerative+retinal+microglia+and+prevents+neuronal+loss+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma.</a> Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+innate+responses+in+microglia+derived+from+retinoblastoma+patient-specific+IPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs.</a> Glia. 72 (5), 872-884 (2024).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+microglia+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+empower+retinal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ.</a> Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).</li>
<li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruct+human+retinoblastoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstruct human retinoblastoma in vitro.</a> J Vis Exp. (188), e62629(2022).</li>
<li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPS-cell-derived+microglia+promote+brain+organoid+maturation+via+cholesterol+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer.</a> Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).</li>
<li>Usui-Ouchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+human+ipsc-derived+macrophage+progenitors+into+retinal+organoids+to+generate+a+mature+retinal+microglial+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche.</a> Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).</li>
<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+microglia-like+cells+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).</li>
</ol>

Yazarlar, bu çalışmanın tarafsızlığını etkileyebilecek herhangi bir üyelik, üyelik, hibe veya finansal holdingden haberdar değildir.

İnsan retinasının sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, retinal inflamatuar yanıtların mevcut anlayışı neredeyse hayvan modellerinden gelmektedir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için retinal organoidler farklılaştırıldı. Retinal organoid modellerin geliştirilmesi, hastalık modellemesi ve terapötik gelişim için insan retinasının karmaşıklığını özetlemeyi amaçlayan aktif bir araştırma alanı olmuştur. Birkaç çalışma, insan pluripotent kök hücrelerindenbaşarılı bir şekilde retinal organoidlerin üretildiğini bildirmiştir 1,2,12,13. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu, retina gelişimi ve hastalık patogenezinde çok önemli roller oynadığı bilinen mikroglia varlığından yoksundur. Son çalışmalar, mikroglia'yı retinal organoidlere veya beyin organoid modellerine entegre etmeye çalışmıştır 16,17,18, ancak ayrıntılı yöntem belirsizdir. Burada, her ikisi de aynı hESC hattından türetilen, erken aşamada mikroglia'nın retinal organoidlerle birlikte kültürlenmesi için ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz. Bazı çalışmalar, hayvan modelleri veya hücre kültürü sistemleri 7,8,9 kullanarak retina hastalıklarında mikroglianın rolünü araştırmış olsa da, burada sunulan ko-kültür modeli, mikroglia-retina etkileşimlerini ve bunların hastalık patogenezindeki etkilerini incelemek için fizyolojik olarak daha ilgili insan temelli bir sistem sunmaktadır.
Kritik adımlar, insan kök hücrelerinin hücre durumu ve mikroglia ve retinal organoidlerin farklılaşmasıdır. Mikroglia ve RO'lar adım adım ayırt edilmeli ve farklı aşamalarda doğru reaktifler ve çanak (doku kültürü ile muamele edilmiş tabak veya süspansiyon tabağı) kullanılmalıdır. Bu model, mikroglia'nın retina hastalıklarının ortaya çıkmasına nasıl katkıda bulunduğunu anlamamıza yardımcı olabilir. Gelecekteki ilaç taraması ve hastalık mekanizmalarına ilişkin araştırmalar için önemli etkileri vardır. Ancak, şu anda yayınladığımız yöntemlerin hala bazı sınırlamaları vardır. Mikroglia'nın farklılaşma süresinin uzaması ve uygun kriyoprezervasyon yöntemlerinin olmaması nedeniyle, ko-kültür için mikroglia ve retinal organoidlerin farklılaşması için zamanımızı akıllıca planlamalıyız.
Retinal organoidlere ek olarak, bağışıklık hücrelerinin diğer organoid modellere entegre edilmesinin de organoid gelişimini teşvik edebileceğine inanıyoruz. Bu nedenle, diğer organoid sistemlerin test edilmesi çok önemlidir. Tam organlar oluşturmak için çeşitli hücre tiplerinin ve organoidlerin entegrasyonu, gelecek için umut verici bir modeli temsil etmektedir.

İnsan retinasının sınırlı kaynağı olarak, insan kök hücrelerinin üç boyutlu (3D) retinal organoidlere farklılaşması, retinayı simüle etmek için umut verici bir in vitro modeli temsil eder1. Retinada fotoreseptörler, retinal ganglion hücreleri, bipolar hücreler, Müller hücreleri, yatay hücreler ve astrositler2 dahil olmak üzere farklı hücre tipleri içerir. Bu model, hem retina gelişim mekanizmalarının hem de retina hastalıklarının patogenezinin öykünmesini ve incelenmesini sağlar. Bununla birlikte, yönlü farklılaşma yöntemi nedeniyle, retinal organoidler, yolk kesesinden mikroglia ve mezodermden perivasküler hücreler gibi farklı germ katmanlarından kaynaklanan diğer birçok hücre tipinden yoksun olan nöroektoderm3'ten türetilmiştir 4,5,6.
Şu anda, retinitis pigmentosa7, glokom8 ve retinoblastoma9 gibi birçok retina hastalığının retinadaki mikroglia ile yakından ilişkili olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, uygun araştırma modellerinin olmaması nedeniyle, mikroglia ile bu hastalıklar arasındaki ilişkiyi gösteren spesifik mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Fareler retina hastalıklarını incelemek için uygun bir model olarak hizmet ederken, son çalışmalar fare ve insan mikrogliası arasında yaşam süresi, proliferasyon oranı ve insan homolog genlerinin yokluğu açısından önemli farklılıklar olduğunu vurgulamıştır10,11. Bu bulgular, fare modellerinden elde edilen sonuçların tamamen güvenilir olmayabileceğini ve mikroglia içeren insan retinal organoidlerinin oluşturulmasının önemini vurguladığını öne sürdü.
Son birkaç on yılda, retinal organoidlerin 3 boyutlu farklılaşması için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir12,13. Retinal organoidler içinde mikroglia'nın ko-kültür çalışmasını kolaylaştırmak için, yapışık kültürden süspansiyon kültürüne geçişi içeren bir farklılaşma yöntemi seçtik. Bu yaklaşım, mikroglia'nın retinal organoidlere başarılı bir şekilde dahil edilmesini ve en az 60 gün boyunca korunmasını sağlar14.

<table><tbody><tr><td>Acctuase</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07920</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM/F12</td><td>Termo</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CRX(M02)</td><td>abnova</td><td>H00001406-M02</td><td>Antikoru; üreticinin talimatlarına göre seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Abcam</td><td>ab5076</td><td>Antikoru; üreticinin talimatlarına göre seyreltme</td></tr><tr><td>B27</td><td>Ömrü Teknolojiler</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (1U/mL)</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM temel</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Termo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biyolojik Sanayi</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G7041-100G</td><td>Katı</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>H9 hücre hattı</td><td>WiCell Araştırma Enstitüsü</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>RD Sistemleri&nbsp;</td><td>203-IL-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-34</td><td>PeproTech</td><td>200-34-50UG</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matris</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>RD Sistemleri&nbsp;</td><td>216-MC-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit</td><td>Çözeltisi Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Kalem / strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kök hücre ortamı&nbsp;</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5990</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21985-023</td><td></td></tr></tbody></table>

retinal organoidlerin mikroglia ile birleştirilmesi

Assembling Retinal Organoids with Microglia

İnsan retinasının sınırlı erişilebilirliği nedeniyle, retina organoidleri (RO'lar), retina gelişim mekanizmasını ve retina hastalığının oluşumunu ortaya çıkarabilecek insan retina hastalığını incelemek için en iyi modeldir. Mikroglia (MG), retina ve merkezi sinir sisteminde (MSS) benzersiz yerleşik makrofajlardır ve önemli bağışıklık fonksiyonlarına hizmet eder. Bununla birlikte, retinal organoidler, farklılaşma kökenleri yumurta sarısı kesesi olduğu için mikrogliadan yoksundur. Bu retina hastalıklarında mikroglianın spesifik patogenezi belirsizliğini korumaktadır; Bu nedenle, mikroglia içeren bir retinal organoid modelinin kurulmasının gerekli olduğu ortaya çıkmaktadır. Burada, insan kök hücrelerinden türetilen mikroglia ile birlikte kültürlenmiş bir retinal organoid modelini başarıyla oluşturduk. Bu makalede, mikroglia ayrımı yapıldı ve daha sonra erken evrede retinal organoidlerle birlikte kültürlendi. Bağışıklık hücrelerinin dahil edilmesi olarak bu model, retina ve CNS ile ilişkili hastalıkların patogenezi ve tedavisi hakkında derinlemesine araştırmaları kolaylaştırmak için retina hastalığı modellemesi ve ilaç taraması için optimize edilmiş bir platform sağlar.

Retinal organoidler üretme prosedürü önceki çalışmamızdaaçıklanmıştır 15. Burada, mikroglia ve ko-kültür mikroglia ve retinal organoidlerin temsili sonuçlarını gösteriyoruz.
Burada, mikroglia farklılaşmasının her aşamasını gösteriyoruz (Şekil 1A). 0. gün, kök hücre kültürünün aşamasını temsil eder. Daha sonra kök hücreler sindirildi ve EB oluşumu için kültürlendi. İşlemin ilk 4 gününde hücreler EB'leri oluşturacaktır (Şekil 1B). Daha sonra, askıya alınan EB'leri yapışkan 10 cm'lik tabaklara aktarıyoruz. Yaklaşık 7 gün sonra, hücreler Şekil 1C'de gösterilene benzer. Kültür ilerledikçe, yapışık hücreler süpernatana hematopoietik progenitörler salgılar (Şekil 1D). Bu işlem yaklaşık olarak 45 gün sürmektedir. Bu noktada, hücreler süpernatanttan toplanabilir ve 6 oyuklu plakalara aktarılabilir. Önümüzdeki 7 gün boyunca, mikroglia olgunlaşacak (Şekil 1E) ve daha fazla deney için hazır hale gelecektir.
Retinal organoid farklılaşmasının 12. gününde, yapışık hücreler süspansiyon kültürüne sindirilir ve retinal organoidlere Orta E içeren mikroglia eklenir. Mikroglia retinal organoidlere göç edecektir. Mikroglia morfolojisini net bir şekilde gözlemlemek için, hESC'lere EGFP-lentivirus transfeksiyonu ekledik, bu da farklılaşmış mikroglia eksprese GFP'nin otofloresansa (Yeşil) sahip olmasını sağladı (Şekil 2A-C). Ayrıca, 50 gün boyunca farklılaşmadan sonra mikroglia ko-kültürlenmiş retinal organoidlerde immünofloresan testi ile fotoreseptör hücre belirteci CRX ve mikroglial hücre belirteci IBA1 kullanılarak mikroglia ile birlikte kültürlenen retinal organoidlerin doku yapısını inceledik (Şekil 2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67016/67016fig01.jpg"> Şekil 1: hESC'den türetilen mikroglia hücresinin şematik diyagramı ve zaman çizelgesi. (A) Protokol, hESC'lerin 6 oyuklu bir plakada çözülmesi ve geçirilmesi ile başlar. (B) Besiyeri A içeren homojen EB'ler kaplanmış bir tabağa aktarılır ve hematopoietik progenitörler 4-56. günlerde oluşur. (D,E) 56. günde, hücreli süpernatan toplanır (D) ve 63. günde (E) mikroglia oluşturmak için düşük yapışmalı 6 oyuklu bir plakaya aktarılır. Ölçek çubuğu: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/67016fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67016/67016fig02.jpg"> Şekil 2: Mikroglia ve retinal organoidlerin birlikte kültürü sırasında zaman çizelgesi boyunca temsili görüntüler. (A) EGFP-HESC'den türetilen mikroglia hücrelerinin temsili görüntüleri. (B) 18 gün boyunca farklılaştıktan sonra EGFP + mikroglia'nın retinal organoidlerle ko-kültürü. (C) 30 gün boyunca farklılaştıktan sonra EGFP + mikroglia'nın retinal organoidlerle ko-kültürü. Ölçek çubuğu: 300 μm. (D) CRX (fotoreseptör hücre markörü; kırmızı) ve IBA1 (mikroglial markör; yeşil), 50 günlük farklılaşmadan sonra mikroglia ile birlikte kültürlenmiş retinal organoidlerin doku yapısını tespit etmek için kullanıldı. DAPI (mavi) çekirdeği boyar. Ölçek çubuğu: 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/67016fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan ortamların bileşimi. Her bir ortamın 500 mL hacmini hazırlamak için gereken bileşenler tabloda listelenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/Table%201-67016R1.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Mikroglia, retinada bulunan benzersiz yerleşik bağışıklık hücreleridir ve çeşitli retinal dejeneratif hastalıklarda çok önemli roller oynar. Retinal organoidlerin mikroglia ile ko-kültür modelinin oluşturulması, retina hastalıklarının patogenezinin ve gelişim sürecinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir.

Retinal Organoidlerin Mikroglia ile Birleştirilmesi

Due to the limited accessibility of the human retina, retinal organoids (ROs) are the best model for studying human retinal disease, which could reveal ...

assembling-retinal-organoids-with-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kendi kendini organize eden bir yöntem kullanarak, fotoreseptörlerin oluşumunu önemli ölçüde artırabilecek COCO ilavesiyle bir protokol geliştiriyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarının yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle retina dokuları üretmesi için uygun olan optimize edilmiş bir retinal organoid indüksiyon sistemini açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Bu protokol, transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid numuneler için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir hazırlık prosedürü sağlar. Olgun retinal organoidlerde sinapsların analizini içeren uygulamalar için uygundur.

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi hematopoietik progenitör hücreleri (HPC'ler) organoid gelişimine dahil ederek yerleşik mikroglialı bir insan beyni organoidi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

Bu protokol, tam montajlı retinal organoidlerin tam hacimli konfokal görüntülemesi için optik temizleme ve immün etiketlemeyi birleştirir. 3D yapıyı koruyarak, temel nöronal yolların ayrıntılı görselleştirilmesini sağlar, retina olgunlaşması, mekansal organizasyon ve hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıptaki potansiyel uygulamalarının incelenmesini geliştirir.

Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme

Burada, genişletilmiş ex vivo deneyler için retinayı fare gözünden izole etmek için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, retinal glia'yı canlı dokuda yerinde tutmanın sağladığı araştırma yollarından yararlanmak isteyen araştırmacılar için bu teknik olarak zorlu yaklaşımı erişilebilir kılmayı vurgulamaktadır.

Fare retinasındaki glial etkileşimleri incelemek için bir ex vivo eksplant modeli

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Bu video retina ganglion hücrelerinin sayısı (RGCs) ve niceleme RGCs boyutları ölçülerek, iç nükleer tabaka kalınlığı ölçümü de retinanın morfometrik analizler, üç tip gösterir. Tekniği morfometrik analizler için basit ama bilimsel bir platform sunabilir.

Retina Bölüm morfometrik Analizleri

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Keşfedin retinal organoidler ve mikroglia ile ortak kültür modeli oluşturmayı. Bu yöntem, retina dejeneratif hastalıkların patogenezini anlamak ve tedavi stratejileri geliştirmek için kullanılır.

Retinal Organoidlerin Mikroglia ile Birleştirilmesi

Daha fazla video keşfet