Name: Farelerde yayılan depolarizasyonları görselleştirmek ve kaydetmek için görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Öğrenin, hafif travmatik beyin yaralanması modelinde yetişkin farelerde yayılan depolarizasyonları görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirerek güvenilir şekilde tespit etme yöntemini. Bu protokol akut davranış ve uzun vadeli bilişsel eksikliklerin anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIGMS P20GM109089 ve Savunma Bakanlığı PR200891 hibeleri tarafından desteklenmiştir.

Tüm prosedürler, New Mexico Üniversitesi'ndeki Enstitü'nün Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak gerçekleştirildi. C57BL / 6J fareleri ticari bir kaynaktan elde edildi. 8-14 haftalık yaş aralığında eşit sayıda erkek ve dişi fare kullanıldı. Tüm fareler yaklaşık 20 g ağırlığındaydı. Bu çalışmada kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Ek Dosya 1 kısaltmaların listesini içerir.
1. Kafatasının görüntüleme ve elektrofizyoloji için hazırlanması
<ol>
	<li>Hayvanı% 100 oksijen içinde% 2 -% 3 izofluran içeren bir izofluran indüksiyon kutusunda uyuşturun, böylece bir pençe tutamından ürkmeden uygun anestezi derinliğini sağlayın.</li>
	<li>Hayvanı stereotaksik bir çerçeveye yerleştirmeden önce preoperatif analjezikler (Yavaş salınan Buprenorfin, 3.25 mg / kg, SQ) uygulayın ve anesteziyi koruyun (% 2 izofluran).</li>
	<li>Oftalmik merhem ekleyin ve vücut ısısı geri bildirimi olan bir ısıtma yastığı ile hayvanın vücut ısısını koruyun.</li>
	<li>Kesiğin olacağı kafatasının üzerindeki saçları, oküler fissürün orta hattından lambdaya kadar</li> tıraş edin.
	<li>Cildi antiseptik ve dezenfektan bir ovma ve solüsyonla sterilize etmeden önce kırpılmış tüyleri çıkarın. % 70 etanol ile bitirin ve steril bir cerrahi alan sağlamak için üç kez tekrarlayın.</li>
	<li># 10 neşter bıçağı kullanarak, rostraldan kaudal e orta hatta bir kesi yapın, hemen ardından insizyona tıbbi sınıf siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi yanlamasına yayın.</li>
	<li>Kafatasına ek koruma sağlamak için kafatasının üzerine bir veya iki damla daha siyanoakrilat yapıştırıcı ekleyin. 
	NOT: Yapıştırıcı uygulaması zamana duyarlıdır, çünkü kafatası 10 saniyeden daha uzun süre havaya maruz kaldığında opaklaşmaya başlayacaktır. Bu, SD'nin görüntüleme yöntemleriyle görselleştirilmesini gizleyecektir.</li>
	<li>Yapıştırıcı kururken, beyincik üzerindeki kesi boyutunu artırmak için steril cerrahi makas kullanın. Yapıştırıcı ayarlandıktan sonra, kafatası vida elektrotlarının implantasyonuna başlayın.
	<ol>
		<li>İmplantasyondan önce kafatası vidalarını bir boncuk sterilizatörü ile 20-30 saniye sterilize edin.</li>
		<li>Açık bir görsel pencere sağlamak için kafatası vidalarını SD başlatma bölgesinden uzak bir bölgeye yerleştirin. 
		NOT: Birincil görsel korteksteki kronik kayıtlar için üç kafatası vidası kullanılır. İlk vida, bregmadan yaklaşık y = -6.00 mm uzaklıkta, beyincikte yerleştirilir ve referans elektrot görevi görür. Kayıt elektrotları, sol ve sağ hemisferler içinde, bregmadan y = -2.79 mm ve orta hattan x = ±2.5 mm olacak şekilde konumlandırılır.</li>
		<li>0,8 mm boyutunda bir matkap ucu ile kafatasına pilot delikler açın. Alttaki dokuya zarar vermemek için, z'de -0,5 mm idealdir. Paslanmaz çelik tel ile altın pimlere önceden lehimlenmiş #00-90 vidaları kullanın.</li>
		<li>Vidaları kafatasına doğru çevirin.1.5-2 tam tur vidayı kafatasından geçirecek ve kortikal yüzeyle temas ettirecektir.</li>
		<li>Fazla teli vidanın etrafına sarın ve daha sonra headstage yerleşimi için telde biraz gevşeklik sağlayın.</li>
		<li>Aynı prosedürleri kullanarak diğer kafatası vidalarını yerleştirin.</li>
		<li>Tüm kafatası vidaları yerine oturduktan sonra, tüm altın pimleri istediğiniz headstage konektörüne takın. Stereotaksik kolu kullanarak konektörü yerinde tutun ve kabloların birbirine değmediğinden emin olarak konektör pimlerini vida başlarının üzerinde yakın tutun.</li>
		<li>Kafatası vidalarının önündeki görüntüleme alanını bozmamaya dikkat ederek tüm alanı siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatın.</li>
		<li>Altın pimlerin tabanının etrafında diş çimentosu oluşturun ve kafatası vidalarından gelen altın pimlerin kafa aşamasındaki altın pimlere bağlanmadığından emin olun.</li>
		<li>Başlık konektörünü, çıkarmadan önce diş çimentosunun kurulaşmasına izin verin.</li>
		<li>Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve iyileşmesi için ev kafesine geri koyun. Standart ameliyat sonrası bakımı takip edin ve anesteziden iyileşirken hayvanları bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. 
		NOT: Ameliyattan sonra, hayvanlar tek başına barındırıldı ve günlük olarak ağrı açısından izlendi. Analjezi için yerel kurumsal yönergeleri izleyin. Yavaş salınan bir buprenorfin kullanıyorsanız, ağrıyı izleyin ve potansiyel olarak 72 saatte ek bir doz verin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Muhafaza ve zenginleştirme dahil olmak üzere elektrotlara takılabilecek tüm nesneleri çıkarın. Yiyecek ve suya ad libium erişimi olan standart yatak takımları kullanın. 
	NOT: Ameliyat ve kayıt arasında iki günlük bir iyileşme süresi tanıyın.</li>
</ol>
2. İçsel optik sinyal (iOS) görüntüleme ve AC-elektrofizyoloji ile yayılan depolarizasyonların tespiti
<ol>
	<li>Hayvanları %100 oksijen içinde %2 izofluran ile anestezikleştirin. 
	NOT: Bu prosedürün görüntüleme kısmı ~ 5 dakika sürmeli ve izofluran maruziyet miktarı tutarlı olmalıdır.</li>
	<li>Hayvanı stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin. Burun konisi aracılığıyla, oksijende% 1 -% 2 izofluran bulundurun. 
	NOT: İzofluranın SD'leri azalttığı bilindiği için uygun anestezi derinliğini korumak çok önemlidir. Deney boyunca 60-70 nefes / dk'nın sürdürülmesi önerilir.</li>
	<li>Hayvanı kameranın altına yerleştirin ve odak halkasını ayarlayarak kameranın kortikal yüzeye odaklandığından emin olun.</li>
	<li>Şeffaflığı artırmak için görüntüleme alanına mineral yağ sürün.</li>
	<li>Bilgisayarları, LED panel kartını ve elektrofizyoloji ekipmanını açın. 
	NOT: LED panel kartı, tepe ışıkları kapalıyken görüntüleme penceresini aydınlatmak için hayvanın önüne yerleştirildiğinde en iyi şekilde çalışır. Işık, 2,400K soğuk sıcaklık ayarıyla ~ 95 lux (% 4000 güç) olarak ayarlandı.</li>
	<li>Micro-Manager19,20,21,22 kullanarak iOS için ayarı yükleyin.
	<ol>
		<li>Fareyi kameranın altında görüntülemek ve hayvanın kafatasını kameranın altında ortalamak için Canlı düğmesine basın. "Canlı" penceresini kapatın.</li>
		<li>Multi-D Acq tuşuna basın.</li>
		<li>Çok Boyutlu Alım penceresinde, istediğiniz zaman noktalarını seçin. 
		NOT: 250 ms'lik aralıklarla 750 görüntü sayımı önerilir.</li>
		<li>Görüntüleri istediğiniz dosya yoluna ve ad önekine kaydedin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hayvandan gelen altın pimleri headstage konektörüne ve ardından headstage'e bağlayın.</li>
	<li>Intan yazılımı için yük ayarı.
	<ol>
		<li>Dosya formatı seç simgesine tıklayın ve açılır pencerede Sinyal Türü Formatı Başına Bir Dosya'yı seçin. Bu, dosyayı MATLAB'da daha fazla kullanım için bir ".dat" olarak kaydedecektir.</li>
		<li>Donanım Bant Genişliği altındaki BW sekmesinde, 0.13-500 Hz amplifikatör bant genişliğini seçin.</li>
		<li>Filtre Ekranı Seçici altında, en geniş sinyal aralığını kapsayacak şekilde GENİŞLİ'yi seçin.</li>
		<li>Kaydetmek istediğiniz dosya yolunu seçmek için Dosya Adı Seç simgesine tıklayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektromanyetik bir çarpma tertibatı kullanarak darbe gerçekleştirin. 
	NOT: Çarpma tertibatı ayarları 4 m/s darbe hızı ve 5 mm sapmadır.
	<ol>
		<li>Çarpma tertibatını açın ve ucu geri çekmek ve uzatmak için 3 yönlü düğmeyi hafifçe vurarak ucun geri çekildiğinden ve uygun şekilde uzadığından emin olun. Hayvanı ucun altına yerleştirmeden önce uç uzatılmalıdır.</li>
		<li>Hızlı hareket ederek, hayvanı bir köpük yatağa yerleştirin ve yatağı ucun altına kaydırın.</li>
		<li>Çarpma tertibatı ucunu orta hatta ve 1 mm bregma rostralına hizalayın.</li>
		<li>Çarpma tertibatının ucunu, hayvanın başının üst kısmına sıkıca değene kadar indirin. 
		NOT: Ucu kafanın içine doğru itmeyin.</li>
		<li>Çarpma tertibatı ucunu geri çekmek için kolu itin ve ardından darbe kolunu etkinleştirmeden önce manuel olarak 5 mm indirin.</li>
		<li>Hayvanı hemen köpük yataktan çıkarın ve SD çarpmadan itibaren başlatıldığı için 5 saniye içinde görüntüleme için hayvanı kameranın altına yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Çok Boyutlu Alım penceresinde Acquire! seçeneğine tıklayarak iOS görüntülemeyi başlatın. Tüm SD'yi yakalamak için 4 dakika boyunca görüntü.</li>
	<li>Intan yazılımındaki Kayıt simgesine tıklayarak elektrofizyoloji kaydını başlatın.</li>
	<li>Hayvanı köpük pedden çıkarın ve hayvanın açık bir arenada veya ev kafesinde iyileşmesine izin verin. 
	NOT: Kortikal ağ fonksiyonunun iyileşmesine izin vermek için elektrofizyolojinin en az 1 saat boyunca kaydedilmesi önerilir.</li>
	<li>Kaydın tamamlanmasının ardından, hayvanı baş kısmından çıkarıntage ve konektör ve hayvanı kafesine geri yerleştirin. 
	NOT: Her darbe ve kayıt oturumu arasında 24 saat izin verilmesi önerilir. Hayvan, kayıt seansları dışında tüm süre boyunca ev kafesinde kalabilir.</li>
</ol>
3. iOS görüntü görselleştirme ve niceleme
<ol>
	<li>ImageJ19,20,21,22 içinde, Dosya > İçe Aktar > Görüntü dizisine tıklayarak görüntü yığınını açın.</li>
	<li>Hareket veya başka herhangi bir yapaylık olmadığından emin olmak için görüntüler arasında manuel olarak kaydırın.</li>
	<li>SD'nin grafiğini oluşturmak için, imleci kullanarak bir kare çizerek bir ROI oluşturun. 
	NOT: 30 x 30 piksellik bir kare kullanılması önerilir. Herhangi bir şekil veya boyut kullanılabilir, ancak ROI boyutunun hayvanlar arasında değişmediğinden emin olun.</li>
	<li>Görüntü > Yığınları > Çizim Z Ekseni Profili'ne tıklayarak bir çizim oluşturun. Yeni oluşturulan grafikte canlı düğmesine tıklayın. SD'nin görüntü yığınına geri dönün ve grafik SD eğrisini gösterene kadar ROI'yi hareket ettirin. Grafik, başlangıçta bir yükseliş, ardından taban çizgisinin altına bir düşüş ve birkaç dakika içinde taban çizgisine yavaş bir dönüş ile bir Günah dalgası gibi görünmelidir. 
	NOT: Grafikler, rastgele birimler (AU) veya temel ortalama olarak ilk birkaç görüntü kullanılarak yüzde taban çizgisi olarak ifade edilebilir.</li>
	<li>Oluşturulan çizim üzerinde, diğer grafik oluşturma yazılımlarında veya Matlab'da çizilebilecek değerlerin bir listesini oluşturmak için Liste'ye tıklayın.</li>
	<li>Görselleştirme için, gri tonlamalı görüntüyü ImageJ'de Image > Fire>'daki Arama Tablolarına bir arama tablosuna dönüştürün.</li>
</ol>
4. Elektrofizyoloji analizi
NOT: Elektrofizyoloji verilerini görselleştirmek ve analiz etmek için Buzsaki laboratuvarının uzmanlığının ve MATLAB tarafından oluşturulan kodlarının yoğun bir şekilde kullanılması önerilir. Analiz, kurumsal bir aktivasyon kodu ile MATLAB'ın ve GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode) aracılığıyla Buzsaki lab "Buzcode" zip dosyasının indirilmesini gerektirecektir.
<ol>
	<li>İntan elektrofizyoloji yazılımında, dışa aktarılan ham verilerin ".dat" formatında kaydedildiğinden emin olun. 
	NOT: Matlab, MathWorks web sitesinden yüklenebilir. Matlab'ın satın alınması ve kullanılması için kurumsal veya bireysel bir aktivasyon kodu gereklidir. Bu analizi gerçekleştirmek için Matlab'da kod çalıştırmayla ilgili bazı önceki deneyimler gereklidir.</li>
	<li>Verileri Matlab. içine yüklemek için Buzaki kod bz_LoadBinary işlevini kullanın
	NOT: Örnek "'data' = bz_LoadBinary ('tam veri dosyası yolu','frekans', örnekleme frekansı, nChannels, kanal sayısı);</li>
	<li>60 Hz. 'da ortalanmış bir çentik filtresi kullanarak AC gürültüsünü filtreleyin
	NOT: Örnek notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, veri);</li>
	<li>Yayılan depolarizasyonları (SD'ler) analiz etmek ve görselleştirmek için COSBID grubunun tavsiyelerine uygun olarak 0,5-100 Hz aralığında bir bant geçiren filtre kullanarak yüksek frekanslı aktiviteyi izole edin.</li>
	<li>MatLab'da pspectrum komutunu kullanarak güç spektrogramını hesaplayın.</li>
	<li>Görselleştirmek için, yüksek frekansı ve güç spektrogramını aynı zaman ölçeğinde ve tek bir sütunda çizin. 
	NOT: Grafiklerden, yüksek frekanslı depresyonun ve güç kaybının bir uzantısı olacaktır.</li>
</ol>

Detecting Spreading Depolarization Using AC Amplifiers and Non-Invasive Imaging

<ol><li>Pietrobon, D., Moskowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaos+and+commotion+in+the+wake+of+cortical+spreading+depression+and+spreading+depolarizations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chaos and commotion in the wake of cortical spreading depression and spreading depolarizations.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (6), 379-393 (2014).</li>
<li>Hartings, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+cortical+spreading+depolarizations+in+a+case+of+severe+brain+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Res%22%5BJournal%5D)">Repetitive cortical spreading depolarizations in a case of severe brain trauma.</a> Neurological Res. 30 (8), 876-882 (2008).</li>
<li>Andrew, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Questioning+glutamate+excitotoxicity+in+acute+brain+damage%3A+The+importance+of+spreading+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocrit+Care%22%5BJournal%5D)">Questioning glutamate excitotoxicity in acute brain damage: The importance of spreading depolarization.</a> Neurocrit Care. 37, 11-30 (2022).</li>
<li>Andrew, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thecritical+role+of+spreading+depolarizations+in+early+brain+injury%3A+Consensus+and+contention%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocrit+Care%22%5BJournal%5D)">Thecritical role of spreading depolarizations in early brain injury: Consensus and contention.</a> Neurocrit Care. 37, 83-101 (2022).</li>
<li>Pacheco, J., et al. Spreading depolarizations are associated with concussion-like behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPacheco%2C+J+%22eNeuro%22">eNeuro</a>. 6 (6), (2019).</li>
<li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C. Y., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> J Neurotrauma. 35, 1-10 (2018).</li>
<li>Pinkowski, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+depolarizations+contribute+to+the+acute+behavior+deficits+associated+with+a+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Spreading depolarizations contribute to the acute behavior deficits associated with a mild traumatic brain injury in mice.</a> J Neurotrauma. 41 (1-2), 271-291 (2023).</li>
<li>Dreier, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording%2C+analysis%2C+and+interpretation+of+spreading+depolarizations+in+neurointensive+care%3A+Review+and+recommendations+of+the+COSBID+research+group%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+and+Metab%22%5BJournal%5D)">Recording, analysis, and interpretation of spreading depolarizations in neurointensive care: Review and recommendations of the COSBID research group.</a> J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1595-1625 (2017).</li>
<li>Herreras, O., Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+potential+shifts+associated+with+recurrent+spreading+depression+and+prolonged+unstable+spreading+depression+induced+by+microdialysis+of+elevated+K%2B+in+hippocampus+of+anesthetized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of potential shifts associated with recurrent spreading depression and prolonged unstable spreading depression induced by microdialysis of elevated K+ in hippocampus of anesthetized rats.</a> Brain Res. 610 (2), 283-294 (1993).</li>
<li>Boas, D. A., Dunn, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+speckle+contrast+imaging+in+biomedical+optics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Laser speckle contrast imaging in biomedical optics.</a> J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2014).</li>
<li>Hadjikhani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+migraine+aura+revealed+by+functional+MRI+in+human+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of migraine aura revealed by functional MRI in human visual cortex.</a> PNAS. 98 (8), 4687-4692 (2001).</li>
<li>Dietz, R. M., Weis, J. H., Shuttleworth, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Ca2%2B+and+Zn2%2B+to+spreading+depression-like+events+and+neuronal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Contributions of Ca2+ and Zn2+ to spreading depression-like events and neuronal injury.</a> J Neurochem. 109 (Suppl 1), 145-152 (2009).</li>
<li>Reinhart, K. M., Shuttleworth, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+reduces+deleterious+consequences+of+spreading+depolarizations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ketamine reduces deleterious consequences of spreading depolarizations.</a> Exp Neurol. 305, 121-128 (2018).</li>
<li>Mané, M., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporo-spectral+imaging+of+intrinsic+optical+signals+during+hypoxia-induced+spreading+depression-like+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Temporo-spectral imaging of intrinsic optical signals during hypoxia-induced spreading depression-like depolarization.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li>
<li>Brennan, A. M., Connor, J. A., Shuttleworth, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD%28P%29H+fluorescence+transients+after+synaptic+activity+in+brain+slices%3A+predominant+role+of+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+and+Metab%22%5BJournal%5D)">NAD(P)H fluorescence transients after synaptic activity in brain slices: predominant role of mitochondrial function.</a> J Cereb Blood Flow and Metab. 26 (11), 1389-1406 (2006).</li>
<li>Shuttleworth, C. W., Brennan, A. M., Connor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+NAD%28P%29H+fluorescence+imaging+of+postsynaptic+neuronal+activation+in+murine+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A NAD(P)H fluorescence imaging of postsynaptic neuronal activation in murine hippocampal slices.</a> J Neurosci. 23 (8), 3196-3208 (2003).</li>
<li>Sword, J., Croom, D., Wang, P. L., Thompson, R. J., Kirov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+pannexin-1+channels+are+not+molecular+routes+of+water+influx+during+spreading+depolarization-induced+dendritic+beading%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+and+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuronal pannexin-1 channels are not molecular routes of water influx during spreading depolarization-induced dendritic beading.</a> J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1626-1633 (2017).</li>
<li>Chung, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+non-invasive+in+vivo+visible+light+detection+of+cortical+spreading+depolarizations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time non-invasive in vivo visible light detection of cortical spreading depolarizations in mice.</a> J Neurosci Methods. 309, 143-146 (2018).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinform. 18 (1), 1-26 (2017).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. 14, (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+microscope+control+using+%C2%B5Manager+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Biol+Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> J of Biol Methods. 1 (2), e10(2014).</li>
<li>Soldozy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+spreading+depression+in+the+setting+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Cortical spreading depression in the setting of traumatic brain injury.</a> World Neurosurg. 134, 50-57 (2020).</li>
<li>Zepeda, A., Arias, C., Sengpiel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+intrinsic+signals%3A+Recent+developments+in+the+methodology+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of intrinsic signals: Recent developments in the methodology and its applications.</a> J Neurosci Methods. 136 (1), 1-21 (2004).</li>
<li>Steinzeig, A., Molotkov, D., Castrén, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+imaging+through+%26%2334%3Btransparent+skull%26%2334%3B+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chronic imaging through &#34;transparent skull&#34; in mice.</a> PLoS One. 12 (8), (2017).</li>
<li>Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+neuronal+and+astroglial+disruption+in+the+peri-contusional+cortex+of+mice+revealed+by+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging.</a> Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).</li>
<li>Hudetz, A. G., Vizuete, J. A., Pillay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+isoflurane+on+high-frequency+and+low-frequency+oscillations+in+the+cerebral+cortex+and+hippocampus+in+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of isoflurane on high-frequency and low-frequency oscillations in the cerebral cortex and hippocampus in freely moving rats.</a> Anesthesiology. 114 (3), 1588-1595 (2011).</li>
<li>Reinhart, K. M., Morton, R. A., Brennan, K. C., Carlson, A. P., Shuttleworth, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+improves+neuronal+recovery+following+spreading+depolarization+in+peri-infarct+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Ketamine improves neuronal recovery following spreading depolarization in peri-infarct tissues.</a> J Neurochem. 168 (5), 855-867 (2023).</li>
</ol>

Yayılan depolarizasyonlar, travmatik beyin hasarı (TBI), felç ve migren dahil olmak üzere çeşitli hastalık modellerinde çok önemlidir1. SD'lerin doğru tespiti, akut davranış eksikliklerindeki ve/veya hafif travmatik beyin yaralanmalarını (mTBI'lar) takiben nöroimmün sistemin aktivasyonundaki rollerini anlamak için gereklidir23,24. Tek bir yöntem kullanıldığında SD'lerin kaybolması riskini azaltmak amacıyla, SD'lerin etkili bir şekilde görselleştirilmesi ve kaydedilmesi için çok yöntemli bir yaklaşım gereklidir.
Tekniklerin birleştirilmesi, yayılan depolarizasyonların (SD'ler) doğrulanmasını sağlarken, her tekniğin potansiyel tuzakları olabilir. Bu protokolde açıklanan görüntüleme tekniklerine çoğu laboratuvar erişebilir ve Zepeda ve meslektaşları25 tarafından detaylandırılmıştır. Opak pencereler sonuçsuz görüntülere yol açabileceğinden, kraniyal pencerenin hazırlanması çok önemlidir26. Bu sorun, siyanoakrilat yapıştırıcı uygulanmadan önce kafatasının havaya maruz kalması en aza indirilerek azaltılabilir. Ek olarak, görüntülemeden önce bir damla mineral yağ ile pencerenin şeffaflığı iyileştirilebilir. Hareket artefaktları SD onayını da karmaşıklaştırabilir, bu nedenle bu artefaktları en aza indirmek net video elde etmek için çok önemlidir. Bunu ele almak için, görüntüleme işlemi boyunca hayvanı izofluran altında tutmak önemlidir27. Burun konisinin kullanılması, hayvanın çarpma tertibatı ile kayıt kurulumu arasında verimli bir şekilde aktarılmasını kolaylaştırır. SD yayılımının mümkün olduğu kadar çoğunu yakalamak için çarpmadan sonra hayvanı hızlı bir şekilde burun konisinin altına geri yerleştirmek çok önemlidir. Bu hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) modelinde, yaklaşık 4 dakikalık kayıt genellikle tüm SD'yi yakalamak için yeterlidir. Bununla birlikte, daha şiddetli TBI'larda, doku hasarı ile spontan SD'ler üretilebilir28. Sürekli görüntüleme bu spontan SD'leri tespit edebilir, ancak genişletilmiş izofluran anestezisi yüksek frekanslı depresyonu gözlemlemeyi zorlaştırabilir. Spontan SD'ler, yüksek frekanslı aktivitede ek depresyonlar ile elektrofizyoloji ile tespit edilebilir, ancak depresyon ve SD arasındaki ilişkiyi görüntüleme olmadan doğrulamak zordur.
Open-Ephys ve Intan yükselteçlerinin geliştirilmesiyle, in vivo elektrofizyoloji artık birçok laboratuvarın erişimine açıktır. Tüm elektrofizyolojik kayıtlar, kafatası vidalarının ve/veya elektrotların implantasyonunu gerektirir. Bu protokolde, iyileşmeyi desteklemek için kafatası vidalarının implantasyonu ile kayıt arasında iki günlük bir gecikme süresi vardır. Bu süre beynin implantasyondan tamamen kurtulması için yeterli olmasa da, kafatası vidaları beyin dokusuna nüfuz etmediği için minimum hasar olmalıdır. Ek olarak, siyanoakrilat ile kapatılmış kafatasının şeffaflığı zamanla azalır, bu nedenle optimum şeffaflığı elde etmek için görüntüleme mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır. Elektrofizyoloji için 60 Hz gürültüyü en aza indirmek çok önemlidir. Deney alanının AC gücünden izole edildiğinden ve Intan'a uygun şekilde topraklandığından emin olun. Hareket artefaktları tamamen ortadan kaldırılamasa da, baş aşamasındaki ivmeölçerler, işlem sonrası hareket periyotlarının belirlenmesine ve ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu teknikler hafif travmatik beyin yaralanmalarını (mTBI'lar) takiben SD iyileşmesi ve kortikal ağ fonksiyonu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Bu tekniklerin bir sınırlaması, hayvanların görüntüleme sırasında anestezi altında olmasıdır. Bununla birlikte, çoğu TBI modeli anestezi gerektirir ve uzatılmış anestezinin deneysel tasarımı önemli ölçüde etkilemesi olası değildir. İzofluran, yüksek frekanslı aktiviteyi önemli ölçüde azaltır27. İzofluran maruziyeti görüntüleme periyodunun ötesine geçerse, SD'yi takiben yüksek frekanslı aktivite iyileşmesinin saptanmasını zorlaştırabilir. Bu nedenle, Şekil 2'de gösterildiği gibi, yüksek frekanslı aktivitenin geri kazanımını karşılaştırmak için deneysel tasarıma sahte veya izofluran tek başına bir grubun dahil edilmesi kritik öneme sahiptir. Diğer bir sınırlama, elektrofizyoloji kayıtlarının DC kaymasını algılamamasıdır. DC kaymasının genliği ve süresi, doku sağlığının ve SD28'den iyileşmenin göstergeleridir. Bununla birlikte, SD'lerin bu tekniklerle doğrulanması, TBI araştırmalarına ilişkin değerli bilgiler sağlamaya devam edecektir.
Tüm TBI modellerinin yayılan depolarizasyonlar (SD'ler) üretmesi kuvvetle muhtemel olduğundan, tüm TBI araştırmacıları burada açıklanan tekniklerden faydalanacaktır. TBI alanı, SD'lerin yaralanma, yaralanma ilerlemesi, nöroimmün aktivasyon ve iyileşmedeki rolünün anlaşılmasından önemli ölçüde kazanç sağlayacaktır. Son araştırmalar, SD'lerin davranışsal eksikliklere katkıda bulunduğunu ve nörolojik bozukluğun altında yatan bir mekanizma olabileceğini düşündürmektedir 5,7. Bu protokolde özetlenen teknikler, TBH ve SD arasındaki bağlantının aydınlatılmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniklerin gelecekteki uygulamaları inme, epilepsi ve migren dahil olmak üzere diğer araştırma alanlarına da uzanabilir.

Yayılan depolarizasyonlar (SD'ler), travmatik beyin hasarı (TBI), inme, subaraknoid kanamalar, iskemi ve migren aura1 dahil olmak üzere çeşitli nörolojik durumlarla ilişkilidir. SD'ler, inmelerde doku hasarının ilerlemesinde rol oynamaktadır ve TBIs2. Doku kaybı ilerlemesinin altında yatan kesin mekanizma belirsizliğini korumaktadır3,4. Bununla birlikte, SD'ler, nöronların metabolik talepleri yeterli oksijen ve glikoz ile karşılanmadığında ortaya çıkar, çünkü ATP'ye bağımlı sodyum-potasyum pompasının işlevi iyon gradyanlarını korumak için yetersiz hale gelir. SD'lerin doku kaybındaki rolünü anlamak için, bunları ölçmek ve incelemek için kesin tekniklere ihtiyaç vardır, bu da bilimsel bilgiyi ilerletmek için çok önemlidir. SD'ler, deneysel tasarım ve/veya enstrümantasyon sınırlamaları nedeniyle sıklıkla tespit edilemeyen önemli nörolojik olaylardır.
Yayılan depolarizasyonların (SD'ler) yaralanma ilerlemesindeki rolü şu anda aydınlatılmaktadır, ancak hafif travmatik beyin yaralanmalarındaki (mTBI'ler) rolleri belirsizliğini korumaktadır. Bu yazıda açıklanan teknikleri kullanan son çalışmalar, SD'lerin kapalı kafatası mTBI fare modellerinde, açık doku hasarı veya kanama olmadığında bile başlatıldığını göstermiştir5, 6. Bu çalışmalar, SD'lerin akut nörolojik bozukluklara ve nöroinflamasyona katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Ek olarak, mTBI ile indüklenen SD'lerin varlığı, akut davranışsal eksikliklerle yakından ilişkilidir6,7. Bu nedenle, SD'lerin tüm TBI modellerinde başlatılması muhtemeldir, ancak rollerinin onay olmadan tespit edilmesi zordur. SD'lerin varlığının doğrulanması, mTBI'lerin sonuçlarının doğru bir şekilde değerlendirilmesi için çok önemlidir.
Yayılan depolarizasyonlar (SD'ler), "DC kayması" olarak bilinen hücre dışı potansiyelde önemli bir düşüş ve yüksek frekanslı aktivite8 depresyonu ile tanımlanır. "DC kayması"nın çözülmesi genellikle saniyeler sürer (~10 s)9. "DC kaymasını" yakalamak için bir DC amplifikatörü ve gümüş tel elektrotlar gereklidir. Bununla birlikte, in vivo elektrofizyoloji genellikle hareket artefaktlarını azaltmak için düşük frekanslı olayları filtrelemek üzere tasarlanmış AC amplifikatörleri ile gerçekleştirilir. Ne yazık ki, bu düşük frekanslı filtreleme aynı zamanda "DC kaymasını" da ortadan kaldırır. Ek olarak, gümüş toksiktir ve kronik kayıtlar için uygun değildir. Yaygın olarak kullanılan AC amplifikatörler, yüksek frekanslı aktivitenin depresyonunu algılayabilir, ancak eşlik eden "DC kayması" olmadan, bir SD'nin varlığını doğrulamak zordur.
Yayılan depolarizasyonlar (SD'ler) çeşitli görüntüleme teknikleri kullanılarak da tespit edilebilir. En yaygın olarak, SD'ler, sağlam kafatasından serebral kan akışını ölçen lazer benek kontrast görüntüleme ile görüntülenir10. SD'ler serebral vaskülatürü ve kan akışını önemli ölçüde etkiler. Fareler dışındaki çoğu türde, SD'ler, SD11'in ön kenarı ile hareket eden yayılan bir hiperperfüzyon dalgasını indükler. SD'ler ayrıca kalsiyum veya glutamat floresan indikatörleri12 kullanılarak da görüntülenebilir, ancak bunun için dokuya boyalar veya genetik olarak kodlanmış floresan indikatörler yüklenmesi gerekir12,13. İlginç bir şekilde, SD14 ile ilişkili içsel optik sinyaller (iOS) nedeniyle SD'ler çıplak gözle gözlemlenebilir. iOS, NAD(P)H ve FADH15,16, doku şişmesi17 gibi otofloresan moleküllerden ve serebral kan akışındaki potansiyel değişikliklerden oluşan karmaşık sinyallerdir. Karmaşıklıklarına rağmen, iOS sinyalleri güvenilirdir ve vahşi tip fareler18'de yakalanabilir. Bu teknik, özel virüslere veya transgenik hayvanlara ihtiyaç duymadan herhangi bir laboratuvarda uygulanabildiğinden, bu protokol iOS'u görüntüleme yöntemini açıklar.
Bu yöntemin genel amacı, eşzamanlı görüntüleme ve elektrofizyoloji kullanarak hafif bir travmatik beyin hasarını (mTBI) takiben yayılan bir depolarizasyonun (SD) varlığını veya yokluğunu deneysel olarak doğrulamaktır. Gelişmiş yükselteçler tarafından kolaylaştırılan in vivo elektrofizyoloji, yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, bu amplifikatörler karakteristik "DC kaymasını" algılayamaz. Bu nedenle, bu protokolde açıklandığı gibi, SD'lerin varlığını veya yokluğunu güvenle doğrulamak için görüntüleme teknikleri kullanılır. Görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirmenin avantajı, görüntülemenin SD'nin yayılmasını tespit edebilmesi, elektrofizyolojinin ise ilişkili yüksek frekanslı depresyonu tanımlayabilmesidir.
Genel olarak, bu yöntem travmatik beyin hasarını (TBI) takiben yayılan depolarizasyonların (SD'ler) varlığını araştırmak için uygundur. Uygulaması, TBI ve SD'lerden sonra kortikal ağ fonksiyonunun anlaşılmasını artırabilir. Bu protokol, kapalı bir kafatası darbe modelinden kontrollü kortikal darbe, sıvı perküsyonu veya ağırlık düşüşü gibi diğer modellere uyarlanabilir. Bu protokolün birden fazla laboratuvarda uygulanması, SD'lerin değişen TBI şiddetlerindeki rolünü açıklığa kavuşturabilir. Yerleşik herhangi bir TBI modeli kullanılabilir, ardından bu protokolde açıklanan iOS görüntüleme ve elektrofizyoloji prosedürleri takip edilebilir.

<table><tbody><tr><td># 00-90 x .118 Makine Vidası</td><td>ABD Mikro Vida</td><td>00.90-118-M-SS-P, Amazon</td><td></td></tr><tr><td>0.8 mm çaplı matkap</td><td>ucu PCB Matkap Ucu</td><td>WYTP21, Amazon</td><td></td></tr><tr><td>16-A Sahne Altı Intan</td><td>&nbsp;</td><td>C3335</td><td></td></tr><tr><td>2.1 mm Çapak mikro matkap ucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>19007-21</td><td></td></tr><tr><td>AC amplifikatör</td><td>Intan</td><td>RHD kayıt sistemi</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J fareler ve nbsp;</td><td>Jackson Laboratuvarı&nbsp;</td><td>Jax # 000664</td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Mightex</td><td>TCE-1304-U</td><td></td></tr><tr><td>Uzatma lensi</td><td>Zeikos&nbsp;</td><td>ZE-ETN</td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR (yavaş salınan Buprenorfin)</td><td>Midwest Veteriner Malzemeleri</td><td>Ürün Numarası 267.10000.3</td><td></td></tr><tr><td>Altın konektör pimi (dişi)</td><td>A-M Sistemleri</td><td>520100</td><td></td></tr><tr><td>Altın konektör pimi (erkek)</td><td>A-M Sistemleri</td><td>520200</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ2/Fiji</td><td>Resim J</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Çarpma Tertibatı Bir</td><td>Leica</td><td>39463930</td><td></td></tr><tr><td>LED panel kartı</td><td>Supon</td><td>L122t</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Kurumsal veya bireysel aktivasyon kodu</td><td></td></tr><tr><td>Tıbbi sınıf siyanoakrilat yapıştırıcı</td><td>MasterBond</td><td>MB287</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Yönetici Kamera Yazılımı</td><td>Image J</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tırnak matkabı / parlatıcı</td><td>Makartt Tırnak Matkap Elektrikli Tırnak Törpüsü</td><td>JD700</td><td></td></tr><tr><td>Omnetic konektörler</td><td>Omnetics</td><td>A79014-001</td><td></td></tr><tr><td>RHX Veri Toplama Yazılımı</td><td>Intan</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik kaplamasız tel (0.005 ")</td><td>A-M Sistemleri</td><td>792800</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaksik Çerçeve</td><td>Kopf Aletleri</td><td>1923-B</td><td></td></tr><tr><td>Teets 'soğuk kürlenen' diş çimentosu</td><td>A-M sistemleri</td><td>525000, 526000</td><td></td></tr><tr><td>XLR kamera objektifi</td><td>Nikon</td><td>NIKKOR 50 mm f/1.8-16</td><td></td></tr></tbody></table>

farelerde yayılan depolarizasyonları görselleştirmek ve kaydetmek için görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirmek

Combining Imaging and Electrophysiology to Visualize and Record Spreading Depolarizations in Mice

Yayılan Depolarizasyonlar (SD'ler), beyinde gri madde boyunca yavaş yayılmaları nedeniyle genellikle fark edilmeyen büyük olaylardır. SD tespiti zor olabileceğinden, birden fazla yöntem kullanılarak en iyi şekilde doğrulanır. Bu protokol, SD'leri çoğu laboratuvarın güvenilir ve kolay bir şekilde benimseyebileceği bir şekilde tespit etmek için görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirme yöntemlerini açıklar. SD'ler travmatik beyin yaralanmaları, inme, subaraknoid kanamalar, iskemi ve migren aurasını takiben ortaya çıkar. Tarihsel olarak, SD'ler, yavaş hücre dışı kaymayı ve yüksek frekanslı aktivitedeki depresyonu çözebilen DC amplifikatörleri kullanılarak kaydedilmiştir. Bununla birlikte, DC amplifikatörlerin kronik in vivo kayıtlar için kullanılması neredeyse imkansızdır. Bu protokol, SD'nin yayılan dalgasını tespit etmek için gerekli olan non-invaziv görüntüleme ile birlikte yüksek frekanslı depresyonu doğrulamak için in vivo elektrofizyoloji kayıtları için ortak bir AC amplifikatörü kullanır. Bu yöntemler, beyin hasarını takiben SD'lerin varlığını veya yokluğunu doğrulamak için çoğu deneysel yaklaşım için güvenilir bir şekilde benimsenebilir ve / veya değiştirilebilir.

Şekil 1, deneysel düzeneğin grafiksel bir gösterimini örneklendirmektedir. Kayıt kafatası vidaları primer görsel kortekse yerleştirilmiş olup, bir kafatası vida elektrodu toprak elektrodu olarak serebellar vermise yerleştirilmiştir. Kafatası vidaları ve altın pinler, siyanoakrilat yapıştırıcı ve dental siman kullanılarak kafatasına sabitlenir. Darbe ve görüntüleme için yer bırakmak amacıyla dental simanın kafatasının sadece kaudal kısmıyla sınırlandırılması kritik önem taşır. Orta hatta merkezlenmiş ve bregmanın yaklaşık 1 mm rostralinde yer alan darbe konumu Şekil 1'de belirtilmiştir.
Temsili intrinsik optik sinyal (iOS) görüntüleri Şekil 2A'da gösterilmiştir. Yayılan depolarizasyonların (SD'ler) görselleştirilmesini geliştirmek için gri tonlamalı görüntüler bir Fire Arama Tablosu (Lookup Table) kullanılarak dönüştürülür. iOS; NAD(P)H, FADH ve doku yansıması dahil olmak üzere çeşitli sinyalleri kapsar, bu da bu sinyallerin yorumlanmasını ve karşılaştırılmasını zorlaştırır. Büyük damarlar, süper yapıştırıcı penceresi üzerinden açıkça görülmelidir (oklarla belirtilmiştir), Şekil 2A'daki kesikli çizgi ise SD'nin yayılan dalgasını işaret eder. SD'leri gerçek zamanlı olarak gözlemlemek zor olsa da, görüntüler hızlandırıldığında daha belirgin hale gelirler (bkz. Ek Video 1). Vazokonstriksiyon nedeniyle bazı küçük dallar "kaybolmuş" gibi görünebilir (Şekil 2A). Görüntü yığınından çıkarılan küçük bir ilgi alanı (ROI), Şekil 2B'ye benzer bir Z-ekseni grafiği vermelidir. Elektrofizyoloji kayıtlarından elde edilen yüksek frekanslı sinyal, Şekil 2C,D'nin üst panellerine benzemelidir. Bu kayıtlar, hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) sonrası hemen başlatılmış olup, hayvanlar 4 dakikalık iOS görüntülemesi sırasında isofluran anestezisi altında tutulmuştur. İsofluranın kaldırılmasının ardından, Şekil 2C'de (kırmızı kutu) gösterildiği gibi, şam hayvanlarda yüksek frekanslı aktivite bir dakika içinde hızla geri dönmelidir. Buna karşılık, bir SD meydana gelmişse, yüksek frekanslı aktivite iyileşmeden önce birkaç dakika boyunca baskılanmış halde kalacaktır (Şekil 2D, kırmızı kutu). Şekil 2C,D'nin alt panelleri, her yüksek frekanslı grafik için hesaplanan gücü (V²) göstermektedir. Bu güç grafikleri, güçteki hızlı artışla (kırmızı kutuların sağ kenarı ile belirtilmiştir) yüksek frekanslı aktivitenin baskılanmasını ve geri kazanılmasını belirlemeye yardımcı olur.
<img alt="Açık kafatası, kafatası vidaları ve araştırma için etiketlenmiş dental çimento içeren beyin darbe diyagramı." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67032/67032fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1: Deneysel düzenek ile darbe ve kafatası vidalarının konumu. Kafatasının dorsal yüzeyi, bir deri insizyonu aracılığıyla açığa çıkarılır. Şeffaflığı artırmak için kafatası ve deri siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatılır. Topraklama için bir burr deliği, bregmadan y = -6.00 ve x = 0 noktasına delinir. Kayıt elektrotları için burr delikleri, bregmadan y = -2.79 ve x = ±2.5 noktalarına yerleştirilir. Paslanmaz çelik vidalar kafatasına vidalanır ve kaplamasız paslanmaz çelik tel ile altın pinlere lehimlenir. Darbe ve görüntüleme için yeterli alan sağlamak amacıyla, kafatası yüzeyinin dental çimento ile aşırı kapatılmamasına özen gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67032/67032fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Serebral kan akışı analizi; optik görüntüleme; panel karşılaştırması; yüksek frekanslı aktivite grafikleri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67032/67032fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2: Temsili iOS görüntüleri ve AC kayıtları. (A) Kan damarlarını gösteren okların bulunduğu temsili iOS görüntüleri. Görselleştirmenin iyileştirilmesi için gri tonlamalı görüntüler ImageJ'de Fire ara yüz tablosuna dönüştürülmüştür. Noktalı siyah çizgi, iOS'ta yoğunluk artışı dalgası olarak görselleştirilen yayılan SD'yi belirtir. Tüm görüntü yığını üzerinden hızlıca kaydırıldığında SD net bir şekilde görülür. iOS sinyali, mitokondriyal NAD(P)H ve FADH üretimi ile nöronal ödem dahil olmak üzere, SD ile ilişkili çeşitli fizyolojik ve metabolik değişiklikleri yansıtır. Siyah kutu, (B) kısmındaki izi oluşturmak için kullanılan ilgi bölgesini (ROI) vurgular. Ölçek çubuğu: 1 mm. (B) Bazal değerin yüzdesi olarak ifade edilen temsili iOS SD izi. iOS sinyali yükselir ve yaklaşık 60 saniye içinde bazal değere yakın bir seviyeye döner. iOS sinyallerindeki değişiklikler küçük olsa da (yaklaşık %10), SD'yi tanımlamak için yeterlidir. Hem sham (C) hem de SD (D) hayvanları için AC kayıtlarında, üstteki izler yüksek frekanslı aktiviteyi, alttaki izler ise gücü (V²) temsil eder. Mavi kutular isofluran anestezisi sürelerini, kırmızı kutu ise yüksek frekanslı aktivitenin isoflurandan ve SD'den sonraki toparlanma dönemini belirtir. SD tarafından indüklenen uzun süreli depresyon, yalnızca isofluran sonrası (sham) aktivitenin hızlı toparlanması ile karşılaştırılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67032/67032fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 1: Yayılan dalga görselleştirmesi. Yayılan dalganın görsel olarak tanımlanmasını kolaylaştırmak için video dosyası yaklaşık 8 kat hızlandırılmıştır. Gri tonlamalı görüntü ImageJ programında Fire renk tablosuna dönüştürülmüş ve .AVI dosyası olarak kaydedilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67032/iOS_movie_V2.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Kısaltmalar listesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67032/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, hafif bir travmatik beyin hasarını takiben yetişkin farelerde yayılan depolarizasyonları güvenilir bir şekilde tespit etmek için görüntüleme ve elektrofizyolojinin kombinasyonunu gösterir.

Farelerde yayılan depolarizasyonları görselleştirmek ve kaydetmek için görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirmek

Spreading Depolarizations (SDs) are massive events in the brain that often go undetected due to their slow propagation through gray matter. Because SD ...

combining-imaging-electrophysiology-to-visualize-record-spreading

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz, sinirsel aktivite ve kan oksijenlenme seviyesi bağımlı (BOLD) MRG sinyal arasındaki ilişkinin araştırılması için bir platform sağlayan, aynı anda fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme ve kemirgen beyin elektrofizyolojik kayıt için bir yöntem geliştirdik.

Kemirgen Beyin aynı anda fMRI ve Elektrofizyoloji

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Source: Maruoka, H., et. al. uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2022) Bu video, görsel stimülasyon sırasında uyanık bir farede nöronal aktiviteyi ve mikroglial dinamikleri görüntülemek için iki fotonlu bir mikroskopi prosedürünü göstermektedir. kalsiyum geçişleri ve hücresel etkileşimler.

Uyanık Bir Farede Mikroglial Dinamiklerin ve Nöronal Aktivitenin Eş Zamanlı Görüntülenmesi

Bu yöntem, gezinmek ve hayvanın başının sağlam tespiti gerektiren mikroskobik görüntüleme veya tek hücreli elektrofizyolojik kayıtlar sırasında keşfetmek fare için somut, tanıdık bir ortam yaratır.

Düz zeminli Hava kaldırdı Platform: Yeni Bir Yöntem Awake üzerinde Mikroskopi veya Elektrofizyoloji ile davranışı birleştiren için serbestçe Kemirgenler Hareketli

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Bu iletişim kuralı ile yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü, membran gerilim çift kayıtları da dahil olmak üzere bir optik haritalama sistemi kullanan fare Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar ve Ca2 + geçici altında programlanmış stimülasyon özel elektrot kateter aracılığıyla.

Yüksek çözünürlüklü optik eşleştirmenin fare Atria Elektrofizyolojik değerlendirme

Burada, biyo sinyalleri kullanarak aynı anda video, farelerde kalp ve beyin kaydetmek için bir iletişim kuralı mevcut elektroansefalografi (EEG) ve Elektrokardiyografi (EKG). Ayrıca elde edilen EEG-ECG kayıtları nöbetler, EEG spektral güç, kardiyak fonksiyon ve kalp hızı değişkenliği için analiz yöntemleri açıklar.

Eş zamanlı Video-EEG-EKG Neurocardiac disfonksiyon epilepsi fare modelleri tanımlamak için izleme

4 aminopyridine uyarılan epileptiform aktivite kayıt ve elektrik modülasyon elektrot dizileri kullanma kemirgen beyin dilimler halinde gerçekleştirme göstermektedir. Özel kayıt odası doku canlılığı uzun süreli deneysel oturumları boyunca korur. Elektrot eşleme yaşamak ve uyarıcı çiftlerinin seçimi özel bir grafik kullanıcı arabirimi tarafından yapılmaktadır.

Kayıt ve modülasyon Epileptiform aktivite elektrot dizilerin birleştiğinde kemirgen beyin dilimleri içinde

Bu yöntem, yaşayan farelerin Hippocampus optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık açıklar. Bu hazırlık, birkaç hafta boyunca nöronal yapısal plastisite ve aktivite-uyarılmış hücresel plastisite uzunlamasına optik görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Öğrenin, hafif travmatik beyin yaralanması modelinde yetişkin farelerde yayılan depolarizasyonları görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirerek güvenilir şekilde tespit etme yöntemini. Bu protokol akut davranış ve uzun vadeli bilişsel eksikliklerin anlaşılmasına katkı sağlar.

Farelerde yayılan depolarizasyonları görselleştirmek ve kaydetmek için görüntüleme ve elektrofizyolojiyi birleştirmek

Daha fazla video keşfet