Name: Yüksek Derecede Diferansiye ve Polarize Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Oksijen Tüketim Oranlarının Uzun Süreli İzlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Keşfedin, Resipher cihazı ile retinal pigment epiteli kültürlerinde oksijen tüketim oranlarını haftalar boyunca izleme yöntemini. Mitokondriyal fonksiyon değerlendirmesi için ideal koşullarda sürekli biyoenerjetik profilleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Daniel Hass ve Jim Hurley'e, O2 çözünürlüğünü yeni ve koşullu ortamlarda bir kontrol olarak test etme fikri için teşekkür ederiz. Dr. Magali Saint-Geniez'e el yazması üzerindeki editoryal katkıları için teşekkür ederiz. Kellogg Göz Merkezi, Instrument and Electronic Services Core'dan Scott Szalay'a, hipoksi odasını Resipher USB kablosuyla güçlendirdiği için teşekkür ederiz. HFT araştırması için hiçbir federal fon kullanılmadı. Elektronik Hizmetler Çekirdeği, Ulusal Göz Enstitüsü'nden P30 EY007003 tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Körlüğü Önleme Araştırmaları'ndan (RPB) sınırsız bir bölüm hibesi ile desteklenmektedir. J.M.L.M., James Grosfeld Kuru Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu Girişimi, E. Matilda Ziegler Körler Vakfı, Eversight göz bankası hibesi, Ulusal Göz Enstitüsü'nden K08EY033420 hibesi ve Dee ve Dickson Brown'ın yanı sıra David ve Lisa Drews Umudu Keşfetme Vakfı tarafından desteklenmektedir. D.Y.S., UNSW Scientia Programı tarafından desteklenmektedir. L.A.K., Iraty Ödülü, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, Ulusal Göz Enstitüsü'nden bir R01EY027739 hibe ve Savunma Bakanlığı Ordusu Tıbbi Araştırma Satın Alma Faaliyeti VR220059 tarafından desteklenmektedir.

Farklılaştırılmış RPE Kültürleri için Yeni OCR İzleme Sistemi

<ol><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+EndMT%3A+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).</li>
<li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+transdifferentiation%3A+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium%3A+a+busy+intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).</li>
<li>Hansman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+the+retinal+pigment+epithelium+by+cytokines+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration.</a> Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).</li>
<li>Li, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+pyruvate+kinase+M2+activity+as+a+therapy+in+a+primary+RPE+cell+culture+model+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+stem+cells-based+replacement+therapy+for+retinal+pigment+epithelium%3A+in+vitro+differentiation+to+in+vivo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery.</a> Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).</li>
<li>Wilson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+vascular+injury+in+the+mouse+eye+measured+by+phosphorescence-lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging.</a> Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+depth+influences+O2+availability+and+metabolism+in+human+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).</li>
<li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PGC-1%CE%B1+drives+metabolic+dysfunction+in+TGF%CE%B22-Induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).</li>
<li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).</li>
<li>Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolomic+signatures+of+TGF%CE%B22+and+TNF%CE%B1+in+the+induction+of+retinal+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition.</a> Metabolites. 13 (2), 213(2023).</li>
<li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choriocapillaris+impairment+is+associated+with+delayed+rod-mediated+dark+adaptation+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).</li>
<li>Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%2C+a+mathematically+tractable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+assessing+outer+segment+fate+in+primary+human+fetal+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures.</a> Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+spare+respiratory+capacity%3A+Mechanisms%2C+regulation%2C+and+significance+in+non-transformed+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells.</a> FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).</li>
<li>Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+hemodynamic+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration.</a> Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).</li>
<li>Fitch, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+bioenergetics+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+using+high-resolution+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry.</a> J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li>
<li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).</li>
<li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922(2024).</li>
<li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystine%2Fglutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox%2C+bioenergetics+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213(2024).</li>
<li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355(2024).</li>
<li>McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+using+isolated+cell+systems+to+understand+cardiac+metabolism+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology.</a> J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).</li>
<li>Misare, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+tetraploidy+on+Caenorhabditis+elegans+physiology+and+sensitivity+to+chemotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics.</a> Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).</li>
</ol>

Richard A. Bryan ve Kin Lo, Resipher sistemini üreten Lucid Scientific'in çalışanlarıdır.

RPE'nin mitokondriyal metabolizması, AMD ve PVR dahil olmak üzere yaygın kör edici retina hastalıklarının patogenezinde kritik bir rol oynar. RPE mitokondriyal metabolizmasının in vitro olarak modellenmesi, kişinin metabolik durumunu çevre dokularınkinden izole etmesine ve dokuyu kontrollü bir şekilde farklı hastalık simüle eden hakaretlere maruz bırakmasına olanak tanır. RPE mitokondriyal metabolizmasının bu tür in vitro modellemesi, in vivo RPE'ye yakın bir şekilde yaklaşmak için gerekli olan uygun farklılaşma durumuna ve polariteye ulaşan yüksek kaliteli insan primer ve iPSC-RPE kültürlerinin ortaya çıkmasıyla kolaylaştırılmıştır. Bu tür kültürlerde oksijen tüketim oranının (OCR) izlenmesi mitokondriyal metabolizmanın izlenmesi için ideal bir yöntem olsa da, OCR izleme kurulumu genellikle yüksek polarize ve tamamen farklılaşmış RPE için gerekli koşullarda büyüyen kültürleri engeller. Burada, Resipher'ı, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize RPE kültürlerinde OCR'nin gerçek zamanlı, uzun vadeli değerlendirmesi yoluyla RPE mitokondriyal metabolizmasını izlemek için yeni bir sistem olarak tanımlıyoruz.
RPE'de OCR'yi izlemek için başka yöntemler de kullanılmıştır. Seahorse XF Analyzer, mitokondriyal fonksiyonun akut manipülasyonları ile OCR'yi kısa süreler boyunca izlemek için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, Denizatı tahlilleri, hücrelerin yüksek RPE polaritesini ve farklılaşmasını desteklemeye elverişli olmayan özel plakalar üzerinde büyütülmesini gerektirir21. Calton, Vollrath ve meslektaşları, mikro gözenekli zarı parçalara ayırarak ve bunları Denizatı plakasına yerleştirerek mikro gözenekli destekler üzerinde büyütülen yüksek derecede farklılaşmış RPE kültürlerinin değerlendirilmesi için Denizatı'nı uyarladılar, ancak bu yöntem hala hücrelerin CO2'ye erişimi olmadığı için kültürlerin kısa süreli, son nokta izlemesi için çalışıyor Test sırasında, tahlil sadece steril olmayan koşullar altında yapılabilir ve mikro gözenekli desteğin kesilmesi, zamanla mikro gözenekli desteğin kenar kısmında ölüm ve işlev bozukluğuna neden olacaktır22. Barofuse, mikro gözenekli destekler üzerinde büyütülen RPE şeritlerinin perfüzyon sistemine yüklenebildiği ve OCR'nin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayan pompasız bir perfüzyon sistemidir23. Calton, Vollrath ve meslektaşları tarafından Denizatı için değiştirilmiş kuruluma benzer şekilde, Barofuse ile RPE değerlendirmesinin ana sınırlamaları, mikro gözenekli destekleri kesme ihtiyacı ve testin kısa vadeli, son nokta doğasıdır. Oksigraf ayrıca metabolik manipülasyonlara yanıt olarak OCR'deki hızlı kinetik değişiklikler için tasarlanmıştır24. RPE kültürleri için kullanılmamıştır ve Denizatı ve Barofuse ile yüksek derecede polarize ve farklılaşmış RPE kültürlerini değerlendirmek için aynı sınırlamalara maruz kalacaktır.
Bu diğer yöntemlerin aksine, burada açıklanan OCR sistemi, RPE, standart bir hücre kültürü CO2 inkübatöründe standart RPE ortamı ile standart koşullar altında standart hücre kültürü plakalarında/substratlarında kültürlenirken OCR'nin izlenmesine izin vererek, yüksek derecede farklılaşmış ve polarize RPE kültürlerinin kolay ve rahat bir şekilde problanmasını sağlar. Sistem tarafından gerçek zamanlı OCR değişiklikleri hakkında veri üretilmesine ek olarak, aynı hücreler OCR izleme süresinin sonunda ek tahliller için kullanılabilir. Bu, bir müdahalenin OCR üzerindeki etkisinin haftalar boyunca tekrar tekrar test edildiği (örneğin, Şekil 5'te RPE EMT indüksiyonu) veya bir müdahaleden uzun vadeli iyileşmenin test edilebileceği (örneğin, Şekil 3'te mitokondriyal ayrılmadan kurtarma) veya ilk müdahaleye yanıt olarak kademeli metabolik değişikliklerin izlenebildiği (örneğin, Şekil 1'de ortam besinleri tükendiğinde serumun OCR üzerindeki etkileri) oldukça esnek deneylere izin verir 2). Bu makaledeki OCR sistemi, yüksek derecede polarize ve farklılaşmış RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek için özellikle uygundur. Bu tür kültürler, sıkı paketleme ve ağır pigmentasyon ile işlevsel olarak postmitotiktir. Bu, her bir kuyucuğun neredeyse aynı hücre numaralarını9 içerdiği anlamına gelir, böylece çoğu deney için OCR'yi hücre numarasına normalleştirme ihtiyacını ortadan kaldırır. Hücre sayısına normalleştirme gerektiğinde bile, ağır RPE pigmentasyonu ve iyi sınırlandırılmış hücre sınırları, normalizasyonun, parlak alan görüntülemeye dayalı invaziv olmayan basit bir hücre sayımı ile gerçekleşmesine izin verir. Şekil 5'teki EMT deneyleri gibi farklılaşmamış RPE ve RPE proliferasyonunu içeren deneyler için, "hücre başına" OCR'nin ne olduğunu bilmek için kuyu başına OCR'yi hücre sayısına normalleştirmek gerekli hale gelir.
Retina alanının dışında, sistem, pankreas adacık hücreleri25, iskelet kası26, yumurtalık kanseri27, kardiyomiyositler28 ve hatta C. elegans29 gibi tüm organizmalar dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde hücresel solunum ve metabolik aktiviteyi incelemek için kullanılmıştır. Burada açıklanan OCR sistemini kullanarak OCR'nin gerçek zamanlı, uzun vadeli izlenmesi, bu çeşitli hastalık modellerinde biyoenerjetik kaymalar ve mitokondriyal işlev bozukluğu hakkında önemli bilgiler ortaya çıkardı.
Resipher sistemi sınırlamalar taşır. OCR'yi belirleme yöntemi, Denizatı Analizörü, BaroFuse veya Oxygraph'tan temel olarak farklıdır. OCR'yi hesaplamak için bir O2 gradyanının oluşturulmasını gerektirir ve gradyanın oluşturulması saatler alabilir. Bu nedenle, diğer sistemlerde mümkün olan hızlı kinetik deneyler bu sistemle mümkün değildir. Ayrıca, diğer sistemlerden farklı olarak, Resipher, küçük moleküllerin hızlı bir şekilde iletilmesi veya metabolitlerin toplanması için herhangi bir enjeksiyon portuna sahip değildir. Bunun yerine, algılama kapağı bir hücre kültürü başlığında çıkarılmalı, ilaçlar çivilenmeli veya ortam değiştirilmeli ve analiz edilecek metabolitlerin manuel olarak toplanması gerekir.
Bu belgede açıklanan OCR sistemini kullanarak bir deney oluşturmak ve sorun gidermek için aşağıdakiler önerilir. İlk olarak, buharlaşmayı en aza indirin. RPE tek katmanının üzerindeki ortam sütunundaki O2 gradyanının, sütun9'un yüksekliğine büyük ölçüde bağlı olduğunu ve sistemin OCR'yi O2 gradyanına göre hesapladığını hatırlayın. Bu nedenle, deney sırasında buharlaşma nedeniyle ortam sütununda belirgin bir alçaltma varsa, O2 gradyanı değişecek ve OCR okumalarını etkileyecektir. Kuluçka makinesinin su tepsisini dolu tutmak çok önemlidir, ancak 96 oyuklu plakanın kullanılmayan tüm kuyularına su yerleştirilmesi de önerilmektedir. Ayrıca, plakanın kenarındaki kuyular daha yüksek buharlaşma oranlarına sahiptir, bu nedenle bu kuyucuklar yukarıda sunulan tipik deneylerde hücrelerden boş bırakılır. OCR sistemindeki nem sensörü, kuluçka makinesinin neminin izlenmesine yardımcı olabilir. Şekil 8A'da, deney sırasında nemdeki düşüş, inkübatörün su tepsisinin boş olduğunu göstermektedir. Kuyuda buharlaşma hızlandıkça, kuyu için O2 konsantrasyonu okumaları daha yükseğe tırmanacak ve sonunda atmosferik O2 konsantrasyonunda (~ 200 μM) "düz çizgi" olacaktır (Şekil 8A).
İkinci olarak, OCR sisteminin "sandviçinin" uygun şekilde monte edildiğini onaylayın. Cihazın altındaki ve algılama kapağının üstündeki metal temas noktaları temiz olmalı ve tam teması engelleyecek kalıntılar olmamalıdır. Cihaz ve algılama kapağı, herhangi bir eğim olmaksızın 96 oyuklu plaka üzerine tam olarak aynı hizada ve eşit şekilde hizalanmalıdır. Cihazı Hub'a bağlayan USB kablosu gergin olmamalıdır, bu da "sandviçin" torkuna ve Cihazın düzgün hareketinin kısıtlanmasına neden olabilir.
Üçüncüsü, Cihazın ve algılama kapağı sensörlerinin kalibre edildiğinden emin olun. Şekil 2B , her deneyin başında uygun sensör işlevinin nasıl hızlı bir şekilde kontrol edileceğini detaylandırır. Dördüncüsü, deneysel manipülasyondan önce belirli bir kuyunun aykırı bir OCR göstermediğinden emin olun. Sensörlerin çalıştığından emin olduktan sonra, hücreli tüm oyuklar için temel OCR değerlerinin belirlenmesi, belirli kuyucukların sağlıksız hücreler içerip içermediğini belirlemeye yardımcı olabilir. Şekil 8B , mavi renkli kuyunun açıkça daha düşük bir OCR (ve dolayısıyla yüksekO2 konsantrasyonu) gösterdiği temel OCR değerlendirmesine tabi tutulan birkaç kuyuyu göstermektedir. Bu kuyu bir aykırıdır ve deneysel manipülasyonun dışında tutulmalıdır.
Beşincisi, aktif OCR okumaları sırasında çevresel manipülasyonları en aza indirin. O2 gradyanı, sıcaklık, nem, inkübatör CO2 seviyeleri ve atmosferik basınçtaki değişikliklere karşı oldukça hassastır. İnkübatör kapısının açılması bu faktörleri önemli ölçüde etkiler ve medya kolonunun O2 gradyanı dengeye dönene kadar OCR okumalarında geçici kesintilere neden olur (Şekil 8C). OCR'yi etkileyen parametreler, sistemin çevrimiçi arayüzünde "Ortam" sekmesi altında izlenebilir (Şekil 8A).
Altıncı olarak, deney için en uygun ortam hacmini belirleyin. Yetersiz ortam hacmi, aşırı buharlaşmadan (yukarıdaki ilk sorun giderme önlemine bakın) veya ortamdaki besin maddelerinin erken tükenmesinden kaynaklanan artefaktlar oluşturabilirken, aşırı ortam hacmi, RPE tek katmanına O2 kullanılabilirliğini sınırlar ve hipoksi9'u tetikler. Şekil 7 , ortam hacminin RPE tek katmanındaki O2 konsantrasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için mevcut olan çevrimiçi hesap makinesinin bir ekran görüntüsüdür. Belirli bir ortam hacmi için mümkün olan maksimum OCR, Şekil 9A'da görüntülenir. Belirli bir hacim kullanılarak yapılan belirli bir deney için OCR oranı, Şekil 9A'da gösterilen hıza yaklaşırsa, RPE tek tabakasındakiO2 konsantrasyonu anoksiye (%0) yaklaşır ve daha düşük bir ortam hacmi gerekir. Genel olarak, RPE kültüründe mitokondriyal olarak yoğun süreçleri içeren deneyler, 96 oyuklu başına 75 μL'den büyük olmayan ortam hacimlerine sahip olmalıdır.
Yedincisi, deneysel bir müdahalenin OCR üzerindeki etkilerini izole etmek için uygun normalleştirme yapın. Farklı kuyular farklı temel OCR'ye sahip olabileceğinden, deneysel bir müdahaleden önce her kuyu için temel OCR okumaları elde etmek çok önemlidir. Deneysel müdahalenin OCR üzerindeki etkisini gösteren "Delta OCR"yi elde etmek için deneysel müdahaleden sonra temel OCR'yi OCR'den çıkarın. "Delta OCR" elde etme yöntemi Şekil 3 ve Şekil 9B'de gösterilmiştir. Bir deneysel müdahalenin başka bir deneysel müdahalenin OCR'yi indükleme yeteneği üzerindeki etkileriyle ilgileniyorsa, ek bir normalleştirme adımı olan "Delta-Delta OCR" gereklidir. Böyle bir örnek, palmitatın (bir deneysel müdahale) artan OCR'yi (β-oksidasyonun indüksiyonu yoluyla) indükleme yeteneğinin, RPE kültürü için ortam tipine (ikinci bir deneysel müdahale) bağlı olduğu Şekil 9B'de gösterilmiştir.
Son olarak, kontaminasyon riskini en aza indirin. Sistem, hücrelerin üzerindeki ortama bir oksijen sensörü yerleştirerek OCR'yi izler. Bu da enfeksiyon riskini artırır. Deney sırasında OCR'de beklenmeyen düşüşler veya deneyin başlangıcında beklenmedik şekilde düşük OCR, bir enfeksiyonun belirtisi olabilir. Plakaların hücre kültürü mikroskobu altında enfeksiyon açısından aktif olarak izlenmesi gerekir. Bir algılama kapağı yeniden kullanılırsa 96 oyuklu plakalar arasında çapraz kontaminasyon meydana gelebilir. Bu tür çapraz kontaminasyonu en aza indirmek için, bir deney yapıldıktan sonra, algılama kapağının yeni bir deneyde yeniden kullanılmasından önce, dekontaminasyon için tüm kapak 20 dakika boyunca %70 etanole daldırılmalıdır (bkz. protokol bölüm 1.2.15).
Sonuç olarak, Resipher adı verilen yeni bir sistem kullanılarak OCR'nin değerlendirilmesi yoluyla yüksek kaliteli RPE kültürlerinde mitokondriyal metabolizmanın gerçek zamanlı, uzun süreli izlenmesi için bir protokol sunulmuştur. Yüksek derecede polarize ve farklılaşmış RPE kültürleri üzerinde, özellikle izole RPE'nin fizyolojik metabolik özelliklerinin yanı sıra AMD ve PVR dahil retina hastalığının in vitro modellerinde değişmiş RPE metabolizmasının araştırılması üzerinde çok sayıda uygulama için kullanılabilir.

Retina pigment epiteli (RPE), retinadaki ışığa duyarlı fotoreseptörler ile kan dolaşımı arasında bir bariyer oluşturan, fonksiyonel olarak postmitotik, oldukça polarize epitel hücrelerinin tek tabakasıdır, koryokapillaris olarak adlandırılan bir kılcal yataktır. Glia destekleyici nöronların rolü gibi, RPE de fotoreseptör dış segmentlerinin fagositozu, besinlerin taşınması ve fotoreseptörler için metabolik destek ve temel büyüme faktörlerinin salgılanması dahil olmak üzere fotoreseptörleri desteklemek için sayısız işlevi yerine getirir ve bunların tümü görsel işlevi sürdürmek için kritik öneme sahiptir.
RPE'nin dejenerasyonu, birkaç yaygın dejeneratif görme bozukluğunun temelini oluşturur. Dünyada tedavi edilemez görme kaybının en yaygın nedenlerinden biri olan yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD), RPE ölür ve bu nedenle üstteki fotoreseptörler ikincil bir dejenerasyona uğrar. Proliferatif vitreoretinopatide (PVR), RPE bunun yerine normalde hareketsiz olan postmitotik durumundan çıkar, çoğalır ve metabolizmasındaki değişikliklerle mezenkimal duruma (epitelyalden mezenkimal geçişe [EMT] olarak adlandırılır) farklılaşır. RPE farklılaşması, fotoreseptörlere RPE desteğinin kaybına neden olurken aynı zamanda daha fibrotik bir durumu tetikler. Bu, hem fotoreseptör dejenerasyonu hem de RPE'nin neden olduğu yara izi ile sonuçlanırve her ikisi de görme kaybını tetikler 1,2.
RPE'nin fotoreseptörlere desteğinin büyük bir kısmı metaboliktir ve metabolik düzensizlik, AMD ve PVR dahil olmak üzere çok sayıda retina hastalığında kritik bir faktördür. RPE, fotoreseptörler ile oksijen ve besin kaynakları olan koryokapillaris arasında düzenleyici bir bariyer görevi görür. Bu nedenle, RPE'nin metabolize etmeyi seçtiği şeye karşı RPE'nin koryokapilleristen fotoreseptörlere geçmeyi seçtiği şey, fotoreseptör metabolizmasını ve sağkalımını güçlü bir şekilde yönetir. Çok sayıda çalışma, RPE'nin normal sağlığı için büyük ölçüde mitokondriyal metabolizmaya bağımlı olduğunu ve fotoreseptörlerin bunun yerine büyük ölçüde glikoliz3'e dayandığını göstermiştir. Bu, fotoreseptörler ve RPE arasında tamamlayıcı, iç içe geçmiş metabolik durumlar kavramını ortaya çıkarmıştır. Spesifik olarak, RPE, tercih edilen fotoreseptör metabolik substratlarının metabolizmasını azaltır ve bunun yerine fotoreseptörlerin tüketmediği metabolitlerle birlikte fotoreseptör metabolizmasının yan ürünlerini kullanır. PVR ve AMD gibi hastalıklarda, kanıtlar RPE'nin daha glikolitik hale geldiğini ve mitokondriyal metabolizmaya daha az bağımlı hale geldiğini güçlü bir şekilde göstermektedir; RPE glikolize doğru bu kayma, ihtiyaç duyduğu metabolitlerin fotoreseptörlerini aç bırakarak dejenerasyonu tetikleyebilir 4,5,6. RPE ve fotoreseptör metabolizmasının ne kadar birbirine bağımlı olduğu ve retina hastalığının altında ne kadar değişmiş metabolizma olduğu göz önüne alındığında, RPE metabolizmasının terapötik amaçlar için modellenmesi ve manipüle edilmesine büyük ilgi vardır.
RPE mitokondriyal metabolizmasını in vivo olarak incelemek ideal olsa da, RPE mitokondriyal metabolizmasının birçok yönü sadece bir in vitro kültür sisteminde pratik olarak incelenebilir. Son birkaç on yılda, yüksek kaliteli RPE kültürlerine doğru önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, öyle ki, en dikkatli şekilde tımar edilen RPE kültürleri şu anda insan klinik çalışmalarında hücre replasman tedavisi için kullanılmaktadır7. Bu tür yüksek kaliteli kültürleri korumak için, RPE'nin deneyden aylar önce belirli ortamlarda, belirli substratlarda büyütülmesi gerekir. Bu koşullarla, RPE kültürleri maksimum düzeyde farklılaşır ve polarize edilir, bu da in vivo RPE'ye yaklaşır. Ne yazık ki, şu anda mitokondriyal metabolizmayı özellikle in vivo olarak RPE'den ölçebilecek hiçbir ekipman mevcut değildir. Retina kılcal damar ağının oksijen izlemesi, elektron paramanyetik rezonans (EPR) oksimetre8 kullanılarak in vivo olarak gerçekleştirilmiş olsa da, RPE analizi için bu mümkün değildir. RPE metabolizması in vivo ve in vitro arasındaki farklar iyi tanımlanmamıştır, ancak RPE kültürlerinin RPE'ye benzer şekilde yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir in vivo 3,9, bu da RPE mitokondriyal metabolizması hakkında önemli bilgiler edinilebileceğini düşündürmektedir.
Tüm mitokondriyal metabolizma oksijen tüketimine yol açtığından, RPE oksijen tüketim oranlarının (OCR) ölçülmesi mitokondriyal metabolizma için sadık bir vekildir. Maksimum RPE polarizasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen koşullar genellikle Denizatı Analizörü gibi şu anda mevcut olan tekniklerle uzun vadeli doğru OCR ölçümlerini engellediğinden, RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek zor olmuştur. Bu yöntem makalesinde, polarizasyonu ve farklılaşmayı maksimum düzeyde destekleyen koşullar altında yetiştirilen RPE'de OCR'nin haftalar boyunca sürekli olarak ölçülmesine izin veren Resipher (bundan böyle "sistem" olarak anılacaktır) olarak adlandırılan yeni bir cihaz tanıtılmaktadır. RPE farklılaşmasını ve polarizasyonunu maksimum düzeyde destekleyen RPE kültür koşullarında OCR'nin bu sistem tarafından ölçülebilme kolaylığı, mevcut OCR ölçüm cihazları arasında benzersizdir.
Bu makale, sistemi RPE kültürleriyle kullanmak için ipuçları ve püf noktaları sağlar, ardından iki özel uygulamanın bir gösterimi yapılır. İlk olarak, PVR'yi taklit eden RPE EMT, dönüştürücü büyüme faktörü-beta'ya (TGFβ) maruz kalarak tetiklenir1,10,11,12. Sistem, EMT süreci sırasında RPE metabolizmasının nasıl geliştiğini izlemek için kullanılır. İkinci olarak, hipoksi'nin RPE metabolizmasındaki rolü bu sistem kullanılarak araştırılmıştır. Hipoksi, koryokapillaris13,14 yaşla birlikte inceldiği için AMD'nin patogenezine önemli bir katkıda bulunur. Bu sistemi hipoksi odalarıyla birleştirmek, yaşlanmaya eşlik eden ince hipoksi ile değişmiş RPE mitokondriyal metabolizmasını modellemeye izin verir. Son olarak, RPE kültürlerinin hipoksik, normoksik veya hiperoksik koşullarda olup olmadığını belirlemeye izin vermek için Resipher verilerini kullanan bir çevrimiçi hesap makinesi tanıtıldı. Bu tür bilgiler, in vitro RPE kültür çalışmalarından RPE metabolizması hakkında herhangi bir sonuç çıkarmak için kritik öneme sahiptir.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td> <td># 25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>3,3 ', 5-triiyodo-L-tironin sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>32 kanallı Resipher kapağı</td><td>Lucid Scientific</td><td>NS32-101A Falcon</td><td></td></tr><tr><td>Antimisin A için streptomyces sp.</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>Elektron taşıma zincirinin Kompleks III'ünün inhibitörü</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>Mitokondriyal solunumu artırmak için ayırma maddesi</td></tr><tr><td>DMSO, hücre kültürü sınıfı</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>Mitokondriyal ilaçların sulandırılması için araç</td></tr><tr><td>Hücre dışı matris kaplama yüzeyleri: Synthemax II-SC</td><td>Corning</td> <td># 3535</td><td>hfRPE için hücre dışı matris</td></tr><tr><td>Hücre dışı matris kaplama substratları: Vitronectin</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td>iPSC-RPE</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920-10MG</td> için hücre dışı matris <td>Mitokondriyal solunumu artırmak için ayırma maddesi</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (Bio-Techne S11550H)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon-Siklodekstrin</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksi odası</td><td>Embrient Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>N1 Medya Takviyesi</td><td>Sigma</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>O2 sensörü</td><td>Sensit teknolojisi veya Adli Bilişim Dedektörleri</td><td>P100 veya FD-90A-O2</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan TGF ve beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>100-35B</td><td>Epitelyal-mezenkimal geçişi indüklemek için büyüme faktörü beta-2'nin dönüştürülmesi</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875-1G</td><td>Elektron taşıma zincirinin Kompleks I'inin inhibitörü</td></tr><tr><td>Sistem uyumlu plaka</td><td>Corning</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM (Eagle's Media'nın Alfa Modifikasyonu)</td><td>Corning</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek derecede diferansiye ve polarize retinal pigment epitel kültürlerinde oksijen tüketim oranlarının uzun süreli İzlenmesi

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

Mitokondriyal metabolizma, retinada fotoreseptörün sağkalımı için önemli olan tek bir hücre tabakası olan retina pigment epitelinin (RPE) normal işlevi için kritik öneme sahiptir. RPE mitokondriyal disfonksiyonu, gelişmiş dünyada geri dönüşü olmayan körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve retina dekolmanlarının kör edici bir komplikasyonu olan proliferatif vitreoretinopatinin (PVR) ayırt edici bir özelliğidir. RPE dejeneratif koşulları, in vivo RPE'yi taklit etmek için oldukça farklılaşmış ve polarize edilmiş RPE kültür sistemleri tarafından iyi modellenmiştir. Bununla birlikte, mitokondriyal fonksiyonun bir temsilcisi olan oksijen tüketim oranlarının (OCR) izlenmesi, bu tür kültür sistemlerinde zor olmuştur, çünkü ideal RPE polarizasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen koşullar kolay OCR ölçümlerine izin vermez. 
Burada, RPE'yi standart bir hücre kültürü inkübatöründe optimal büyüme substratları ve fizyolojik kültür ortamı üzerinde tutarken, iyi farklılaşmış RPE kültürlerinde OCR'yi haftalarca izlemek için yeni bir sistem olan Resipher'ı tanıtıyoruz. Bu sistem, hücrelerin üzerindeki ortamda bulunan oksijen konsantrasyonu gradyanını ölçerek OCR'yi hesaplar. Bu sistemin OCR'yi tespit etmek için diğer yöntemlere göre avantajlarını ve RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek için sistemin nasıl kurulacağını tartışıyoruz. Sistemi kullanmayla ilgili önemli ipuçlarını ve püf noktalarını ele alıyor, verileri yorumlama konusunda uyarıda bulunuyor ve beklenmeyen sonuçları gidermeye yönelik yönergeleri ele alıyoruz. 
Ayrıca, sistem tarafından algılanan hücrelerin üzerindeki ortamdaki oksijen gradyanına dayalı olarak hipoksi, normoksi veya hiperoksi RPE kültürleri deneyiminin seviyesini tahmin etmek için çevrimiçi bir hesap makinesi de sağlıyoruz. Son olarak, bir PVR modelinde RPE hücrelerinin metabolik durumunu ölçmek ve RPE'nin metabolik olarak hipoksiye nasıl adapte olduğunu anlamak için sistemin iki uygulamasını gözden geçiriyoruz. Bu sistemin yüksek derecede polarize ve diferansiye RPE kültürlerinde kullanılmasının, hem fizyolojik hem de hastalık durumları altında RPE mitokondriyal metabolizması hakkındaki anlayışımızı artıracağını tahmin ediyoruz.

Retina pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde oksijen tüketim oranlarını (OCR) ölçmek için yeni bir cihaz sunuyoruz. Cihaz, plakalar standart bir hücre kültürü inkübatöründeyken standart hücre kültürü plakaları üzerinde standart ortamla büyütülen RPE üzerinde bir seferde haftalarca OCR'yi ölçebilir.

Yüksek Derecede Diferansiye ve Polarize Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Oksijen Tüketim Oranlarının Uzun Süreli İzlenmesi

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

long-term-monitoring-oxygen-consumption-rates-highly-differentiated

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Bu protokol, farelerin retinal düz montajlarının hazırlanması ve immünofloresan boyanması ve analizi için ayrıntılı bir yöntemi açıklamaktadır. Floresein fundus anjiyografinin (FFA) fare yavruları ve görüntü işleme için kullanımı da ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Oksijene Bağlı Retinopati Fare Modelinde Retina Damarlarının Dinamik Büyümesinin İzlenmesi

İnsan retinal pigment epitel hücrelerinin (H-RPE) metabolik durumu, sağlıklarını ve işlevlerini yansıtır. Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak H-RPE'nin gerçek zamanlı metabolik akısını incelemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Bu protokol, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize olmuş insan retinal pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde bir lipofussin birikim modelini ve RPE'nin toplam OS tüketimini/bozulma kapasitesini saptamak için geliştirilmiş bir dış segment (OS) fagositoz testini tanımlamaktadır. Bu yöntemler, önceki lipofussin modellerinin ve klasik nabız kovalama dış segment fagositoz testlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir.

Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

Canlı dokunun gerçek zamanlı analizi, önemli fonksiyonel ve mekanik veriler sağlar. Bu makale, çok çeşitli doku ve hücre modellerini koruyan ve değerlendiren yeni ve pompasız çok kanallı akışkan bir sistem tarafından doğru ve tekrarlanabilir veri üretimini sağlamak için protokolleri ve kritik değişkenleri açıklamaktadır.

Yeni bir pompasız akışkan sistemi kullanarak gözün çeşitli doku ve hücre tiplerinin bakımı ve değerlendirilmesi

Bu çalışmada, kimyasal maddeler, endüstriyel atık su veya kanalizasyon ve tuzlu kabuklu sıvı çevresel örneklerde tarafından uygulanan uzun vadeli (14 gün) ölümcül toksisite belirlemek için değerli bir metodolojik protokolünün geliştirilmesi ve standardizasyonu ile...

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Cıvıldamak uzun kodsuz RNA'lar genomik bağlanma yerleri (lncRNAs) eşleştirmek için yeni ve hızlı bir tekniktir. Yöntemi lncRNA bağlı genomik sitelerin numaralandırılmasına izin anti-sense fayans oligonükleotidden özgüllük yararlanır.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

MıkroRNA (miRNA) insan kaynaklı-pluripotent kök (iPS) hücreleri (iPS-RPE), ve fetal RPA'nin türetilen insan kaynaklı-pluripotent kök profilleri (iPS) hücreleri, retina pigment epiteli (RPE), karşılaştırıldı.

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

Retina pigment epitel hücreleri hücre-replasman tedavisi için Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu gelişmiş form olarak hizmet verebilir. Bu iletişim kuralı coğrafi Atrofi büyük gözlü modeli ve hastalık bu modeline insan embriyonik kök hücre kaynaklı retina pigment epitel hücrelerinin nakli subretinal nesil açıklar.

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Retina pigment epiteli (RPE) çok fonksiyonlu bir epitel göz olduğunu. Burada bir iletişim kuralı fare RPE türetilmiş birincil hücre kültürleri kurmak için mevcut.

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

Keşfedin, Resipher cihazı ile retinal pigment epiteli kültürlerinde oksijen tüketim oranlarını haftalar boyunca izleme yöntemini. Mitokondriyal fonksiyon değerlendirmesi için ideal koşullarda sürekli biyoenerjetik profilleme sağlar.

Yüksek Derecede Diferansiye ve Polarize Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Oksijen Tüketim Oranlarının Uzun Süreli İzlenmesi

Daha fazla video keşfet