İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

Trombosit prokoagülan oluşumu hemostazı sürdürmek için çok önemlidir. Bu işlem, pıhtılaşma adımları için gerekli olan trombosit yüzeyinde fosfolipidlerin ekspresyonunu ve mikrovezikül salınımını içerir. Bu sürecin değerlendirmeleri, çeşitli insan hastalıklarında trombosit prokoagülan yanıtlarının nasıl olduğuna dair yeni veriler sağlamıştır.

Flow sitometri, trombositler ve mikrovezikül salınımı üzerindeki fosfatidilserin ekspresyonunun değerlendirilmesinde bir köşe taşı olmuştur ve yaygın olarak kabul görmüştür. Saflaştırılmış trombositlerin kandan izolasyonu ve analizi zaman alıcıdır ve özel laboratuvar ekipmanı gerektirir ve bu nedenle şu anda rutin klinik tanı için mevcut değildir. Fosfatidilserin maruziyetini ve mikrovezikül salınımını analiz etmek, küçük boyutları ve ilgilenilen belirteçler için düşük sayıda pozitif olay nedeniyle de zordur.

Başlamak için, sitrik asit ve dekstroz ile aktif antikoagülan trisodyum sitrat içeren toplama tüplerinde periferik venöz kanı toplayın. Kanı antikoagülanla karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika dinlendirin. Santrifüjleme için doğru hızı belirlemek için otomatik bir hücre sayacı kullanarak trombositleri sayın.

Trombositten zengin plazmayı hazırlamak için, kanı 250 g'da oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ara vermeden santrifüjleyin. Daha sonra 9 mililitre trombositten zengin plazmaya 1 mililitre ACDA ve 6.25 mikrolitre apiraz ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.100 g'da santrifüjleyin.

Bir Mera pipeti kullanarak, trombositten fakir plazma içeren süpernatanı çıkarın ve trombosit peletini 1 mililitre yıkama tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin. Daha sonra tüpe 3 ila 4 mililitre yıkama tamponu ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti 1 mililitre yıkama tamponunda tekrar askıya alın.

Otomatik bir hücre sayacındaki hücreleri saymak için 150 mikrolitre trombosit süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha önce gösterildiği gibi ek bir yıkama gerçekleştirmek için kalan süspansiyona 3 ila 4 mililitre yıkama tamponu ekleyin. Daha sonra, litre başına 11 trombosit gücüne 5 x 10'luk bir nihai konsantrasyon elde etmek için trombosit peletini reaksiyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Başlamak için, akış sitometrisi için istenen tamponda yıkanmış trombositler elde edin. Reaksiyon tamponundaki tüm agonistleri ve florokromları hazırlayın. Dahili tahliller için, farklı tedavi tüplerine litre başına 9 trombosit gücüne 50 x 10 konsantrasyonda 100 mikrolitre yıkanmış trombosit ekleyin.

Her bir alikotu hafifçe sallayın ve 37 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin. Daha sonra her bir mikrotüpe 5 mikrolitre seyreltilmemiş Annexin V-FITC ekleyin ve inkübe edin. Daha sonra, işlemi durdurmak için her tüpe 500 mikrolitre reaksiyon tamponu ekleyin.

İleri dağılım veya FSC kullanarak trombosit popülasyonunu kapatın ve her popülasyonu bağımsız olarak tanımlamak için yoğunluk grafiklerini kullanın. Negatif kesmeyi, dinlenme durumu trombosit popülasyonunun en sağında ayarlayın. Aktivasyondan sonra, bu kesimin sağındaki olayları fosfatidilserin açığa çıkaran trombositler olarak sınıflandırın.

Mikro-parçacıkları ayırt etmek için, kesmeyi dinlenme trombosit popülasyonunda gözlenen en düşük FSC değerine ayarlayın. Aktivasyondan sonra, bu eşiğin altındaki fosfatidilserin pozitif olaylarını mikro-parçacıklar olarak sınıflandırın. Temel ölçümler, aktive edilmemiş trombositlerin %2.9'undan daha azının fosfatidilserin maruziyeti sergilediğini gösterdi.

Aktivasyon üzerine trombositlerin %26.7'si kollajen, %9.1'i trombin ve %36.2'si hem kollajen hem de trombin ile fosfatidilserin pozitif hale geldi. İyonofor tedavisi %49.6 fosfatidilserin pozitif trombosit ile sonuçlandı. Mikro-parçacıkların başlangıç oranı %0.3 idi.3 Sadece kollajen ve trombin ile birlikte yaklaşık% 11.4 ve iyonoforlarla% 44 oranında önemli artışlar gözlendi