Name: İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Keşfedin, insan kanından saflaştırılmış trombosit izolasyonu ve akış sitometrisi ile fosfatidilserin maruziyeti ve mikrovezikül salınımını ölçerek prokoagülan trombositleri karakterize etme yöntemini. Bu protokol hemostaz mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Trombosit Fosfatidilserin ve Mikrovezikül Salınımının Analizi

<table><tbody><tr><td>(CD42b, GPIX) APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13980</td><td></td></tr><tr><td>ACD-A kan alma tüpleri</td><td>BD Vacutainer 366645</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin-V FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>560931</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase Grade VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini% 30</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 0.25M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit monohidrat</td><td>Merck</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen ve nbsp;</td><td>Stago</td><td>86924</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>İyonofor&nbsp;</td><td>Calbiochem/VWR 100105</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidrojen karbonat</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>NaHCO3</sub</td></tr><tr><td>>Trombin&nbsp;</td><td>Hyphen Biomed</td><td>EZ 006 A Trisodyum</td><td></td></tr><tr><td>sitrat dihidrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Na3C6H5O7*2H2O</td></tr><tr><td>&alfa; IIb entegratörü (CD41, GPIIb) PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607115</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan saflaştırılmış trombositlerinden fosfatidilserin maruziyeti ve mikrovezikül salınımının Ölçülmesiyle prokoagülan trombosit karakterizasyonu

Procoagulant Platelet Characterization by Measuring Phosphatidylserine Exposure and Microvesicle Release from Human Purified Platelets

Prokoagülan trombositlerin ve mikro-parçacıkların miktar tayini, numune başına en az 50.000 olay kaydedilen Annexin-V boyama kullanılarak elde edilir. Adım 2.2'de belirtildiği gibi, Şekil 1A'da gösterildiği gibi, reaksiyon tamponu ile inkübe edilen numunelerden temel trombosit ölçümleri alınmıştır. Trombosit boyutları medyan öne doğru saçılma (FSC) değeri kullanılarak ölçüldü. FSC çeşitli faktörlerden etkilenirken, trombositler de dahil olmak üzere hücre boyutu tahmini için ortak bir vekil olmaya devam etmektedir. Alanın yoğunluk grafikleri (Şekil 1A), dinlenme trombositlerini ve salınan mikro-parçacıkları tanımlamak ve kapılamak için kullanıldı.
Aktive edilmemiş trombositler söz konusu olduğunda,% 2.9'dan azı Annexin-V boyama ile belirlendiği gibi fosfatidilserin (PS) gösterdi. Yıkanmış trombositlerin tek başına kollajen ile veya trombin veya kalsiyum iyonofor ile birlikte aktivasyonu üzerine, PS maruziyetinde gözlenebilir bir artış olmuştur. Tek başına kollajen, PS pozitif trombositlerde% 26.7'lik bir artışa neden oldu. Trombin, PS maruziyeti üzerinde minimal etkilere sahipti (% 9.1), ancak kollajen ile ilişkili olduğunda, PS'ye maruz kalan trombositlerin yüzdesini% 36.2'ye çıkardı. Referans olarak, 2 μM iyonofor ile tedavi, trombositlerin% 49.6'sının prokoagülan hale gelmesine neden oldu.
Şekil 1 , sağlıklı bir bireyde yıkanmış trombositlerden elde edilen mikro-parçacıkların başlangıç oranının minimum olduğunu göstermektedir (% 0.3). Trombin ve kollajen mikrovezikül oluşumunu minimal düzeyde artırırken, sadece kollajen ve trombin kombinasyonu ile mikrovezikül oluşumu anlamlı olarak artmıştır (Şekil 1D; .4). 2 μM iyonofor eklenmesi, kontrol trombositleri tarafından oluşturulan mikro-parçacıkların% 44.0'ının PS'ye maruz kalmasına neden oldu.
Şekil 2 , bu süreçten beklenebilecek varyasyon, tekrarlanabilirlik ve tekrarlanabilirlik ile ilgili bilgiler sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig01.jpg"> 
Şekil 1: İstirahat ve aktif kontrol trombositlerinde PS maruziyeti ve mikrovezikül oluşumu. Trombositler ya aktive edildi ya da aktive edilmedi (İstirahat) (A), 30 μg/mL kollajen (B), 0.5 U/mL trombin (C), kollajen ve trombin (D) ile 2 μM iyonofor kombinasyonları ile. Temsili nokta grafikleri, Annexin-V bağlamasına karşı trombosit boyutunu (ileri dağılım (FSC log)) gösterir. Yatay ve dikey çizgiler (E) trombosit negatif popülasyonu tanımlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig02.jpg"> 
Şekil 2: İyonofor ile inkübasyondan sonra PS maruziyetinin ve mikrovezikül oluşumunun tekrarlanabilirliği ve tekrarlanabilirliği. Sitrat (bir kalsiyum şelatörü) ile tedavi edilmiş veya tedavi edilmemiş yıkanmış trombositlerde 2 μM veya 5 μM iyonofor ile inkübasyondan sonra PS maruziyeti ve mikrovezikül oluşumunun analizi: (A) 4 farklı sağlıklı kontrolden; (B) 5 kez tekrarlanan bir sağlıklı kontrolden; ve (C) iki farklı teknisyen tarafından hazırlanan iki sağlıklı kontrolden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tam kandaki trombosit sayısı (mL başına10-9 )</td>
			<td>Bağıl merkezkaç kuvvetleri (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt;30</td>
			<td>70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-50</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51-100</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-300</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-600</td>
			<td>290</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt;600</td>
			<td>340</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Tam kandaki trombosit sayısına göre trombositten zengin plazma hazırlığı için bağıl merkezkaç kuvvetleri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reaktif</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sitrik asit monohidrat (C6H8O7. H2O, 38 mM)</td>
			<td>8 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodyum sitrat dihidrat (Na3C6H5O,7.2H2O, 61 mM)</td>
			<td>180 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glikoz (C6H12O6, 136 mM)</td>
			<td>24,6 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Çözeltinin pH'ı ayarlanmamalıdır. Çözeltiyi 4 °C'de tutun.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: 1 L sulu asit-sitrat-dekstroz (ACD) çözeltisinin hazırlanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reaktif</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sitrik asit monohidrat (C6, H, 8, O, 7. H2O, 36 mM)</td>
			<td>7.56 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (103 mM)</td>
			<td>6 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (NanoOH)</td>
			<td>4 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0.203 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">PH'ı 6.5'e ayarlayın. Çözeltiyi 4 °C'de tutun.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 3: Yıkama Tamponu stok çözeltisinin hazırlanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reaktif</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% 30 Sığır Serum Albümini (BSA)</td>
			<td>583 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0.25 m</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glikoz</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apiraz</td>
			<td>31,5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 4: Stok çözeltisinden 50 mL'lik doğaçlama bir Yıkama Tamponu çözeltisinin hazırlanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reaktif</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (137 mM)</td>
			<td>8 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2,7 mM)</td>
			<td>0.2 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0.203 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (5 mM)</td>
			<td>1.19 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (12 mM)</td>
			<td>1 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H 2O; 0,3 milyon</td>
			<td>0.05 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">PH'ı 7.4'e ayarlayın. Çözeltiyi 4 °C'de tutun.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 5: Reaksiyon Tamponunun bir stok çözeltisinin hazırlanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reaktif</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% 30 Sığır Serum Albümini (BSA)</td>
			<td>167 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0.25 m</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glikoz</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 6: Stok çözeltisinden 50 mL'lik doğaçlama bir Reaksiyon Tamponu çözeltisinin hazırlanması.

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and ...

procoagulant-platelet-characterization-measuring-phosphatidylserine

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, megakaryositlerin farklılaşması ve trombosit oluşumu için bir teknik göstermektedir. İnsan göbek kordonu kanından izole edilen hematopoietik kök progenitör hücreler, trombopoietin varlığında olgun megakaryositlere farklılaşır. Olgun megakaryositler, tek tek trombositlere yol açan proplateletler adı verilen sitoplazmik uzantılar üretir.

Megakaryositlerin Farklılaşması ve Trombosit Oluşumu için İn Vitro Yöntem

Bu video, kayma stresinin trombositler üzerindeki etkisini değerlendirme yöntemini göstermektedir. Antikor tedavisi, mekanoreseptör komplekslerinde ayrışma ve konformasyonel değişikliklere neden olur, trombositleri aktive eder ve yüzeydeki belirteçleri eksprese eder. Bu belirteçler immün boyama ve akış sitometrisi ile gözlenir.

Kayma Gerilmesinin Mekanosensoriyel Reseptörlere Karşı Antikorlarla Tedavi Edilen Trombositler Üzerindeki Etkileri

Bu makale aynı zamanda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmayı ölçen hemostaz deneysel model tanımlamaktadır. Trombosit ve fibrin floresans gerçek zamanlı olarak ölçülür ve platelet yapışma oranı, bir pıhtılaşma hızının, pıhtılaşma başlangıcı belirlenir. Model transfüzyonu için konsantreleri akışı altında trombosit prokoagülan özelliklerini belirlemek için kullanılır.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Biz bulanıklık derecesi agonist kaynaklı trombosit agregasyon ölçümleri ile takip insan kanından yıkanıp trombosit izolasyonu için basit bir yöntem tarif eder. Bir örnek olarak, Pannexin1 kanalı inhibitörü Parlak Mavi FCF ile bir ön kuluçkalama sonrası kollajen insan trombosit agregasyon cevap üzerinde çalışma yapılması için bu yöntemi uygulanır.

Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış

Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Microparticle içeriği trombosit konsantreleri eleme üzerinde trombosit stok yönetimi, hastane kan bankaları yeni bir kalite iyileştirme girişimidir. Trombosit kullanımını optimize etmek için trombosit sigara-harekete geçirmek harekete geçirmek ayırt etmek için hedeftir. Hematoloji-Onkoloji hastaları için aktif trombosit sağlayan ateşe dayanıklı olmak için yüksek risk azaltabilir.

Trombosit transfüzyonları Microparticles için yöntem eleme rutin

Koni plaka Viskozimetre kullanılarak trombosit yüzey reseptörlerine Tekdüzen kesme uygulamak için bir çözüm içi yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, diğer hücre türlerine ve hücre parçalara kesme uygulamak için daha geniş ölçüde kullanılabilir ve belirli bir ligand-reseptör çifti hedeflemek gerekmez.

Koni-plaka viskozimetre ile ınsan trombosit ve hücre yüzeyi reseptörleri için Tekdüzen kesme tahlil

Akış altındaki trombosit fonksiyonu değerlendirilebilir ve simüle edilmiş hemostatik resüsitasyon, travma ve transfüzyon tıbbında uygulamaları olan bir mikroakışkan cihaz kullanılarak modellenebilir.

Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar

Trombositler için çok renkli akış sitometrisi, klasik trombosit alt popülasyonları içinde istirahat, agregatör, prokoagülan ve apoptotik trombositler gibi yeni trombosit alt tiplerini tanımlayabilir. Bu, çeşitli trombosit agonistleri tarafından indüklenen farklı alt popülasyon modellerinin karşılaştırılmasına izin verir. Burada, çok renkli bir akış sitometrisi paneli oluşturmak için bir prosedür ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Trombosit Alt Popülasyonlarının Çok Renkli Akış Sitometrisi ile Analiz Edilmesi

Mevcut protokol, nekroz, apoptoz ve trombosit aktivasyonunun örtüşen özelliklerini sergileyen prokoagülan trombositleri analiz etmek için gerekli olan kapsamlı bir dizi prosedür sağlar.

Nekroz, Apoptoz ve Trombosit Aktivasyonu Özellikleri Sergileyen Prokoagülan Trombositlerin Kapsamlı Analizi

Bu çalışma, kanda trombus oluşumunu tetiklemek için kesme stresi kullanan ve trombü birden fazla boyutlu okuma ile karakterize eden bir mikrofluidik testi tanımlar. Bu test, kan örneklerinin protrombotik eğilimini ölçebilir ve bu nedenle hastalık teşhisi, ilaç keşfi ve trombozla ilgili temel mekanik çalışmalarda faydalıdır.

Trombus Profilleme Testi: Biyomekanik Trombogenezin Kapsamlı Karakterizasyonu İçin Mikrofluidik Tabanlı Bir Platform

Keşfedin, insan kanından saflaştırılmış trombosit izolasyonu ve akış sitometrisi ile fosfatidilserin maruziyeti ve mikrovezikül salınımını ölçerek prokoagülan trombositleri karakterize etme yöntemini. Bu protokol hemostaz mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet