In vivo (İn canlı) Leishmania infantum ile Enfekte Hamsterlerin Luciferaz İfade Eden Aksenik Amastigotların Dişeti Aşılaması ile Görüntülenmesi
April 4th, 2025
Burada, L. infantum-Luc ile intraperitoneal (IP) veya intragingival (IG) enfekte olmuş altın hamsterlerin biyolüminesan görüntüleme ve PCR ile boylamsal bir değerlendirmesini sunuyoruz. Hamsterlar enfeksiyondan 1 gün sonra (1 dpi), enfeksiyondan 1 hafta sonra (8 dpi) ve enfeksiyondan 3 hafta sonra (22 dpi) değerlendirildi ve 50. dpi ve enfeksiyondan 8 ay sonra ötenazi yapıldı.
Leishmania infantum'un hamsterların dişeti venine intravenöz enjeksiyonu için bir metodoloji oluşturmayı ve enfeksiyon için alternatif bir yol olarak potansiyelini değerlendirmeyi amaçladık. Ek olarak, aksenik amastigotların enfeksiyon için promastigotlardan daha iyi bir seçenek olup olmayacağını araştırdık ve takip için biyolüminesan görüntüleme sistemini kullandık.
İn vivo görüntüleme sistemi, enfeksiyon değerlendirmesinin iyileştirilmesidir. Biyolüminesan bölgeler aynı hayvanda gerçek zamanlı olarak takip edilebilirken, en çok kullanılan diğer değerlendirmeler kan ve dokulardaki parazit yükü, histopatolojik analiz ve ötenazi gerektirebilecek PCR olacaktır.
Dişeti damarı minimal invazivdir. Diğer intravenöz enfeksiyon yollarıyla karşılaştırıldığında lokal yaralanmalar olmadan intravenöz erişime izin verir. Bir diğer önemli nokta ise aksenik amastigotların dokulardan elde edilen amastigotların aksine in vitro olarak elde edilebilmesidir.
Dişeti veni yoluyla Leishmania enfeksiyonu için, ven perforasyonu, kanama ve inokül sızıntısı nedeniyle daha küçük bir ölçü uygulandı. Biyolüminesan görüntüleme sistemi, enfeksiyonun uzun süre azaldığını ve sadece enfeksiyonun yavaş ilerleyen ve düşük parazit yükü gösteren referans suşun bir özelliği olan PCR ile tespit edilebildiğini ortaya koydu.
Altın hamsterlarda L. infantum için başka bir enfeksiyon yolunu standartlaştırdık. Dişeti damarına intravenöz enfeksiyonlar gerçekleştirerek, preklinik testler için stabil ve tekrarlanabilir bir enfeksiyon oranı elde etmeyi amaçlıyoruz.
[Görüşmeci] Başlamak için, anestezi uygulanmış hamsteri iki elinizi kullanarak sırtüstü pozisyonda tutun. Diş etini ve diş eti damarını ortaya çıkarmak için alt dudağı başparmaklarınızla nazikçe aşağı çekin. Daha ince bir iğne ile birleştirilmiş bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, iğneyi alt kesici dişlerin altına, diş çifti arasındaki orta hat boyunca 25 derecelik bir açıyla konumlandırın. İğneyi mandibular labial ven içine iki ila dört milimetre sokun. İğnenin mandibular labial vende olduğunu doğrulamak için şırıngaya kan aspire edin. Kanın iğnenin namlusuna ulaştığından emin olun. PBS'deki fantom amastigotlarda veya promastigotlarda Leishmania'yı ifade eden 100 milyon ateşböceği lusiferaz içeren 50 mikrolitre aşıyı yavaşça enjekte edin. İğneyi çıkarmadan önce pamuklu çubukla hafif baskı uygulayın. Hemostazı teşvik etmek için pamuklu çubukla basıncı korurken aynı anda iğneyi damardan çıkarın. Elinde Leishmania ve phantom ile enfekte olmuş hamsterı kısıtlayın. Hamsterın içine intraperitoneal olarak kilogram başına 150 miligram deluciferan enjekte edin. Anestezi uygulandıktan beş dakika sonra, biyolüminesans görüntüleme için hayvanı ventral pozisyona getirin. CCD kameranın altında. Enfeksiyondan iki saat 24 saat sonra ve enfeksiyondan sekiz ila 22 gün sonra hamsterın görüntülerini elde edin. Biyolüminesans emisyon seviyelerine bağlı olarak, maruz kalma süresini 30 saniye ile beş dakika arasında ayarlayın. Gruplamayı orta veya büyük olarak seçin, F/Durdur'u 1 olarak ayarlayın ve Görüş Alanı'nı D olarak seçin. Hayvanın kafası ve vücudundaki ilgi alanlarını veya yatırım getirisini belirlemek için manuel ölçüm aracını kullanın. CCD kameradan seçilen ROI'deki biyolüminesansı ölçün. Arka plan sinyalini ölçmek için ortalama ROI'yi hesaplayın ve bunu manuel ROI'den elde edilen biyolüminesan emisyondan çıkarın. Parlaklıktaki biyolüminesans emisyonunu steradyan başına santimetre kare başına saniyede foton olarak ifade edin. Leishmania ve phantom ile intragingival olarak enfekte olmuş hamsterlerin maksiller bölgesinde, amastigot ile enfekte olmuş hayvanlar, enfeksiyondan iki saat ve bir gün sonra promastigot enfekte olanlardan daha yüksek biyolüminesans göstermiştir. Enfeksiyondan sekiz gün sonra, promastigot ile enfekte hayvanlarda biyolüminesansta% 36'lık bir düşüş ve maksiller bölgedeki amastigot ile enfekte hayvanlarda% 90'lık bir düşüş gözlenmiştir. Enfeksiyondan 22 gün sonra, hem promastigot hem de amastigot ile enfekte hayvanlar, maksiller bölgede benzer düşük biyolüminesans seviyeleri gösterdi. Dişeti yolu yoluyla amastigotlarla enfeksiyondan sekiz ay sonra, karaciğerde PCR ile parazitler tespit edilebildi ve ayrıca orta derecede piloereksiyon, orbital sıkılık ve kemerli duruş gösterdi.
Genel Bakış
Bu çalışma, altın hamsterların diş eti damarına intravenöz olarak Leishmania infantum enjeksiyonu için bir yöntem standardizasyonunu alternatif enfeksiyon yolu olarak belirlemektedir. Enfeksiyonu zaman içinde değerlendirmek için biyolüminesan görüntüleme kullandık ve bu sayede aksinik amastigotların, promastigotlere kıyasla enfeksiyon için daha uygun bir seçenek olabileceğini ortaya koyduk.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Enfeksiyon yöntemleri
- Leishmania infantum patogenezi
- Enfeksiyöz hastalık araştırmalarında hamster modeli
Arka Plan
- Leishmania enfeksiyonları farklı enfeksiyon yollarının değerlendirilmesini gerektirir.
- Biyolüminesan görüntüleme enfeksiyonun gerçek zamanlı izlenmesini sağlar.
- Diş eti damarından erişim, minimal invaziv olarak kabul edilir.
Kullanılan Yöntemler
- L. infantum'un intravenöz ve intraperitoneal enjeksiyonu.
- Hayvan modeli olarak altın hamsterlerin kullanılması.
- Enfeksiyon ilerlemesini takip etmek için biyolüminesan görüntüleme.
Ana Sonuçlar
- Başlangıçta amastigot enfeksiyonlu hayvanlarda daha yüksek biyolüminesans gözlendi.
- Enfeksiyon azalması, özellikle amastigot enfeksiyonlu hamsterlerde önemliydi.
- Enfeksiyondan altı ay sonra, PCR karaciğerde parazitler tespit etti.
Sonuçlar
- Çalışma, hamsterlarda L. infantum için yeni bir enfeksiyon yolu başarıyla kurmuştur.
- Bu yöntem, Leishmania enfeksiyonları için preklinik testlerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Standardizing gingival vein inoculation of axenic amastigotes expressing luciferase in hamsters addresses a key bottleneck in preclinical infectious disease modeling. This minimally invasive method enables real-time, quantitative infection tracking, supporting predictive confidence in early-stage anti-leishmanial drug discovery. The approach enhances model reproducibility and translational relevance for portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust hypothesis testing of infection dynamics and host-pathogen interactions.
- Supports biological de-risking by providing a reproducible and minimally invasive infection model.
- Facilitates functional target validation through quantitative bioluminescent readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated animal models for downstream compound screening workflows.
- Delivers standardized, quantitative bioluminescence outputs for assay reproducibility.
- Enables reliable evaluation of anti-leishmanial candidates in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant infection progression and tissue tropism observed in humans.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation using PCR and imaging endpoints.
- Supports risk-adjusted decisions by revealing infection persistence and model sensitivity.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical validation, enabling seamless transition between mechanistic studies and efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via real-time infection monitoring.
- Screening: Offers reproducible, quantitative bioluminescence for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides radiance-based measurements and PCR confirmation for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains disease relevance and supports biomarker alignment through longitudinal follow-up.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized infection model for multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection models.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of preclinical workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-leishmanial candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal handling and intravenous injection techniques.
- Needs access to bioluminescent imaging systems and PCR analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of inoculum preparation and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for other pathogens or animal models.
- Imaging sensitivity may limit detection at low parasite burdens, requiring PCR confirmation.
