Name: Sağlam Drosophila Larvalarında Lazer Hücre Ablasyonu Sinaptik Rekabeti Ortaya Çıkardı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Keşfedin Drosophila larvalarında lazer hücre ablasyonu ile sinaptik rekabeti ve sinir devresi oluşumunu. Bu yöntem, nöronlar arasındaki rekabet mekanizmalarını in vivo ortaya çıkararak nörobilim araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

2 foton mikroskobu üzerinde deneyler FAU Stiles-Nicholson Beyin Enstitüsü İleri Hücre Görüntüleme Çekirdeği'nde gerçekleştirildi. Jüpiter Yaşam Bilimleri Girişimi'ne finansal destek için teşekkür ederiz.

Protokol için kullanılan tüm hayvanlar Drosophila melanogaster türündendi. Bu türün kullanımını çevreleyen herhangi bir etik sorun yoktur. Bu işi yürütmek için etik izin gerekli değildi. Çalışmada kullanılan Drosophila türlerinin, reaktiflerinin ve ekipmanlarının detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Drosophila'nın yetiştirilmesi ve doğru larva aşamasının seçilmesi
<ol><li>Kesilecek hücrelerde ifadeyi yönlendiren bir Gal4 sürücü hattı seçin ve bunu bir UAS-GFP raportör hattıyla yeniden birleştirin veya çaprazlayın. 25 ° C'de standart sinek yemi üzerindeki sinekleri yükseltin. NOT: Dev fiber (GF) ablasyonu için R91H05-Gal4 veya A307-Gal4, UAS-GFP ile yeniden birleştirildi. TTMn ablasyonları için UAS-GFP ile yeniden birleştirilen ShakB(ölümcül)-GAL4 kullanıldı (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Yiyeceklerden çıkmaya başlayan ve yiyecek şişesinin yan tarafına doğru sürünen larvaları seçin. Bu larvalar, GF hücre ablasyonunu gerçekleştirmek için tercih edilen aşama olan gezinme aşamasındadır. NOT: Ablasyon herhangi bir larva aşamasında yapılabilir. Son larva aşaması, GFS'nin gelişiminin manipülasyonu için önemliydi, çünkü GF hücre gövdeleri beyinde kolayca tanımlanabilir, ancak GF aksonları bu aşamada hedefleriyle bağlantı kurmamıştır.</li>
</ol>2. 3. instar larvasının hazırlanması
NOT: Larvalar Burra ve ark.9'a benzer bir yöntem kullanılarak uyuşturulmuştur. İşlem sürelerini kısa tutmak için, bir seferde sadece bir larva hazırlayın. Anesteziye kısa süre maruz kalma, deney hayvanlarının hayatta kalmasını artıracaktır10.
<ol><li>Sıkıca oturan bir kapağı olan bir cam tabak hazırlayın. Tabağa bir pamuk top yerleştirin ve bir davlumbazın altına yaklaşık 3-5 ml etil eter (tehlikeli, yanıcı sıvı, laboratuvar önlüğü, eldiven, gözlük) ekleyin. Çanağı kapakla örtün.</li>
	<li>Sinek şişelerinden bireysel 3. instar larvalarını toplayın. 3. larva aşamasında, larvalar besin ortamını terk eder ve besin şişesinin11 kenarı boyunca sürünür.<ol><li>Larvaların hala hareket ettiğinden ve puparium oluşumuna başlamadığından emin olun. Durağan olan ve vücutta kısalma gösteren larvalar pupaya başlar ve ablasyon için uygun değildir. Larvaları küçük bir boya fırçası ile toplayın. NOT: 3. larva dönemi, gelişimin 72. saatinde (yumurtlamadan sonra) ikinci tüy dökümünden sonra başlar ve 25 °C'de yetiştirilen sinekler için 120 saatte puparium oluşumuna kadar sürer.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir larvayı küçük, açık bir kaba aktarın. Kabı etil eterli cam tabağa yerleştirin ve tabağı sıkıca kapatın. Cam tabağı açarken, dumanların dışarı çıkmasını önlemek için bir şnorkelin altına veya çeker ocak içine yerleştirin.<ol><li>30 sn aralıklarla, larva ile kapağı tabaktan çıkarın ve larvaların hareket kabiliyetini diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin. Larva genellikle 1 dakika içinde hareketsiz hale gelir. Ağız kancaları seğirmeyi bıraktığında larva montaja hazırdır. 3 dakika sonra tamamen hareketsiz hale getirilmemiş larvaları atın. NOT: Bir mikrosantrifüj tüpünün baş aşağı kapağının üst kısmı (tüpten çıkarılan kapak) bir kap olarak kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ablasyon için larvaların slaytlara monte edilmesi
<ol><li>Anestezi uygulanmış larvaları bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Larvaları bir damla böcek tuzlu suya batırın; Bu, larvaya yapışabilecek yiyecek artıklarının bir kısmını temizleyecektir.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında, salinin çoğunu bir kağıt mendille çıkarın. GF ablasyonu için larva dorsal tarafını yukarı veya TTMn ablasyonu için ventral tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın. Larvaların üzerine yavaşça bir cam lamel indirin. Cam slayt ile lamel arasındaki boşluğu doldurmak için lamel ile lamel arasındaki boşluğu doldurmak için lamel tarafına tuzlu su ekleyin.</li>
	<li>GF ablasyonu için, diseksiyon mikroskobunda yüksek büyütme altında beynin konumunu kontrol edin. Beynin düz bir şekilde yattığından ve kütikülden görülebildiğinden emin olun. Çoğu zaman, beyin yağ dokusu ile kaplanır, bu da görselleştirmeyi ve hücre ablasyonunu imkansız hale getirir.<ol><li>Beyni kaplayan herhangi bir yağ dokusunu yerinden çıkarmak için, lamel üzerine forseps ile hafif bir baskı uygulayın ve lamel bir yandan diğer yana hareket ettirin. Yağ dokusu bu şekilde beyinden uzaklaştırılamıyorsa, bunun yerine farklı bir larva kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hedef hücrelerin bulunması
NOT: Bu çalışma için kullanılan çoklu foton sistemi dik bir mikroskop üzerine monte edilmiştir. Edinim ve lazer stimülasyon ayarlarını kontrol etmek için sisteme özel yazılım kullanıldı. Sistem, numuneleri bulmak için bir epifloresan ışık kaynağı ile donatıldı. Objektif lens, 25x büyütme, 2 mm uzun çalışma mesafesi ve 1.10 NA ile suya daldırma lensiydi.
<ol><li>Numuneyi çoklu foton mikroskobunun tablasına yerleştirin ve numuneyi epifloresan modunda bulmak için GFP filtresini kullanın. GF ablasyonu için, Şekil 1A, C, D'de görüldüğü gibi hücre gövdeleri beyinde tanımlanabilir. TTMn ablasyonu için, Şekil 1A,B'de gösterildiği gibi, ventral sinir kordonunda (VNC) ventral taraftan dört hücreden oluşan bir küme tanımlanabilir. Odaklama bittiğinde, hücreleri görüş alanında ortalayın ve 2 foton moduna geçin.</li>
</ol>5. Ablasyon parametrelerinin ayarlanması
<ol><li>Galvano tarayıcı ile GFP ifade eden hücreleri görüntülemek için lazer ayarlarını ve dedektör kazancını ayarlayın. 870 nm'lik bir dalga boyu, GFP sinyalini görselleştirmek için en iyi sonucu verir. Hücreyi görüş alanında ortalayın.</li>
	<li>Ablasyon alanını tanımlamak için dairesel bir ilgi alanı (ROI) kullanın. ROI'nin hücre yüzeyinin çoğunu kapladığından emin olun (Şekil 1E,G).</li>
	<li>Yazılımda ablasyon protokolünü ayarlayın. Bir edinme çerçevesi, ardından stimülasyon ve ardından başka bir edinme çerçevesi ayarlayın.</li>
	<li>Stimülasyon lazer gücü ayarını daha düşük bir değerde (- ) başlatın ve stimülasyon protokolünü çalıştırın. Başarılı bir ablasyon, ROI'nin bulunduğu yerde hücre soma'sının merkezinde net bir daire ve ROI'yi çevreleyen floresanda bir artış ile tanınabilir (Şekil 1F).<ol><li>Ablasyon başarılı olmadıysa ve sadece hücreyi ağarttıysa (Şekil 1H), lazer gücünü% 5'lik artışlarla veya ilmek sayısını birer birer artırın ve protokolü tekrar çalıştırın. Protokolde kullanılan sistem için uygulanan lazer gücü ile @ arasında bulunmuştur. NOT: Ablasyon için lazer güç ayarları, hücrelerin dokuda ne kadar derin bulunduğuna ve kütikül katlanması gibi diğer faktörlere büyük ölçüde bağlıdır. Hücreler parlak ve net bir şekilde görülebiliyorsa, lazer gücü aralığın alt ucunda olacaktır. Lazer gücü, lazer modeline ve lazerin yaşına bağlı olarak her sistem için farklı olacaktır.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig01.jpg"> Şekil 1: Sağlam Drosophila L3 larvalarında lazer ablasyonu için nöronların tanımlanması. (A) Beyindeki dev lif (GF) soma'nın ve ventral sinir kordonundaki (VNC) tergotrokanteral motornöronu (TTMn) içeren motor nöron kümesinin konumunun şeması. (B) Larva VNC'de GFP'nin shakB (ölümcül) -Gal4 sürüş ekspresyonunun maksimum yoğunluk projeksiyonu. Orta çizgi noktalı çizgi ile gösterilir. Daire, lazer ablasyonu için hedeflenen TTMn'yi içeren nöron kümesini gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. (C) A307-Gal4'ün kontrolü altında GFP'yi ifade eden larva beyninin kısmi projeksiyon görünümü. Daire, lazer ablasyon için hedeflenen GF soma'yı gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. (D) R91H05-Gal4 sürüş UAS-GFP ile beynin maksimum yoğunluk projeksiyonu. Her iki GF (daire) konum, şekil ve boyuta göre tanımlanabilir. Ölçek çubuğu: 50 μm. (E) GF soma lazer ablasyondan önce büyütülmüş görünüm. Eflatun daire, lazer ablasyon için hedef bölgeyi gösterir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (F) GF soma, lokalize lazer gücü ve başarılı ablasyon sonrası büyütülmüş görünüm. Ölçek çubuğu: 10 μm. (G) GF soma lazer ablasyondan önce büyütülmüş görünüm. Eflatun daire, lazer ablasyon için hedef bölgeyi gösterir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (H) GF soma, lokalize lazer gücü ve başarısız ablasyon (ağartma) sonrası büyütülmüş görünüm. Ölçek çubuğu: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
6. Larvaların geri kazanılması
<ol><li>Hücreyi başarılı bir şekilde kestikten sonra, lameli çıkarın ve larvaları bir boya fırçası ile slayttan yavaşça alın. Larvaları bir yiyecek şişesine yerleştirin. Larvalar 30 dakika içinde tekrar sürünmeye başlayacaktır. NOT: İşlem süresini kısa tutmak, hayvanların hayatta kalma oranlarını artırır. Tecrübe ile, deney 10 dakikadan kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Pupa kılıfından kapanana kadar larvaları standart koşullarda yetiştirmeye devam edin.</li>
</ol>7. Yetişkin sineklerde GFS'nin işlevselliğinin test edilmesi
NOT: Aşağıdaki adımlar Allan ve Godenschwege12 ve Augustin ve ark.13'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
<ol><li>Test yetişkin uçarları eklosiyondan 2-5 gün sonra. CO2 ile sinekleri uyuşturun ve bacakları mumun içine iterek diş mumunun üzerine monte edin. Kanatları 90° açıyla açın ve balmumu ile yerlerine sabitleyin. Hortumu balmumunun içine iterek kafayı sabitleyin.</li>
	<li>Her iki göze stimülasyon kabloları, karın içine bir topraklama kablosu ve her iki taraftaki atlama kaslarına (TTM'ler) cam kayıt elektrotları yerleştirin.</li>
	<li>Her iki kas için yanıt gecikmesini ölçmek için GF devresini tek uyaranlarla uyarın. Her iki kas için aşağıdaki frekansı ölçmek için devreyi sırasıyla 100 Hz ve 200 Hz uyaran dizileri ile uyarın.</li>
</ol>8. Konfokal görüntüleme için dev fiber sisteminin diseksiyonu ve etiketlenmesi
NOT: Fly CNS diseksiyonu ve boya enjeksiyonu Boerner ve Godenschwege14'te detaylandırılmıştır.
<ol><li>Sineği diş mumundan forseps ile nazikçe çıkarın ve bir diseksiyon kapsamı altında silikon elastomer kaplı bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Bacakları, kanatları ve hortumu makasla çıkarın ve sinek sırt tarafını elastomer kaplamaya sabitlemek için böcek pimleri kullanın.</li>
	<li>Orta karın bölgesinden orta hat boyunca, tüm göğüs kafesi boyunca ve boynu yukarı doğru göğsü başa bağlayarak yanal bir kesi yapın. Sineği böcek pimleri ile açın. Sinir sistemine zarar vermeden organları ve bezleri sinekten çıkarın. NOT: Bu noktada, GF'leri ve elektriksel olarak bağlanmış nöronları13 etiketlemek için GF aksonlarına boyalar enjekte edilebilir.</li>
	<li>Beyni açığa çıkarmak için kafa kapsülünü kafadan çıkarın.</li>
</ol>9. Sinir sisteminin immünohistokimyası
<ol><li>CNS diseksiyonundan sonra, sineği oda sıcaklığında (RT) 45 dakika boyunca PBS'de% 4 PFA'da sabitleyin. PBS'de RT'de (3 kez) 20 dakika yıkayın.</li>
	<li>Numuneyi% 0.5 deterjan çözeltisi ile PBS'de% 3 BSA'da RT'de 1 saat bloke edin.</li>
	<li>PBS'de% 0.3 deterjan çözeltisi ve tavşan anti-GFP (1:500) ile% 3 BSA'da 4 ° C'de 2-3 gece inkübe edin. PBS'de RT'de (6 kez) 20 dakika yıkayın.</li>
	<li>Anti-tavşan Alexa 488 ile PBS'de gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. PBS'de RT'de (6 kez) 20 dakika yıkayın.</li>
	<li><li></ol>

Drosophila'da Sinir Sistemi Adaptasyonunu İncelemek İçin Tek Nöron Ablasyonu

<ol><li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A+Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Bower, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+branching+has+conserved+needs+for+local+parasympathetic+innervation+but+not+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission.</a> BMC Biol. 12, 92(2014).</li>
<li>Angelo, J. R., Tremblay, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+cell+ablation+during+post-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development.</a> Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+Development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).</li>
<li>Hubel, D. H., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binocular+interaction+in+striate+cortex+of+kittens+reared+with+artificial+squint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).</li>
<li>Wiesel, T. N., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+unilateral+and+bilateral+eye+closure+on+cortical+unit+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+giant+fiber+neuron+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae.</a> Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+%28GFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).</li>
<li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+d.+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster.</a> J Vis Exp. (47), e2412(2011).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+preparation+of+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord+for+giant+fiber+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection.</a> J Vis Exp. (52), e3080(2011).</li>
<li>Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutation+in+shaking-b+eliminates+electrical%2C+but+not+chemical%2C+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%3A+A+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study.</a> J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).</li>
<li>Kennedy, T., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+electrically+coupled+neurons+support+development+of+the+Drosophila+giant+fiber+model+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit.</a> eNeuro. 5 (6), 0346(2018).</li>
<li>Mcfarland, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+arrival+times+and+physical+occupancy+establish+visual+projection+neuron+integration+on+developing+dendrites+in+the+Drosophila+optic+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

2 fotonlu bir mikroskop ile hücre ablasyonunun, Drosophila'da nöronal devre gelişimini manipüle etmek için oldukça başarılı bir yöntem olduğu kanıtlandı. Bu yöntem non-invaziv olduğu için hayvana minimum zarar verir. Veriler, bilinen devrelerin bu hücreye özgü manipülasyonunun kullanışlılığını desteklemektedir.
Ablasyonun başarısı için en uygun Gal4 sürücüsünü seçmek çok önemliydi. GFS iyi çalışıldığından, birçok özel Gal4 sürücü hattı tanımlanmıştır7. Çoğu Gal...

Lazer ablasyon, çok çeşitli organizmalarda nöral devreleri diseksiyon etmek için tercih edilen bir araçtır. Solucanlar ve sinekler gibi model genetik sistemlerde geliştirilen, sinir sisteminin yapısını, işlevini ve gelişimini incelemek için hayvanlar aleminde uygulanmıştır 1,2,3. Burada, Drosophila'da devre montajı sırasında nöronların nasıl etkileşime girdiğini araştırmak için tek nöron ablasyonu kullanıldı. Sineğin kaçış sistemi, analiz için favori bir devredir, çünkü yetişkin sineğin en büyük nöronlarını ve en büyük sinapslarını içerir ve devre son yıllarda iyi karakterize edilmiştir4. Dev Fiber devresinin montajında nöron-nöron etkileşimlerinin oynadığı rol, bu araştırmanın odak noktasıdır.
Hubel ve Wiesel'in 1960'lardaki çalışmalarından bu yana sinirbilimde odak noktası olan bir etkileşim türü "sinaptik rekabet"tir5,6. Bu protokolde, fenomenin moleküler temellerinin keşfedilebileceği Drosophila'nın dev lif sisteminde (GFS) tek hücreli ablasyon yoluyla rekabetin rolünü yeniden gözden geçirmek için lazer ablasyon kullanıldı.
Gelişmekte olan sinekteki nöronların ablasyonu, hedef nöronların görselleştirilmesi, ablasyon yönteminin kesinliği ve numunenin hayatta kalması dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle zor olmuştur. GFS'deki bu problemlerin üstesinden gelmek için, ilgilenilen nöronları etiketlemek için UAS / Gal4 sistemi7 kullanıldı ve presinaptik dev lifi veya postsinaptik sıçrama motor nöronunu (TTMn) çıkarmak için iki fotonlu bir mikroskop kullanıldı.
Bu çalışmada, komşu bilateral nöronların GFS'deki sinaptik bağlantıyı ve sinaptik gücü ayarlamada oynadığı rolü belirlemek için, bilateral nöron çiftlerinden biri (presinaptik GF veya postsinaptik motor nöron) pupa gelişiminden hemen önce silindi. Bu gelişim aşamasında, GF aksonogenezi tamamlanmamıştır8. Yetişkindeki sinaptik devrenin GF yapısı ve işlevi daha sonra incelendi ve kalan GF'nin çıktısına özellikle dikkat edildi.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jaxkson ImmunoResearch</td><td>111-545-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti-yeşil floresan protein, tavşan</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>1:500 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Apo LWD 25x/1.10W Objektif</td><td>Nikon</td><td>MRD77220</td><td>suya daldırma uzun çalışma mesafesi</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bukalemun Ti: Safir Vision II Lazer</td><td>Tutarlı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pamuk</td><td>Topu Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td></td></tr><tr><td>Dekstra, Tetrametilrodamin, 10.000 MW, Lizin Sabitlenebilir (floro-Yakut)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>D1817</td><td></td></tr><tr><td>Gu ve O'Dowd'dan</td><td>Drosophila salin</td><td></td><td></td> tarifi, 2006</tr><tr><td>Etil Eter</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-1</td><td>Tehlike, Yanıcı sıvı</td></tr><tr><td>Sinek yemeği B (Bloomington tarifi)</td><td>LabExpress</td><td>7001-NV</td><td></td></tr><tr><td>Metil salisilat</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3695-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kapak kayması 18x18 #1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>Nörobiotin İzleyici</td><td>Vektör Laboratuvarlar</td><td>SP-1120</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R çoklu foton mikroskobu</td> Nikon <td>dik bir FN1 mikrosopa standı üzerinde</td><td>NIS</td><td></td></tr><tr><td>Elemanları İleri Araştırma</td><td>Nikon</td><td></td><td>Edinimi ve veri analizi yazılımı</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Fosfat Tamponlu Salin)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2944-100</td><td>Tabletler</td></tr><tr><td>R91H05-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>40594</td><td></td></tr><tr><td>shakB(ölümcül)-GAl4</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>51633</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost mikroskobu cam slayt</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>422355000</td><td>deterjan çözeltisi</td></tr><tr><td>UAS-10xGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>32185</td><td></td></tr></tbody></table>

sağlam drosophila larvalarında lazer hücre ablasyonu sinaptik rekabeti ortaya Çıkardı

Laser Cell Ablation in Intact Drosophila Larvae Reveals Synaptic Competition

Protokol, sağlam Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde (CNS) 2-foton lazer sistemi ile tek nöron ablasyonunu tanımlar. Bu non-invaziv yöntem kullanılarak, gelişmekte olan sinir sistemi hücreye özgü bir şekilde manipüle edilebilir. Bir ağdaki bireysel nöronların gelişimini bozmak, sinir sisteminin sinaptik girdi kaybını nasıl telafi edebileceğini incelemek için kullanılabilir. Bireysel nöronlar, Drosophila'nın dev lif sisteminde, iki nörona odaklanarak spesifik olarak kesildi: presinaptik dev lif (GF) ve postsinaptik tergotrokanteral motor nöron (TTMn). GF, kaçış tepkisi için çok önemli olan ipsilateral TTMn ile sinaps yapar. 3. instar beyindeki GF'lerden birinin, GF aksonal büyümeye başladıktan hemen sonra kesilmesi, CNS'nin gelişimi sırasında hücreyi kalıcı olarak uzaklaştırır. Kalan GF, eksik komşuya reaksiyona girer ve kontralateral TTMn'ye ektopik bir sinaptik terminal oluşturur. Bu atipik, iki taraflı simetrik terminal, boya eşleşmesi ile gösterildiği gibi her iki TTMN'yi de innerve eder ve elektrofizyolojik deneylerle gösterildiği gibi her iki motor nöronu da çalıştırır. Özetle, tek bir internöronun ablasyonu, bir nöronun kaybını telafi edebilen ve kaçış devresine normal tepkileri geri yükleyebilen iki taraflı bir nöron çifti arasındaki sinaptik rekabeti gösterir.

Bu yöntem, Drosophila'nın sinir sistemindeki belirli nöronal ağların gelişimini manipüle etmek için kullanılabilir. Buradaki birincil araştırma sorusu sinaptik bağlantıların oluşumuydu. Presinaptik GF veya postsinaptik TTMn'nin çıkarılması, bu merkezi sinapsta reaktif sinaptogenezin ve sinaptik fonksiyon ve gelişim için çok önemli olan moleküler mekanizmaların araştırılmasını sağladı. Protokolde tarif edildiği gibi, GF'lerden birinin veya TTMN'lerden birinin lazer hücre ablasyonu gerçekleştirildi ve yetişkin sin...

Bu protokol, sağlam Drosophila larvalarında bireysel nöronların lazer hücresi ablasyonunu gösterir. Yöntem, gelişmekte olan sinir sistemindeki nöronlar arasındaki rekabeti azaltmanın etkisinin incelenmesini sağlar.

Sağlam Drosophila Larvalarında Lazer Hücre Ablasyonu Sinaptik Rekabeti Ortaya Çıkardı

The protocol describes single-neuron ablation with a 2-photon laser system in the central nervous system (CNS) of intact Drosophila melanogaster larvae. ...

laser-cell-ablation-intact-drosophila-larvae-reveals-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video makalede izole etmek için bir yöntem mevcut tek veya birden...

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

Bu protokol, bozulmamış anesthetization ve görüntüleme için güvenilir bir yöntem...

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Bu videoda, bir Drosophila melanogaster larvasındaki aksonların iki fotonlu lazer ablasyonu ve yaralanmayı indüklemek ve yaralanma bölgesini görüntülemek için örnek bir protokol açıklanmaktadır.

İki Foton Lazer Kaynaklı Nöral Yaralanma: Drosophila Larvalarında Akson Dejenerasyonu ve Rejenerasyonunu Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Bu video, yüksek güçlü bir lazer kullanarak Drosophila larvalarında hedeflenen nöronal hasarı indüklemek için bir yöntemi göstermektedir. Larvaları mikroskop altında konumlandırdıktan sonra, düşük güçlü bir lazer floresan nöronları tarar ve daha sonra lokalize hasarı indüklemek için lazer gücü artırılır. Yaralanma, artan floresan ve yaralanma bölgesinde bir krater ile doğrulanır.

Bir Drosophila larvasında yüksek güçlü bir lazer kullanarak hedeflenen nöronal hasarın indüklenmesi

Yarı sağlam motor çıkış değişiklikleri (kas kasılması) izlerken Burada motoneuronal faaliyet optogenetic manipülasyon için bir protokol...

Yarı sağlam Lazer Aydınlatma ile Sinir Faaliyet optogenetic Pertürbasyon<em&gt; Drosophila</emMotion&gt; Larva

Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için 'larva çip' olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Burada, zebra balığı larvaları üzerinden bir iki fotonlu lazer nöronların genetik olarak etiketlenmiş bir subpopulation ablate için bir protokol mevcut.

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, drosophila larvalarının sağlam canlı hayvanlarda 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme elde etmek için bir yöntem inşama yöntemini açıklamaktadır. Bu yöntem larva gövde duvarına yakın birçok biyolojik süreci görüntülemek için kullanılabilir.

LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde tanımlanmış nöronal partnerler arasındaki fonksiyonel sinaptik aktiviteyi in vivo olarak değerlendirir; genetik olarak kodlanmış araçlar kullanılır. Presinaptik cIVda duyusal nöronların CsChrimson aracılı optogenetik uyarısı, postsinaptik Basin-4 internörlerinde CaMPARI'nin kalsiyuma bağlı fotodönüşümünü indükler.

CaMPARI kullanılarak Drosophila larva merkezi sinir sisteminde bireysel pre- ve postsinaptik partnerlerin fonksiyonel karakterizasyonu

Keşfedin Drosophila larvalarında lazer hücre ablasyonu ile sinaptik rekabeti ve sinir devresi oluşumunu. Bu yöntem, nöronlar arasındaki rekabet mekanizmalarını in vivo ortaya çıkararak nörobilim araştırmalarına katkı sağlar.

Sağlam Drosophila Larvalarında Lazer Hücre Ablasyonu Sinaptik Rekabeti Ortaya Çıkardı

Daha fazla video keşfet