Name: Uyarlanabilir Bir Moleküler Klonlama Ders Tabanlı Lisans Araştırma Deneyimi ile Öğrenci Sonuçlarının İyileştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Öğrenin: Gibson Assembly ile moleküler klonlama tekniklerini CURE formatında uygulayarak öğrencilerin anlayış ve güvenini artırın. Bu yöntem biyoteknoloji eğitiminde pratik becerileri geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Moleküler Biyoloji Eğitimi ve Becerilerini Geliştirmek için Gibson Assembly'nin Uygulanması

<ol><li>Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+yeast+actin+cDNA+leads+to+an+investigative+approach+for+the+molecular+biology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bell, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUREs+in+biochemistry%E2%80%94where+we+are+and+where+we+should+go%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUREs in biochemistry—where we are and where we should go.</a> Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Buchanan, A. J., Fisher, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+implementation+of+science+practices+in+Course-based+Undergraduate+Research+Experiences+%28CUREs%29%3A+A+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review.</a> CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).</li>
<li>Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+core+molecular+biology+principles+using+GST-GFP+in+a+semester-long+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUR%28E%29ating+a+new+approach+to+study+fungal+effectors+and+enhance+undergraduate+education+through+authentic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research.</a> Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).</li>
<li>Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+and+purifying+proteins+to+teach+molecular+biology+and+advanced+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glyphosate+oxidase+and+a+chemiluminescence+system+for+glyphosate+detection%3A+A+comprehensive+practical+laboratory+experiment+on+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology.</a> Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).</li>
<li>Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immersing+undergraduate+students+in+the+research+experience%3A+A+practical+laboratory+module+on+molecular+cloning+of+microbial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes.</a> Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Dean, D. M., Wilder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%80%9CFrankenplasmid%E2%80%9D+lab%3A+An+investigative+exercise+for+teaching+recombinant+DNA+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+by+PCR+and+subcloning+into+a+GFP-fusion+plasmid+expression+vector+as+a+molecular+biology+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).</li>
<li>Roberts, L. A., Shell, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+program-linked%2C+course-based+undergraduate+research+experience+that+allows+undergraduates+to+participate+in+current+research+on+mycobacterial+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation.</a> Front Microbiol. 13, 1025250(2023).</li>
<li>Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinobacteria+in+natural+products+research%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects.</a> Microbiol Res. 246, 126708(2021).</li>
<li>Banskota, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLN-05220%2C+TLN-05223%2C+new+Echinosporamicin-type+antibiotics%2C+and+proposed+revision+of+the+structure+of+bravomicins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins.</a> J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).</li>
<li>Schorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+the+biosynthesis+of+the+pharmaceutically+important+class+of+epoxyketone+proteasome+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+domain-mediated+subunit+interactions+in+natural+product+megasynth%28et%29ases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).</li>
<li>Williams, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+code+kit%3A+An+open-source+cell-free+platform+for+biochemical+and+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).</li>
<li>Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outperforming+yet+undervalued%3A+Undergraduate+women+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM.</a> PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).</li>
<li>Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gendered+performance+gaps+in+an+upper-division+biology+course%3A+Academic%2C+demographic%2C+environmental%2C+and+affective+factors%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors.</a> CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+Architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">BLAST+: Architecture and applications.</a> BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly">https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly</a> (2024).</li>
<li>Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e">https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e</a> (2021).</li>
</ol>

Lisans öğrencilerini temel moleküler biyoloji kavramları ve laboratuvar teknikleri konusunda eğitmek, bilimsel ve mesleki gelişimleri için çok önemlidir, çünkü bu metodolojiler akademi ve endüstri dahil olmak üzere çeşitli araştırma ortamlarında yaygındır. Bu nedenle, California Polytechnic State University, San Luis Obispo'daki (Cal Poly) biyoloji (moleküler ve hücresel biyoloji konsantrasyonu) ve biyokimya ana dallarındaki öğrencilerin, bu konuları öğrenmek ve uygulamak için bir üst bölüm moleküler biyoloji laboratuvarı dersi almaları gerekmektedir (CHEM/BIO 475). Bu ders için daha önce öğrencilerin bir maya tamamlayıcı DNA (cDNA) şablonu1'den hazırlanan aktin içeren bir plazmiti bir araya getirmek için topoizomeraz bazlı (TOPO) klonlama gerçekleştirdiği bir temel müfredat geliştirilmiştir. Öğrenciler, özgün araştırma hipotezlerini taklit eden sorulara dayalı deneyler tasarlayarak laboratuvar uygulamalarına ve sorgulamaya dayalı öğrenmeye aşinalıklarını artırırlar. Moleküler biyoloji alanındaki sürekli ilerleme, ilgili müfredatın, modern yeterliliklere sahip öğrencileri işgücüne hazırlamak için uyarlanmasını gerektirir. Özellikle, Gibson Assembly'nin kullanımı bilim camiasında daha baskın hale geldi; Yöntem başlangıçta yapay kromozomları2 sentezlemek için kurulmuş olsa da, bu raporun yazıldığı sırada 5.000'den fazla yayın Gibson ve arkadaşlarının orijinal çalışmasına atıfta bulunmuştur. Gibson Assembly, geleneksel klonlama metodolojilerine kıyasla benzersizdir: son derece özelleştirilebilir ve bağlantıları üretmek için kısıtlama bölgelerine ihtiyaç duymadan birden fazla doğrusal DNA parçasını kolayca bağlayabilir. Böylece, CHEM / BIO 475 müfredatını modern moleküler klonlama tekniklerini içerecek ve sorgulamaya dayalı ders modelini geliştirecek şekilde yenileme fırsatı gördük.
Öğrenci araştırma deneyimlerinin artan kavramsal anlayışa, beceri geliştirmeye ve fen bilimlerinde kalıcılığa katkıda bulunduğu tespit edilmiştir3, ancak tüm lisans öğrencilerinin doğrudan bir araştırma laboratuvarına katılma fırsatı yoktur. Araştırma laboratuvarlarında sınırlı öğrenci kapasitesinin zorluğunu ele almak için, sınıfta özgün araştırmalar yoluyla bilime erişilebilirliği artırmak için ders temelli lisans araştırma deneyimleri (CURE'ler) geliştirilmiş ve kullanılmıştır. CURE'ler uygulamalarında farklılık gösterse de, bilimsel araştırmanın beş ilkesini ele alan ortak uygulamalar oluşturulmuştur. İyi tasarlanmış bir CURE'de, öğrenciler 1) bilimsel uygulamaları kullanacak, 2) bir araştırma projesinde işbirliği yapacak, 3) yeni keşifler yapmaya çalışacak, 4) sınıf dışında ilgili çalışmalara katkıda bulunacak ve 5) deneysel başarısızlık durumunda hipotezleri ve yöntemleri yeniden değerlendirecek ve gözden geçirecektir4. Bir laboratuvardaki geleneksel öğrenci araştırma deneyimlerine benzer şekilde, CURE'lerin öğrencilerin bilime, bilimsel becerilere, proje sahipliğine ve bilim, teknoloji, mühendislik ve matematikte (STEM) kalıcılığa olan güvenini güçlendirdiği gösterilmiştir5. Moleküler klonlamayı içeren CURE'ler daha önce 6,7,8,9,10,11,12,13 bildirilmiş olsa da, Gibson Assembly'nin otantik araştırma plazmitlerinden oluşan bir kütüphane oluşturmak için uyarlanabilirliğini vurgulayan herhangi bir şeyin farkında değiliz.
Burada, California Polytechnic State University, San Luis Obispo'daki mevcut sorgulamaya dayalı CHEM / BIO 475 müfredatının iki büyük iyileştirme ile genişletildiğini bildiriyoruz: Gibson Assembly'yi kullanarak uygulamalı deneyim ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF-1708919 ve NSF-2300890) tarafından finanse edilen araştırma projeleri için orijinal plazmit yapıları sağlayan bir CURE'ye öğrenci katılımı. Bu müfredatın üç uygulamasından fazla öğrenci, Actinomycetota tarafından üretilen biyoaktif moleküllerin doğal ürün biyosentezine odaklanan iki farklı araştırma projesine katkıda bulunmuşlardır. Doğal ürünler genellikle antibiyotik, antifungal ve/veya antikanser aktivitelere sahip farmakoforlar içerir ve bu küçük moleküllere ilaç keşif çabalarında önem ve klinik alaka potansiyeli verir14. Bu araştırma, bakteriyel biyosentetik enzimlerin hem işlevinin hem de mühendislik potansiyelinin araştırılmasını sağlamak için plazmit kütüphanelerinin oluşturulmasını gerektirir. Bu CURE'de öğrenciler, bu araştırma projeleriyle ilgili benzersiz plazmit kütüphanelerini klonlamak için Gibson Assembly deneyleri tasarladılar ve gerçekleştirdiler (Şekil 1). Ek olarak, modülün formatı ve tasarımı ayırt edicidir, çünkü diğer araştırma projeleri için ilgilenilen herhangi bir plazmidi oluşturmak için kolayca uyarlanabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig01v2.jpg"> 
Şekil 1: Gibson Assembly'nin araştırma laboratuvarımızdaki rolüne genel bakış. Actinomycetota, biyosentetik enzimleri kodlayan gen kümelerini kullanarak klinik olarak anlamlı biyoaktivitelere sahip küçük moleküllü doğal ürünler üretir. Araştırmamızda, biyosentetik bir gen içeren plazmitler, kodlanmış enzimin işlevinin aşağı akış araştırmaları için Gibson Assembly aracılığıyla birleştirilir. Biorender.com'dan bilim ikonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Laboratuvara genel bakış
Moleküler Biyoloji Laboratuvarı, moleküler ve hücresel biyoloji konsantrasyonuna sahip biyokimya ana dalları ve biyoloji ana dalları için gerekli olan bir üst bölüm dersidir. Ön koşulları karşılayan diğer öğrenciler, dersi üst bölüm seçmeli dersi olarak alabilirler. Kurs, Kimya ve Biyokimya Bölümü ile Cal Poly'deki Biyoloji Bölümü arasında birlikte listelenmiştir. Her iki bölümden öğretim üyeleri her dönem sırayla dersi verir (iki çeyrek Biyoloji, dörtte bir Kimya ve Biyokimya).
Sınıf, haftada iki kez 170 dakikalık periyotlarla ve haftada bir kez 50 dakikalık bir ders için laboratuvarda toplanır. Laboratuvar bölümleri en fazla 16 öğrenci içerir ve her üç ayda bir 2-3 laboratuvar bölümü sunulur. Kurs 10 hafta sürer ve final sınavı 10. haftadaki son toplantıda yapılır. Ders süresi, laboratuvarda yürütülen birçok deneysel tekniğin arkasındaki teorinin yanı sıra laboratuvarda ele alınmayan moleküler biyolojideki güncel konuları tartışmak için harcanır. Laboratuvarın çekirdek müfredatı, yaklaşık 7 hafta süren (13-14 laboratuvar toplantısı) maya1'den aktin geninin klonlanması sürecini kapsar. Teknikler arasında mikropipetleme, maya RNA izolasyonu, ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanılarak bir maya geninin amplifiye edilmesi, topo klonlama, mavi-beyaz tarama, plazmit izolasyonu ve restriksiyon sindirimi ve PCR ile ekin doğrulanması, klonların in silico analizi ve DNA dizi analizi yer alır. Kursun son 3 haftasının müfredatı öğretim elemanının takdirine bağlıdır, ancak öğrencilerin tanımlanmamış sonuçları olan "bağımsız bir projeyi" tamamlamalarını içerir.
Deneye genel bakış
Araştırma grubumuzun odak noktalarından biri Actinomycetota'daki biyosentetik yollardır. Bağımsız projeyi tasarlarken, öğrencilerin doğal ürün biyosentezini araştıran araştırma projelerimizde kullanılmak üzere Gibson Assembly aracılığıyla plazmitler oluşturmalarını öngördük. Burada değerlendirilen kurs modülünün yinelemeleri, biyosentetik yolların manipülasyonuna izin veren plazmitlere özgü olsa da, Gibson Assembly iş akışı diğer moleküler klonlama projeleri için büyük ölçüde uyarlanabilir (Şekil 2). İş akışı, iki ders dönemi ve altı laboratuvar dönemi (toplam 3 hafta) boyunca tamamlanan üç farklı deneye (A, B ve C) bölündü ( Bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2). Deneylerden önce, öğrenci hazırlığını desteklemek ve öğrenci anlayışını değerlendirmek için çalışma sayfaları yapıldı (Ek Dosya 3, Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5). İş akışı, eğitmenin ihtiyaçlarına ve ilgi alanlarına göre esnek bir biçimde sunulur.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig02v2.jpg"> 
Şekil 2: Gibson Assembly modülü iş akışı. 1. Gün ve 4. Gün, öğrencilerin in silico dizi analizi ve deney tasarımını tamamladıkları ders dönemleridir. 2-3 ve 5-8. günler, Gibson Assembly aracılığıyla yeni plazmitleri klonlama adımlarının yürütüldüğü, ardından izolasyon ve taramanın yapıldığı laboratuvar toplantılarıdır. Resimli akış şeması, öğrencilerin gerçekleştirdiği üç deneye (A, B ve C) göre gruplandırılmıştır. Daha ayrıntılı yönergeler ve protokoller, sırasıyla Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2 olarak sağlanan Eğitmen ve Öğrenci Kılavuzlarında bulunabilir. Biorender.com'dan bilim ikonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Gibson Assembly bağımsız proje modülü ilk olarak 2019 bahar çeyreğinde CHEM/BIO 475'te pilot olarak uygulandı. 2020 ve 2021'de kurs, SARS-CoV-2 salgını nedeniyle çevrimiçi olarak verildi. 2022 ve 2023 Baharında yüz yüze eğitim yeniden başladığında, kurstaki öğrenciler, orijinal, araştırmayla ilgili plazmitlerin klonlanacağı bağımsız bir Gibson Assembly projesinin öğrenme sonuçlarını değerlendiren bir çalışmaya katılmaya davet edildi. 2019'da öğrenciler, Micromonospora echinospora ATCC 15837 genomundan pKC1132'ye klonlanan gen kasetlerinden oluşan bir plazmit kütüphanesi oluşturdular (Şekil 3). Bu plazmit kütüphanesi, araştırma laboratuvarımızda, doğal ürün TLN-0522015 için varsayılan bir biyosentetik gen kümesinde ilgilenilen genleri etkisiz hale getirmek için kullanılmaktadır. Gen inaktivasyon çalışmalarımızı tamamlamak için, 2022'deki öğrenciler, varsayılan TLN-05220 gen kümesinden küçük bir gen kütüphanesini pUC19'a (Şekil3) klonladılar; Araştırma grubumuz bu plazmitleri, protein aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması için genleri pET28b dahil olmak üzere ekspresyon vektörlerine alt klonlamak için kullanmıştır. 2023 kohortundaki öğrenciler, epoksomisin sentetaz16 ile ilgili bir biyosentetik mühendislik projesi üzerinde devam eden çalışmalara katkıda bulundular. 3-4 kişilik takımlar halinde, öğrenciler ribozomal olmayan peptit sentetaz17 modüllerinin mühendislik alanlarını, araştırma laboratuvarımızda bu enzimlerin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını optimize etmek için çeşitli protein ekspresyon vektörlerine klonladılar (Şekil 3). Yedeklilik, her kohort için klonlama planına dahil edildi. Örneğin, 2019 kohortu 44 öğrenci içeriyordu ve klonlama için sınıfa 15 plazmit atandı. Böylece, her bir plazmitin klonlanması iki veya üç kez denendi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig03v2.jpg"> 
Şekil 3: 2019, 2022 ve 2023 bağımsız proje yinelemeleri sırasında klonlanan plazmitlerin ve öğrenci katılımcıların özeti. Gibson Assembly projesi üç kez konuşlandırıldı. Her sunumda, öğrenci katılımcılar, biyosentetik yolları araştıran araştırma projelerinde kullanılmak üzere farklı bir plazmit kütüphanesi klonladılar. 2019 ve 2022 yıllarındaki projeler, iki parçalı (bir gen, kaset veya gen ve bir vektör) Gibson Assembly reaksiyonları ile doğal ürün TLN-0522015 üzerinde devam eden çalışmalarımızı destekledi. 2023 projesi, epoksomisin biyosentezi 16'da yer alan ribozomal olmayan bir peptit sentetaz (NRPS) enziminin 1. ve 2. modülleri arasında alan takasını içeriyordu. Taranmış parçalar, değiştirilen alanın iki farklı mutantını temsil eder ve düz renkler, değiştirilmeyen alanları temsil eder. Toplamda, sekiz farklı gen fragmanı (modül 1 için dört ve modül 2 için dördü) Gibson Assembly için uyumlu çıkıntılarla üretildi. Her modül için, sekiz mühendislik NRPS plazmidi üretme potansiyeli için, üç gen fragmanının iki farklı kombinasyonu, iki farklı vektörden biriyle (pBAD33 ve pET28, montaj başına toplam dört fragman) birleştirildi. Biorender.com'dan bilim ikonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Değerlendirmeye genel bakış
Gibson Assembly bağımsız projesinin başlamasından en az 1 hafta önce, 2022 ve 2023 kohortlarındaki öğrenciler, Cal Poly18'deki biyokimya laboratuvarı dersinde yapılan bir ankette gerçekleştirilen bir çalışmaya benzer şekilde tasarlanmış bir öğrenme çıktısı araştırmasına katılmaya davet edildi. Öğrenci katılımcılar, bağımsız projenin başlamasından önce laboratuvar toplantısında çoktan seçmeli bir ön anket ve son laboratuvar toplantısı sırasında (yani Gibson Assembly modülünü tamamladıktan sonra) çoktan seçmeli bir anket sonrası doldurdular. Anket öncesi ve sonrası 28 aynı sorudan oluşmuş ve anket sonrası iki ek soru (toplam 30) kullanılmıştır. Öğrencilerin moleküler klonlamada yer alan enzimler ve mekanizmalar hakkındaki bilgilerini değerlendirmek için on içerik sorusu yazılmıştır (örneğin, polimeraz zincir reaksiyonu [PCR], Gibson Assembly, dönüşüm, mavi-beyaz tarama). Aşağıdaki yedi soru, öğrencilerden moleküler klonlama terimlerine (örneğin, DNA polimeraz, eksonükleaz, ligaz) aşinalıklarını kendi kendilerine değerlendirmelerini istedi. Sonraki 10 soru, öğrencilerin moleküler klonlama tekniklerini (örneğin, DNA dizi analizi, kısıtlama sindirim reaksiyonları, agaroz jel elektroforezi) gerçekleştirme yeteneklerini kendi kendilerine değerlendirmelerine izin verdi. Öğrenciler ayrıca, moleküler klonlama teknikleri hakkındaki bilgilerine dayanarak moleküler biyoloji alanında kariyer yapma konusunda rahat olup olmayacaklarını da bildirdiler. Öğrencilerin kursta öğrenmeye olan bağlılıklarını ve kursun değerli bir öğrenme deneyimi olup olmadığını kendi kendilerine değerlendirmeleri için son ankete iki ek soru dahil edildi (Ek Dosya 6 ve Ek Dosya 7). 2022 ve 2023 öğrenci anket öncesi ve sonrası yanıtlarından elde edilen tüm veriler analiz için birleştirildi ve Ek Tablo S1'de mevcut.

<table><tbody><tr><td>Deoksiribonükleotid trifosfat (dNTP'ler, 10&nbsp; mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td>Ev Yapımı' MasterMix bileşeni</td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td>Ev Yapımı' MasterMix bileşeni</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>1000 adet</td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Mikrobiyolojik İnkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0513</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Isotemp Su Banyosu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S28124</td><td></td></tr><tr><td>GelRed Nükleik Asit Jel Lekesi</td><td>Biotium</td><td>NC9594719</td><td>10.000X</td></tr><tr><td>GeneJET Jel Ekstraksiyonu ve DNA Temizleme Mikro Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERK0831</td><td>100 Hazırlık</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA merdiveni</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>FERSM0314 100 uygulama</td></tr><tr><td>LB Et suyu, Miller</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9723-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td>Ev yapımı' MasterMix bileşeni</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus X2 Gradyan Termodöngüleyici</td><td>Eppendorf</td><td>6337000027</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj 16 Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>Micromonospora echinospora bakteri</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>ATCC 15837</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga Fırın</td><td>General Electric&nbsp;</td><td></td><td></td>2440640</tr><tr><td>Moleküler Biyoloji Sınıfı Agaroz</td><td>Fisher BioReaktifler</td><td>BP160-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Nanodrop Bir Mikrohacimli Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Yetkili E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987H</td><td>20 x 0.05 mL</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Montaj Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621S</td><td>10 reaksiyon</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 40 Masaüstü Orbital Çalkalayıcı</td><td>New Brunswick</td><td>M1299-0090</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>Fisher BioReagents</td><td></td><td>BP248450 50 mL</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>Ev Yapımı' MasterMix bileşeni</td></tr><tr><td>Phusion DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Ev Yapımı' MasterMix bileşeni</td></tr><tr><td>Taşınabilir Terazi</td><td>Ohaus</td><td>SKX123</td><td></td></tr><tr><td>pUC19 vektör</td><td>New England Biolabs</td><td>N3041S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Yüksek Sadakat 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td>100 reaksiyon</td></tr><tr><td>T5 Eksonükleaz</td><td>Merkez üssü</td><td>T5E4111K</td><td>Ev Yapımı' MasterMix bileşeni</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td>Ev Yapımı' MasterMix bileşeni</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1137918</td><td>Ev Yapımı' MasterMix bileşeni</td></tr><tr><td>TriTrack DNA Jel Yükleme Boyası (6x)</td><td>Termo Bilimsel</td><td>FERR1161</td><td>5 x 1 mL</td></tr><tr><td>Zyppy Plazmid Miniprep Kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D4019</td><td>100 Hazırlık</td></tr> <tr><td>ve beta;-Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD +)</td> <td>New England Biolabs</td><td>B9007S</td><td>Ev Yapımı 'MasterMix bileşeni</td></tr></tbody></table>

uyarlanabilir bir moleküler klonlama ders tabanlı lisans araştırma deneyimi ile Öğrenci sonuçlarının İyileştirilmesi

Improving Student Outcomes with an Adaptable Molecular Cloning Course-Based Undergraduate Research Experience

Klonlamada öğrenci başarısı <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig4large.jpg" target="_blank"></a> <img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig05v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig5large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="6"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig06v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig6large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067_Table%20S1.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067_Table%20S2.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067_Supp%20Table%20S3%20Anonymized%20Raw%20Data.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/Supplemental_File_1._Instructor_Manual.pdf" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/Supplemental_File_2._Student_Manual.pdf" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/Supplemental_File_3._Experiment_A_Planning_Workshee.pdf" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/Supplemental_File_4._Experiment_B_Planning_Worksheet.pdf" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/Supplemental_File_5._Experiment_C_Planning_Worksheet.pdf" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/Supplemental_File_6._Gibson_Assembly_Pre-Questionnaire.pdf" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/Supplemental_File_7._Gibson_Assembly_Post-Questionnaire.pdf" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067_Supp_File_8_gb_files.zip" target="_blank"></a>

Uyarlanabilir Bir Moleküler Klonlama Ders Tabanlı Lisans Araştırma Deneyimi ile Öğrenci Sonuçlarının İyileştirilmesi

The continuous advancement of molecular biology techniques requires that molecular biology curricula are&#160;regularly refined to effectively prepare ...

improving-student-outcomes-with-an-adaptable-molecular-cloning-course

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Sıvı işleme robotlar üzerinde modüler bir klon DNA derleme yöntemi kullanılarak modüler DNA "aygıt" derleme gerçekleştirmek için otomatik bir iş akışı burada anlatılan. Protokol bir sezgisel yazılım aracı kullanarak iki sıvı taşıma platformları göstermek Kombinatorik DNA aygıt kitaplığı oluşturma için sıvı işleyicisi picklists üretmek için kullanır.

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

Burada, kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniğinin lisans katılımı ve öğrenimine vurgu yaparak ayrıntılı olarak bir adaptasyonunu sunuyoruz.

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Bu makale, Modüler Klonlamanın (MoClo) polisistronik operonların klonlanması için nasıl uyarlanabileceğini gösteren adım adım bir protokol sunmaktadır.

In-Cloning araç setini kullanarak Modüler Klonlama (MoClo) ile Polisistronik Operonların Standartlaştırılmış Modüler Montajı

Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Biz glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için yaklaşımlar ile immünglobulin kat biolayer Interferometry, izotermal titrasyon Kalorimetre ve x-ışını kristalografisi tarafından mevcut.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Burada bir iletişim kuralı için immobilize benchtop metal benzeşme Kromatografi arıtma ve etiketli bir polyhistidine sonraki sulandırma, heme olmayan demir bağlama dioxygenase lisans öğretim laboratuvar için uygun mevcut.

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Bu protokolün amacı, EGFR kinazproteininin aktive mutasyonları nedeniyle meydana gelen dinamik yapısal değişiklikleri incelemek için moleküler dinamik simülasyonları kullanmaktır.

EGFR Somatik Mutasyonları Moleküler Dinamik Simülasyonu ile Aktive Etmenin Yapısal Etkilerinin Deşifre Edilmesi

Öğrenin: Gibson Assembly ile moleküler klonlama tekniklerini CURE formatında uygulayarak öğrencilerin anlayış ve güvenini artırın. Bu yöntem biyoteknoloji eğitiminde pratik becerileri geliştirir.

Uyarlanabilir Bir Moleküler Klonlama Ders Tabanlı Lisans Araştırma Deneyimi ile Öğrenci Sonuçlarının İyileştirilmesi

Daha fazla video keşfet