Name: Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Keşfedin, CIRCLE-seq yöntemiyle CRISPR-Cas9 gen düzenlemedeki hedef dışı kesim bölgelerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu hesaplamalı analiz, gen tedavilerinin güvenliğini artırarak istenmeyen genom değişikliklerini önler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>CIRCLE-Seq ile Hedef Dışı CRISPR-Cas9 Bölünme Olaylarını Tespit Etme

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Frangoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+editing+for+sickle+cell+disease+and+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and beta-thalassemia.</a> N Engl J Med. 384 (3), 252-260 (2021).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+treatment+inserted+directly+into+the+body+for+first+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR treatment inserted directly into the body for first time.</a> Nature. 579 (7798), 185(2020).</li>
<li>Gillmore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+in+vivo+gene+editing+for+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis.</a> N Engl J Med. 385 (6), 493-502 (2021).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
<li>Hong, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+base+editing+and+prime+editing+of+COL7A1+mutations+in+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic base editing and prime editing of COL7A1 mutations in recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Mol Ther. 30 (8), 2664-2679 (2022).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+prime+editing+via+xrRNA+motif-joined+pegRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancement of prime editing via xrRNA motif-joined pegRNA.</a> Nat Commun. 13 (1), 1856(2022).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+editing+with+genuine+Cas9+nickases+minimizes+unwanted+indels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels.</a> Nat Commun. 14 (1), 1786(2023).</li>
<li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3143-3150 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li>
<li>Has, C., Kiritsi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapies+for+inherited+skin+fragility+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Therapies for inherited skin fragility disorders.</a> Exp Dermatol. 24 (5), 325-331 (2015).</li>
<li>Murnane, J. P., Yezzi, M. J., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+events+during+integration+of+transfected+DNA+into+normal+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination events during integration of transfected DNA into normal human cells.</a> Nucleic Acids Res. 18 (9), 2733-2738 (1990).</li>
<li>Hsieh, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndrome+unrelated+to+lentiviral+vector+in+a+patient+treated+with+gene+therapy+for+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndrome unrelated to lentiviral vector in a patient treated with gene therapy for sickle cell disease.</a> Blood Advances. 4 (9), 2058-2063 (2020).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 187-197 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Lensing, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSBCapture%3A+In+situ+capture+and+sequencing+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">DSBCapture: In situ capture and sequencing of DNA breaks.</a> Nat Methods. 13 (10), 855-857 (2016).</li>
<li>Crosetto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide-resolution+DNA+double-strand+break+mapping+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nucleotide-resolution DNA double-strand break mapping by next-generation sequencing.</a> Nat Methods. 10 (4), 361-365 (2013).</li>
<li>Yan, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLISS+is+a+versatile+and+quantitative+method+for+genome-wide+profiling+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks.</a> Nat Commun. 8, 15058(2017).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digenome-seq%3A+Genome-wide+profiling+of+CRISPR-Cas9+off-target+effects+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Digenome-seq: Genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.</a> Nat Methods. 12 (3), 237-243 (2015).</li>
<li>Cameron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+genomic+landscape+of+CRISPR-Cas9+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage.</a> Nat Methods. 14 (6), 600-606 (2017).</li>
<li>Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+off-target+detection+with+DISCOVER-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq.</a> Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).</li>
<li>Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1143157(2023).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Lazzarotto, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+CRISPR-Cas9+genome-wide+nuclease+activities+with+CIRCLE-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq.</a> Nat Protoc. 13 (11), 2615-2642 (2018).</li>
<li>Butterfield, K. T., McGrath, P. S., Han, C. M., Kogut, I., Bilousova, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+with+the+constitutive+EGFP+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of an induced pluripotent stem cell line with the constitutive EGFP reporter.</a> Methods Mol Biol. 2155, 11-21 (2020).</li>
<li>Hayashi, H., Kubo, Y., Izumida, M., Matsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+viral+delivery+of+Cas9+into+human+safe+harbor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient viral delivery of Cas9 into human safe harbor.</a> Sci Rep. 10 (1), 21474(2020).</li>
<li>Kogut, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA-based+reprogramming+of+human+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts.</a> Nat Commun. 9 (1), 745(2018).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+The+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li>
<li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nat Protoc. 16 (1), 10-26 (2021).</li>
<li>Cromer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+CRISPR+off-target+discovery+tools+following+ex+vivo+editing+of+CD34%28%2B%29+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of CRISPR off-target discovery tools following ex vivo editing of CD34(+) hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Mol Ther. 31 (4), 1074-1087 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,2 mL İnce Cidarlı Tüpler ve Düz Kapaklar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB1114</td><td></td></tr><tr><td>%1,5 PippinHT kaset</td><td>Sage Science</td><td>HTC1510</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serolojik Pipetler&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>12567603</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik Tüplü</td><td>FisherScientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>150 x 25 mm Doku Kültürü Kabı&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Reaktif Rezervuarı&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>2138127C</td><td></td></tr><tr><td>2x Kapa KiFi HotStart Hazır Karışım&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serolojik Pipetler&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>170355</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik Tüp</td><td>FisherScientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Elektroforez Tamponu&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Reaktifi, 60 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Mikrosantrifüj ve nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5400002</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon QX1</td><td>Qiagen</td><td>20912</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 nükleaz, Streptococcus Pyogenes&nbsp; </td><td>New England BioLabs</td><td>M0386M</td><td></td></tr><tr><td>CIRCLE-seq Kütüphanesi Hazırlama ve NGS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC Nitelikli Matris</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>iPSC'lerin kültürlenmesi için hücre dışı matris (ECM)</td></tr><tr><td>ddPCR SuperMix Problar için&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863010</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Kartuş Tutucu&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Kartuşları&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Contalar&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>Problar için Invitrogen</td></tr><tr><td>Damlacık Oluşturma Yağı ile üretilmiştir&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Damlacık Okuyucu Yağı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), pH 8.0, RNaz içermeyen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>Eppendorf tarafından üretilmiştir. ThermoMixer&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Ekipmanları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etil Alkol, Saf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Eksonükleaz I&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293L</td><td>E. coli</td></tr><tr><td>Filtre Ünitesi&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Filtreli Steril Pipet Uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odaklı Ultrasonikatör</td><td>Covaris</td><td>ME220</td><td></td></tr><tr><td>Genomik DNA İzolasyonu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genomik DNA Kesme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Hücre Çekirdek Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>158043</td><td></td></tr><tr><td>gRNA'lar</td><td>Synthego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144500</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS Tri-gaz Nemlendirilmiş Doku Kültürü İnkübatörü</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>51030411 iPSC'lerin kültürlenmesi ve genişletilmesi ihtiyacı (37 > C /% 5 CO2 /% 5 O2)</td></tr> <tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000 DNA ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000 Reaktifleri</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>HTP Kütüphane Hazırlama Kiti</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8235</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Antibiyotik Antimikotik</td><td>Çözelti Cytiva</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>IDTE pH 8.0 (1x TE Çözeltisi)</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>11050204</td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td></td><td></td><td>Parlak alan ve floresan kanallarda iPS kolonilerinin görüntülenmesi ihtiyacı</td></tr><tr><td>iPSC Kültürü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Eksonükleaz&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262L</td><td></td></tr><tr><td>Yükleme Uçları, 10'lu paket</td><td>Agilent</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Magnum FLX Geliştirilmiş Üniversal Mıknatıs Plakası&nbsp;</td><td>Alpaqua</td><td>A00400</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpü</td><td>Axygen</td><td>31104051</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotüp AFA Fiber Ön Yarık Çıtçıtlı Kapak&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 5x Takviyesi</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td>85852</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 Bazal Orta (400 mL)</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td>85851</td><td>Kültürde iPSC'yi korumak için ortam</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000 Spektrofotometre&nbsp;</td><td>Illumina için ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multipleks Oligolar&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Çift İndeksli Primer Seti 1</td></tr><tr><td>Optik tüp şerit kapakları, 8x şerit</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Optik tüp şeritleri, 8x şerit</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Diğer Reaktifler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Plaka Kapatıcı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>PX1</td><td>Model Numarası PX1</td></tr><tr><td>PEG/NaCl SPRI Çözümü&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0536L</td><td></td></tr><tr><td>Delinebilir Folyo Isı Yalıtımı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid Güvenli ATP'ye bağımlı DNaz&nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>E3110K</td><td></td></tr><tr><td>Primerler, Adaptörler ve Problar</td><td>IDT</td><td></td><td>Dizileri Tablo 1'de listelenmiştir</td></tr><tr><td>Proteinaz K&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAxcel Jel Analiz Sistemi&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001941</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Test Tüpleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Test Kiti&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Test Kiti&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Kübit Florometre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Dijital PCR Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td>Bir QX200 damlacık jeneratörü ve bir QX200 damlacık okuyucu içerir</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Yarı Etekli PCR Plakası&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14230244</td><td></td></tr><tr><td>SeqPlaque GTG Agaroz&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50110</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA Jel Boya&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Şişeleri&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>7202000</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td></td> Programlanabilir sıcaklık adımlama işlevine sahip <td>Agilent</td> G2992AA <td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad C1000 Touch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Twin.tec PCR Plakası&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>E951020346</td><td>96 kuyu, yarı etekli, yeşil</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase İçermeyen Damıtılmış Su&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>KULLANICI Enzimi&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M5505L</td><td></td></tr></tbody></table>

hedef dışı gen düzenlemenin sorgulanması için circle-seq

CIRCLE-Seq for Interrogation of Off-Target Gene Editing

Burada, CIRCLE-seq, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) izole edilen DNA'yı kullanarak adeno-ilişkili virüs entegrasyon bölgesi 1'i (AAVS1) hedeflemek üzere tasarlanmış gRNA ile bir kompleks içinde Cas9'un nükleaz kaynaklı bölünme bölgelerini araştırmak için kullanılır. Bu gRNA daha önce27 numaralı yayınımızda tanımlanmıştı. iPSC'lerden yaklaşık 25 μg gDNA izole edildi, odaklanmış ultrasonikasyon yoluyla kesildi ve yaklaşık 300 bps'lik parçalar elde etmek için AMPure XP boncuk saflaştırması kullanılarak boyut seçildi. Bu 25 μg DNA'dan, yaklaşık 2-5 ng DNA, in vitro Cas9:gRNA bölünmesi için başarılı bir şekilde dairesel hale getirildi. Prosedürün tamamı Şekil 1'de gösterilmiştir.
Hesaplama iş akışımızı kullanan bir CIRCLE-seq prosedürü ve analizinin ardından, tespit edilen tüm hedef içi ve dışı bölünme bölgelerinin bir görselleştirmesi Şekil 2A'da sunulmaktadır. CIRCLE-seq boru hattı ayrıca, her bir kromozom boyunca haritalanan tespit edilen nükleaz kaynaklı bölünme bölgelerini gösteren bir Manhattan grafiği elde etmek için R istatistiksel yazılımı aracılığıyla analiz edilen 'birleştirilmiş okumalar' sağladı (Şekil 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig01.jpg"> 
Şekil 1: CIRCLE-seq iş akışı şemaları. Protokolün ana adımları belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig02.jpg"> 
Şekil 2: CIRCLE-seq görselleştirmesi ve Manhattan Plot. (A) Hedef dışı bölgelerin AAVS1 lokusu için amaçlanan hedefe göre hizalanması. Hedef dizi en üstte görüntülenir ve burada hedef dışı hedefler okuma sayısına göre azalan sırada sıralanır. Orijinal hedef dizilerdeki farklılıklar renkli nükleotidlerle gösterilir. AAVS1 lokusu için en üst istenmeyen bölünme bölgelerinin bir örneği gösterilmektedir. (B) AAVS1 lokusu için tespit edilen istenmeyen bölünme bölgelerini gösteren Manhattan grafiği. Çubuk yükseklikleri, her kromozomal pozisyon için okuma sayılarını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Astar</td>
			<td>Sıra (5'-3')</td>
			<td>Yorumlar/Açıklama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 Tek kılavuz RNA (sgRNA)</td>
			<td>GGGGCCACUAGGGACAGGAU</td>
			<td>AAVS1 Locus'un Floresan Protein Knock-In için</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 İleri Astar</td>
			<td>GCTCTGGGCGGAGGAATG</td>
			<td>gRNA in vitro bölünme testi için</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 Ters Astar</td>
			<td>ATTCCCAGGGCCGGTTAATG</td>
			<td>gRNA in vitro bölünme testi için</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1288</td>
			<td>/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaT</td>
			<td>CIRCLE-seq saç tokası adaptörü</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1274</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAG</td>
			<td>TruSeq F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1275</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT</td>
			<td>TruSeqF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1310</td>
			<td>/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/</td>
			<td>TruSeq probu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1311</td>
			<td>/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/</td>
			<td>TruSeq probu</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: AAVS1 lokusunun CIRCLE-seq analizi için kullanılan gRNA ve primer dizileri.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of ...

circle-seq-for-interrogation-of-off-target-gene-editing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) / Cas (CRISPR ile ilişkili) sistemi gibi genom düzenleme araçları, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde (hiPSC'ler) gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu el yazması, CRISPR/Cas sistemi destekli homolog rekombinasyon kullanılarak soya özgü hiPSC raportörü oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

CRISPR/Cas9 kullanarak hedeflenen gen düzenleme büyük ölçüde anlayış genlerin biyolojik fonksiyonların kolaylaştırdı. Burada, biz oncogenic faaliyetlerini incelemek için model calreticulin mutasyonların sitokin bağımlı hematopoetik hücreler için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmaktadır.

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

Burada, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin anormal proliferatif kapasitesi için çok önemli olan aday genleri tanımlamak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

Oviductal Nükleik Asitler Yoluyla Geliştirilmiş Genom Düzenleme  (I-GONAD) yönteminin etkinliği, donör dişilerden zigot toplanmasını ve yalancı hamile kadınlara aktarılmasını gerektiren geleneksel mikroenjeksiyon ile karşılaştırılabilir. Bu protokol, CRISPR/Cas9 ile indüklenen mutasyonları kromozom 6'daki ROSA26 lokusuna sokarak etkinliğini gösterir.

Nakavt Fare Üretimi için Oviduktal Nükleik Asitler Teslimatına Dayalı In Vivo Elektroporasyon Tekniği ile Geliştirilmiş Genom Düzenleme

Genom editörlerinin RNA olarak sunulması, birincil memeli hücrelerinin ve hücre hatlarının genomlarını değiştirmek için özellikle güçlü bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, genom düzenleyicilerini mRNA olarak birincil memeli hücrelerine ve hücre hatlarına göndermek, ardından düzenleme sonuçlarını nicelendirmek için hedefli Illumina dizileme ve analizi yapmaktır.

Birincil memeli hücrelerinde editör RNA'nın elektroporasyonu yoluyla genom düzenlemesi

Keşfedin, CIRCLE-seq yöntemiyle CRISPR-Cas9 gen düzenlemedeki hedef dışı kesim bölgelerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu hesaplamalı analiz, gen tedavilerinin güvenliğini artırarak istenmeyen genom değişikliklerini önler.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Daha fazla video keşfet