Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Ekibimiz, resesif distrofik epidermoliz bülloza gibi ciddi, şu anda tedavi edilemeyen cilt hastalıkları için indüklenmiş pluripotent kök hücre, iPSC tedavileri geliştirmeye kendini adamıştır. iPSC'nin cilt hücrelerine farklılaşması ile birlikte hassas gen düzenlemesinin bu koşullar için uygun bir tedavi seçeneği sağlayıp sağlayamayacağını belirlemeyi amaçlıyoruz. CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak somatik hücrelerde ve iPSC'lerde gen düzenleme, genetik cilt bozuklukları da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için kişiselleştirilmiş tedavileri mümkün kılarak rejeneratif tıbbı dönüştürüyor.

Genetik mühendisliğindeki mevcut zorluklar, gen editörlerinin hedef dışı etkilerini içerir. Terapötik, genomdaki diğer herhangi bir yeri değiştirmeden ilgilenilen geni hassas bir şekilde düzelten gen editörlerini gerektirir. Buradaki zorluk, gen editörlerinin hedef genin ötesinde istenmeyen düzenlemeler yapmadığını göstermektir.

CIRCLE-seq protokolü, diğer benzer tekniklerin gözden kaçırabileceği iyi niyetli potansiyel hedef dışı sitelerin tanımlanmasını sağlar. Bu hedef dışı bölgelerin kapsamlı bir analizi, cilt hastalıkları için IPSC tabanlı tedavimiz de dahil olmak üzere gen terapilerinin güvenliğini artırarak, genom editörlerinin aktivitesi hakkında değerli bilgiler sağlar. İndüklenmiş pluripotent kök hücreleri beş gün boyunca büyüttükten sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve 10 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Hücre sayımı için altı mikrolitre hücre süspansiyonunu altı mikrolitre tripan mavisi ile karıştırın. Saydıktan sonra, tüp başına yedi hücrenin gücüne 10 kez iki kez alikot yapın. Hücreleri 300 G'de 25 santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Kontrol kolunu hedef alarak odaklanmış ultrasonicator'ı hazırlayın. Rezervuarı arıtılmış, deiyonize su ile doldurun. Kontrol istasyonu dizüstü bilgisayarında su tesisatına erişin ve sistemi doldurmaya başlamak için doldur'a tıklayın.

Sıcaklığı 4,5 santigrat dereceye ayarlayın. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden izole edilen 25 mikrogram genomik DNA'yı bir mikrotüpe aktarın. Tüpü TE tamponu ile toplam 130 mikrolitre hacme kadar doldurun.

DNA'yı ortalama 300 baz çifti uzunluğuna, 10 saniye süreye, 70 tepe gücüne, görev faktörü yüzdesini 20'ye ve döngü patlamasını 50'ye kesmek için koşulları ayarlayın. Kesilmiş genomik DNA'yı her biri 65 mikrolitrelik iki parçaya bölün. Numuneleri, XP boncuklarının hacminin 1,8 katı kullanarak saflaştırın ve ardından manyetik raf ayrımı yapın.

Süpernatanı yeni bir PCR plakasına aktarın ve bir spektrofotometre kullanarak DNA miktarını ölçün. Son olarak, ima edilen kesme genomik DNA'sının bir mikrolitresini bir teyp istasyonunda çalıştırın. Başlamak için, oSQT1288'i ve saç tokası adaptörünü TE tamponunda 100 mikromolar nihai konsantrasyona yeniden askıya alın.

Adaptör tavlaması için, toplam 100 mikrolitre hacme ulaşmak için 40 mikrolitre oSQT1288, 10 mikrolitre 10X STE ve 50 mikrolitre nükleaz içermeyen suyu karıştırın. Adaptör tavlamasından sonra, 10 mikrolitre 5X ligasyon tamponu, beş mikrolitre DNA ligaz ve beş mikrolitre tavlanmış firkete adaptörü karıştırın, boncuklar içeren her ayrıştırılmış DNA örneğine 20 mikrolitre adaptör ligasyon ana karışımını pipetleyin. Numuneleri bir saat boyunca 20 santigrat derecede bir termosiklertöre yerleştirin, ardından süresiz olarak dört santigrat derecede tutun.

Daha sonra, 50 mikrolitre PEG / NaCl sprey solüsyonunu adaptörle bağlanmış DNA'ya aktarın. XP boncukları ve manyetik raf ayırma kullanarak numuneleri saflaştırın. Numuneleri 30 mikrolitre TE tampon pH sekiz ile elute edin ve süpernatanları yeni bir yarı etekli PCR plakasına boşaltın.

Numuneleri birleştirin ve dsDNA BR testini kullanarak DNA'yı ölçün. Daireselleştirme ana karışımını hazırlamak için, toplam 20 mikrolitre hacim için sekiz mikrolitre nükleaz içermeyen su, 10 mikrolitre 10X TD4 DNA ligaz tamponu ve iki mikrolitre T4 DNA ligaz birleştirin. 20 mikrolitre daireselleştirme ana karışımını, PNK kullanıcısı ile muamele edilmiş 80 mikrolitre 500 nanogram DNA'ya pipetleyin.

Numuneyi 16 santigrat derecede bir termosiklerde 16 saat inkübe edin. Ertesi gün, dairesel DNA'ya 100 mikrolitre XP boncuğu ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi örnekleri saflaştırın. Numuneyi 38 mikrolitre TE tamponu ile doldurun ve süpernatanı yeni bir yarı etekli PCR plakasına boşaltın.

Saflaştırılmış dairesel genomik DNA'yı parçalamak için, toplam 11 mikrolitre hacim için beş mikrolitre 10X Cas9 tamponu, 4.5 mikrolitre Streptococcus pyogenes Cas9 ve 1.5 mikrolitre genomik RNA'yı birleştirerek in vitro bölünme ana karışımı hazırlayın. Bölünme ana karışımını oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Cas9 gRNA RNP komplekslerini oluşturmak için.

125 nanogram plazmid güvenli DNaz ile muamele edilmiş genomik DNA'yı, nükleaz içermeyen suda 39 mikrolitrelik bir nihai hacme seyreltin. Ardından, toplam 50 mikrolitre hacim için 39 mikrolitre DNA'ya 11 mikrolitre bölünme ana karışımı ekleyin. Karışımı bir termocycler'da 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin ve süresiz olarak dört santigrat derecede tutun.

İnkübasyondan sonra, in vitro parçalanmış DNA'ya 50 mikrolitre XP boncuk ekleyin ve DNA'yı manyetik bir raf üzerinde saflaştırın. Saflaştırılmış DNA'yı 42 mikrolitre TE tamponunda elute edin. Yeni nesil sıralama verilerinin analizi için Python sürüm 2.7, Burrows-Wheeler Aligner ve SAMtools'u yükleyin.

Referans genomu verilen web sitesinden indirin. Referans genom FASTA dosyasını, analiz için çıktı dizinini ve BWA ve SAMtools komutlarının yollarını tanımlayın. Hem nükleaz parçalanmış hem de kontrol örnekleri için hedef dizileri ve çoğullaması kaldırılmış FASTQ dosyalarının yollarını belirtin.

Aşağıdaki komutu kullanarak standart başvuru tabanlı analizi yürütün. Tam işlem hattını yürütürken, her adımın çıkış sonuçlarını, söz konusu adım için belirlenmiş ayrı bir çıkış klasöründe bulun.