Name: DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Öğrenin, DNA hasar bölgelerindeki protein etkileşimlerini yakınlık ligand testi ve Gamma-H2AX boyama ile U2OS hücrelerinde nasıl lokalize edeceğinizi. Bu yöntem, hücre biyolojisi ve kanser araştırmalarında terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>DNA hasarında protein etkileşimi ve lokalizasyonunun değerlendirilmesi

<ol><li>Xiao, W., Samson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+endogenous+DNA+alkylation+damage+as+a+source+of+spontaneous+mutation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).</li>
<li>Lindahl, T., Barnes, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+endogenous+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of endogenous DNA damage.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).</li>
<li>DNA damage, aging, and cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22N+Engl+J+Med%22">N Engl J Med</a>. Hoeijmakers Jan, H. J. 361 (15), 1475-1485 (2009).</li>
<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+Making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: Making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EnvironMol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX%3A+a+sensitive+molecular+marker+of+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair.</a> Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+phosphorylated+H2AX+foci+formation+and+DNA+repair+assembly+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+heterodimerization+of+protein+isoforms+using+an+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (140), (2018).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Nguyen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nek4+regulates+entry+into+replicative+senescence+and+the+response+to+DNA+damage+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts.</a> Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).</li>
<li>Basei, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Animal+Cell+Culture+Guide%22">Animal Cell Culture Guide</a>. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).</li>
<li>Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II%CE%B1-dependent+induction+of+a+persistent+DNA+damage+response+in+response+to+transient+etoposide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22MolOncol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure.</a> MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide-induced+DNA+damage+affects+multiple+cellular+pathways+in+addition+to+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response.</a> Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEK5+interacts+with+topoisomerase+II%CE%B2+and+is+involved+in+the+DNA+damage+response+induced+by+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide.</a> J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).</li>
<li>George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+proximity+ligation+assay+%28PLA%29+for+detection+of+RNA-protein+complex+interactions+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).</li>
<li>Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+assay+for+specific+RNA-protein+interactions+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells.</a> RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).</li>
<li>Hegazy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assay+for+detecting+protein-protein+interactions+and+protein+modifications+in+cells+and+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ.</a> Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Siyah 384 oyuklu plakalar</td><td>Perkin Elmer Hücre taşıyıcı plakalar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eşek ve nbsp; anti-Tavşan Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Duo link Eşek anti Fare Eksi</td><td>Sigma</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink antikor seyreltici</td><td>Sigma</td><td>DUO82008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink engelleme çözümü 1X</td><td>Sigma</td><td>DUO82007</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Algılama reaktifi Uzak kırmızı</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Eşek anti keçi artı</td><td>Sigma</td><td>DUO92003</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Eşek anti tavşan artı</td><td>Sigma</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti Nek4</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-5517</td><td>keçi anti Nek4 1:50 seyreltmede kullanıldı</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Termo</td><td>H1399</td><td>0.6 ve mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Leica DMI mikroskobu</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti Ku70</td><td>Thermo</td><td>MA5-13110</td><td>fare anti Ku70 1:100 seyreltmede</td></tr><tr><td>Fare anti TOPII & beta'da kullanıldı;</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-365071</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Tavşan anti Nek5</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-84527</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Tavşan anti Y H2AX</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9718S</td><td>1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>U2OS hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>HTB-96&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

dna hasar bölgelerindeki proteinleri lokalize etmek için yakınlık ligand testi

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

Etoposid tedavisinin yokluğunda Nek4-Ku70 etkileşimini gözlemledik. Bununla birlikte, bu etkileşim çekirdeğin dışında gerçekleşebilir (Şekil 1A). Nek4-Ku70 etkileşimi, DNA hasarından sonra artar ve çekirdekte yoğunlaşır (Şekil 1A). Nek5-Topoizomeraz II β (TOPIIβ) etkileşimi durumunda, bu testte literatür sonuçlarına18 dayalı pozitif bir kontrol olarak kullanılır, etkileşim etoposid tedavisi ile büyük ölçüde artar (Şekil 1B).
Etoposid tedavisi yaklaşık% 40'lık bir artışı teşvik eder (araçla tedavi edilen hücrelerde ortalama 9 nokta / çekirdek, etoposid ile tedavi edilen hücrelerde 12 - 14 nokta / çekirdek). Nek4 ve Ku70'in etkileşimi, DNA hasar koşullarından münhasır değildir. Gerçekten de, Nguyen ve ark.12 , bu proteinlerin hücresel hasarın yokluğunda etkileşime girebileceğini ve DNA'ya bağımlı olmadığını, yani etkileşimin her zaman DNA hasar bölgelerinde olmadığını gösterdi.
γ-H2AX boyaması kontrol koşullarında yoktur, ancak 20 dakikalık etoposid tedavisinden sonra artar ve tedaviden 3 saat sonrasına kadar devam eder (Şekil 1C). Etkileşim noktalarından bazıları γ-H2AX boyamaya yakındır (Şekil 1C). 1 saatlik tedaviden sonra, Nek4-Ku70 etkileşim noktalarının çoğu DNA hasar odaklarında yoğunlaşır (Şekil 1C).
Nek4 için nakavt p civarındadır (veriler sunulmamıştır), bu da sinyalin tamamen ortadan kaldırılmayacağı anlamına gelir. Nokta/çekirdek sayısındaki farkın protein tükenmesine eşdeğer olmadığına inanıyoruz çünkü anımsatan protein, DNA hasar tepkisine ayrılacak ve daha sonra Ku70 ile etkileşime girecektir. Etoposid ile 3 saat boyunca tedavi edilen Nek4 knockdown hücrelerinde bulunan nokta/çekirdek ortalaması 10'dur, bu da aynı durumdaki kontrol PLKO hücrelerine kıyasla yaklaşık 0'luk bir azalma anlamına gelir. Etoposidin araçla tedavi edilen hücrelerle ilgili olarak Nek4-Ku etkileşimini @ oranında artırdığını ve Nek4 yıkımının p'ine sahip olduğumuzu düşünürsek, yıkılan hücreler yaklaşık 10 nokta/çekirdek sunacaktır. Nek4 ve Ku70'in etkileşimi, DNA hasar tepkisine özel değildir ve DNA hasarından sonra artmasına rağmen, en büyük değişiklik etkileşimin lokalizasyonundadır.
Burada gösterilen sonuçlar, DNA hasar tepkisi bağlamında proteinlerin etkileşimini lokalize etmek için önemli bir araç sunmaktadır. Nek4 ve Ku70 zaten DDR'de yer alıyor ve Nek4, Ku70/Ku80'in DNA hasar odakları12'ye alınması için önemli görünüyor. Bununla birlikte, bu etkileşimin mekansal ve zamansal özellikleri, γ-H2AX boyama ile birlikte PLA kullanılarak keşfedilebilir.
Ko-immünopresipitasyon ve immünofloresan gibi diğer teknikler de benzer bilgiler sağlayabilir, ancak ayrı ayrı. γ-H2AX işaretçisinin referans olarak kullanılması, etkileşimin zamansal ve uzamsal olarak izlenmesine olanak tanır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67072/67072fig01v4.jpg"> Resim 1: Nek4 - Ku70 DNA hasar durumlarında etkileşim. (A) U2OS hücreleri 20 dakika, 1 saat ve 3 saat boyunca etoposid (25 μM) ile inkübe edildi. Tedaviden sonra, hücreler buz gibi soğuk metanol ile fikse edildi ve PLA, birincil antikor olarak keçi anti-Nek4 ve fare anti-Ku70 kullanılarak gerçekleştirildi. Çekirdek Hoechst 33342 ile boyandı ve mavi renkte sunuldu; PLA noktaları kırmızı renkle gösterilir. Kontrol hücreleri, 1 saat boyunca etoposid ile muamele edilen ve sadece bir birincil antikor (keçi anti-Nek4) ve her iki ikincil antikor ile inkübe edilen hücrelerdi. Biyolojik kontrol, 3 saat boyunca etoposid ile muamele edilen Nek4 yıkım hücreleri (shRNA Nek4) idi. (B) Literatür sonuçlarına dayalı olarak testin pozitif kontrolü: U2OS hücreleri 1 saat boyunca 25 μM etoposit ile inkübe edildi ve PLA, fare anti-Nek5 ve tavşan anti-TOPIIβ ile gerçekleştirildi. Grafik, bir deneyi temsil eder ve en az 4 farklı alanda (kontrol için en az 35 hücre ve diğer tüm koşullar için 50 hücre) oluşan tüm hücrelerden elde edilen ortalama artı standart hata ortalamasını (SEM) temsil eder. Anlamlılık, t-testi ve *: p&lt;0.05, **p&lt;0,01 ve *** p&lt;0,001 kullanılarak DMSO aracına göre elde edildi. (C) PLA'dan sonra, (A)'da sunulan hücreler PBS ile yıkandı ve tavşan anti-γ-H2AX antikoru ile inkübe edildi. 1 saatlik inkübasyondan sonra, tavşana karşı ikincil antikor, DNA hasar odaklarının tespiti için kullanıldı ve yeşil renkte sunuldu. PLA ve γ-H2AX'in birlikte boyanmasını içeren bölgeler yakınlaştırılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/67072fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Klasör yapısı. Nucleus ve PLA'dan gelen görüntüler, burada gösterildiği gibi farklı klasörlere yerleştirilmelidir. Dosya adları belirli bir önekle başlamalı (örneğin, DAPI, PLA) ve her klasörde karşılık gelen bir görüntüye sahip olmalıdır (örneğin, DAPI_control1.tif ve PLA_control1.tif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: Makro parametreleri penceresi. Makroyu ImageJ/FIJI'de açtıktan/çalıştırdıktan sonra, kullanıcıdan veri klasörlerini seçmesi ve parametreleri girmesi istenecektir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek kodlama dosyası 1: ImageJ için oluşturulan makro dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/pla_dots_per_nucleus_basei_et_al_2024.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

proximity-ligand-assay-to-localize-proteins-in-dna-damage-sites

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, nematod hücrelerinde in situ protein-protein etkileşimlerini incelemek için yakınlık ligasyon testini açıklar. İlgilenilen proteinlerin yakınlığı, ikincil bir antikora bağlı bir PLA probu yardımıyla dairesel DNA şablonunu oluşturur. Prob, hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu sağlayan uzun tek sarmallı bir DNA ve ardından dedektör probunun hibridizasyonunu üreten amplifikasyon çözeltisi kullanılarak daha da büyütülür.

Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Bu iletişim kuralı plazmid DNA üzerinde tanımlanmış DNA-protein Glossar tamiri ölçmek için hedeftir. Lesioned plazmid alıcı memeli hücre satırları ve düşük molekül ağırlığı birden çok kez puan sonrası transfection hasat içine transfected. DNA onarım Kinetik sayısal qPCR tarafından takip strand özgü astar uzantısı kullanma.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

DNA adduktları ile replikasyon çatalı çarpışmaları çift iplikçik kopmalarına neden olabilirken, replikomlar ve bloke edici lezyonlar arasındaki etkileşim hakkında daha az şey bilinmektedir. Bu karşılaşmaları görselleştirmek ve replisome kompozisyonunun sonuçlarını karakterize etmek için yakınlık ligasyon testini kullandık.

Antijen Etiketli Blokaj Lezyonu ile Tekrarlayan Karşılaşmaların Görselleştirilmesi

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Biz, ATP-kapılı P2X2 reseptörlerinin tam uzunlukta C terminus bağlamak beyin proteinleri tespit etmek için basit bir protokol açıklar. Bu yaklaşımın uzantısı ve sistematik bir uygulama tüm p2x reseptörlerine p2x reseptör sinyal daha iyi anlaşılmasına yol açması bekleniyor.

P2X2 Ligandla Gated Katyon Kanalları ile etkileşimde Proteinler tanımlamak için Proteomik

Öğrenin, DNA hasar bölgelerindeki protein etkileşimlerini yakınlık ligand testi ve Gamma-H2AX boyama ile U2OS hücrelerinde nasıl lokalize edeceğinizi. Bu yöntem, hücre biyolojisi ve kanser araştırmalarında terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olur.

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

Daha fazla video keşfet