Name: Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Keşfedin sıtma parazitlerinde telafi edici yolları, temel protein kinazlarının hipomorfik alellerini CRISPR-Cas9 ile inceleyerek. Çift kinaz hedefleme, ilaç direncini önlemek için yeni tedavi stratejileri sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Sıtma Parazitinde Yeniden Kablolanan Kinazların Belirlenmesi: Kimyasal Genetik Bir Yaklaşım

<table><tbody><tr><td>1x fosfat inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GST antikoru</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tavşan HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall legend micro 17R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (Bakteri hücresini peletlemek için)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (Paraziti peletleme/işlemek için)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R (TX-400 rotor)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) pLysS yetkin hücreler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5a Yetkin Hücreler</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon Küvetleri, 0,2 cm boşluk</td><td>BioRad</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>BioRad</td><td>GenePulser Xcell</td><td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP kemilüminesan reaktif</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Leke</td><td>Himedia</td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutatyon Sefaroz 4B</td><td>GE Sağlık</td><td>17075601</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Serbest Asit</td><td>Merck</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksantin</td><td>Merck</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>İnfüzyon HD klonlama Kiti</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP, fosforillenmiş</td><td>&nbsp; Merck</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleobond Xtra Maxi EF&nbsp; &nbsp;</td><td>Takara Bio</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Jel ve PCR temizleme Mini kiti</td><td>Takara Bio</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrobenzil mesilat (PNBM)</td><td>Abcam</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max DNA Polimeraz</td><td>Takara Bio</td><td>R045A</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Qiaprep Spin Miniprep Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL siteye yönelik mutajenez kiti</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Birinci İplikli Sentez kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>Tiyofosfat ester antikoru</td><td>Abcam</td><td>Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

bitki benzeri kinazların hipomorfik alelini barındıran mutant bir sıtma parazitinde telafi edici yolların gelişimini anlamak

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

Rekombinant WT CDPK1, N-terminal Glutatyon S-transferaz (GST) etiketine sahip bir füzyon proteini olarak eksprese edilir ve GST afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılır. Saflaştırılmış CDPK1 proteini, anti-CDPK1 ve anti-GST antikorları kullanılarak Western blot yoluyla tespit edildi (Şekil 1). WT CDPK1'deki treonin bekçi kalıntısı (T145), sırasıyla CDPK1T145M ve CDPK1T145S mutant rekombinant proteinler üretmek için bölgeye yönelik mutajenez kullanılarak Met ve Ser ile değiştirildi (Şekil 2). Tüm rekombinant CDPK1 proteinlerinin kinaz aktivitesini değerlendirmek için in vitro kinaz testi yapıldı. Kinaz aktivitesi, Western blot formatında spesifik bir antikor kullanılarak tiyo-fosfat ester grubunu tespit ederek yarı sentetik bir epitop etiketleme yaklaşımı34 kullanılarak test edildi (Şekil 3). Kapı bekçisi ikamesinin CDPK1'in otofosforilasyon aktivitesi ve CDPK1'in eksojen bir substratı olarak kullanılan MBP'nin transfosforilasyonu üzerindeki etkisi, ilgili otofosforilasyon ve transfosforilasyon bantlarının yoğunluğunun ölçülmesiyle değerlendirildi. Metiyonin kapı bekçisine sahip mutant CDPK1, ~% 53 transfosforilasyon aktivitesini korurken, kapı bekçisi konumunda bir serin varlığı, substrat transfosforilasyonunun tamamen kaldırılmasına yol açtı (Şekil 3). Thr'den Met'e (T145M) kapı bekçisi ikamesine yol açan SNP'ler, iki plazmit sistemi kullanılarak CRISPR-Cas9 aracılığıyla endojen cdpk1 lokusunda tasarlandı (Şekil 4 ve Şekil 5). T145S ikamesi ile mutant parazitler, muhtemelen Ser kapı bekçisinin CDPK1 aktivitesi üzerindeki ölümcül etkisi nedeniyle üretilemedi. CDPK1T145M mutant parazitler, sınırlayıcı seyreltme yöntemi kullanılarak alt klonlandı ve kapı bekçisi ikamesi, CDPK1T145M mutant parazitin oluşumunu doğrulamak için Sanger dizilemesi yoluyla doğrulandı. CDPK ailesinin 7 üyesi ve parazitin geç şizogonik gelişiminde yer alan diğer 4 kinaz dahil olmak üzere 11 farklı kinazın transkript seviyeleri gerçek zamanlı PCR kullanılarak test edildi (Şekil 6). 11 farklı kinazın ekspresyon seviyeleri, temizlik genlerine normalize edilmiş CDPK1T145M mutant ve vahşi tip (WT) parazitler arasında karşılaştırıldı. CDPK aile üyelerinin transkript ekspresyonu, WT parazitine kıyasla CDPK1T145M mutantında değiştirildi (Şekil 6). CDPK1T145M mutantında daha yüksek ekspresyon gösteren transkriptler, CDPK1T145M mutant parazitinde CDPK1'in işlevini telafi ediyor olabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg"> Şekil 1: Tam uzunlukta rekombinant vahşi tip (WT) PfCDPK1'in karakterizasyonu. N-terminal Glutatyon S transferaz (GST) etiketi ile kaynaşmış tam uzunlukta WT CDPK1 proteini afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve SDS-PAGE'de ayrıldı. CDPK1, Coomassie Brilliant Blue R-250 lekeli poliakrilamid jelde gösterildiği gibi ~ 87 kDa'lık tahmin edilen moleküler kütleye göç etti. SDS-PAGE'de ayrılan rekombinant protein, bir PVDF membranına aktarıldı ve anti-CDPK1 ve anti-GST antikorları ile Western blot analizi için işlendi. SDS-PAGE'deki tam uzunlukta rekombinant CDPK1'e karşılık gelen bant, her iki antikorla da tespit edildi ve proteinin kimliğini doğruladı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg"> Şekil 2: Saflaştırılmış rekombinant CDPK1 geçit bekçisi mutant proteinlerinin karakterizasyonu. (A) TgCDPK1 ve PfCDPK1'in birincil amino asit dizisinin hizalanması (Plasmodb erişim no. PF3D7_0217500). PfCDPK1'in 145 pozisyonundaki treonin, TgCDPK128'deki kapı bekçisi pozisyonu olan glisin 1'e karşılık gelir (kırmızıyla vurgulanmıştır). (B) WT CDPK1'de üçlü kodon ACC (siyah daire) tarafından kodlanan Thr kapı bekçisi kalıntısının (kırmızıyla vurgulanmıştır) karikatürist temsili. CDPKT145M'da Met (sarı ile vurgulanmış) ve CDPKT145S'de Ser (mavi ile vurgulanmıştır) ile rekombinant mutant CDPK1 proteinleri oluşturmak için kapı bekçisi kalıntısının bölgeye yönelik mutajenez ile ikame edilmesi. (C) CDPK1'in rekombinant WT ve mutant proteinlerinin SDS-PAGE profili. Rekombinant WT ve kapı bekçisi mutant proteinleri, GST afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve SDS-PAGE'de ayrıldı. Tüm rekombinant proteinler, ~ 87 kDa'lık beklenen moleküler ağırlığa uygundur. M- moleküler ağırlık merdiveni. (D) Rekombinant CDPK1 WT ve mutant proteinlerin Western blotlama yoluyla karakterizasyonu. CDPK1'in rekombinant WT ve gatekeeper mutant proteinleri SDS-PAGE'de ayrıldı ve Western blotlama için PVDF membranına aktarıldı. SDS-PAGE'deki tam uzunlukta rekombinant WT ve mutant CDPK1 proteinlerine karşılık gelen bantlar, anti-CDPK1 ve anti-GST antikorları ile tespit edildi ve tüm rekombinant proteinlerin kimliğini doğruladı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg"> Şekil 3: CDPK1'deki Gatekeeper ikamesi, mutant enzimlerin kinaz aktivitesinde bir azalmaya yol açar. (A) CDPK1 proteininin kinaz aktivitesini tespit etmek için yarı sentetik epitop etiketleme yaklaşımının karikatürist temsili. Burada sadece transfosforilasyon aktivitesi gösterilmiştir. CDPK1 proteini tiyofosforilatları, aktarılabilir bir terminal tiyofosfat grubu kaynağı olan ATPγS (katı sarı üçgen) varlığında dışsal bir substratı (S, katı yeşil kare) içerir. Tiyofosforile kalıntı, p-nitrobenzil mesilat (PNBM) ile muamele edilerek alkillenir ve daha sonra alkillenmiş tiyofosfat eklentisini spesifik olarak tanıyan bir antikor ile tespit edilen bir tiyofosfat ester oluşturur. (B) İn vitro kinaz aktivite testi, kapı bekçisi ikamesinin rekombinant CDPK1 mutant proteinlerinin otofosforilasyonu ve transfosforilasyon potansiyeli üzerindeki etkisini test etmek için yarı sentetik bir epitop etiketleme yaklaşımı kullanılarak kullanıldı. Tüm rekombinant proteinler kalsiyuma bağımlı kinaz aktivitesi gösterir. CDPK1'in oto-fosforilasyonu ve eksojen bir substrat olan miyelin bazik proteininin (MBP) trans-fosforilasyonu, yalnızca kalsiyum klorür (Ca2 +) varlığında belirgindi, ancak Ca2 + iyonlarının spesifik bir şelatörü olan EGTA varlığında fosforilasyon tespit edilmedi. Kapı bekçisi mutantları, azalmış otofosforilasyon aktivitesi gösterirken, MBP'nin transfosforilasyonu CDPK1T145S yılında tamamen iptal edildi. CDPK1T145M, daha önce bildirildiği gibi transfosforilasyon potansiyelini (~ S) korur32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg"> Şekil 4: CRISPR-Cas9 kullanılarak cdpk1 lokusunda kapı bekçisi konumunda SNP'leri tanıtmak için plazmitlerin yapımı. 432 ila 451 bp'ye karşılık gelen 20 nükleotidlik bir kılavuz dizisi, pL6CK1G oluşturmak için pL6eGFP plazmidindeki BtgZI kısıtlama bölgesinde klonlandı. İstenen SNP'leri (T145M veya T145S, yeşil ile gösterilen karşılık gelen kodon) ve kalkan mutasyonlarını (kırmızı ile gösterilmiştir) içeren bir homoloji kolu (421 bp), sırasıyla pL6CK1GT145M ve pL6CK1GT145M oluşturmak için AflII ve SpeI kısıtlama enzim bölgeleri içinde pL6CK1G'de klonlandı. Kalkan mutasyonları, istenen düzenlemeden sonra değiştirilmiş lokusun yeniden kesilmesini önler. İkinci bir plazmidde kodlanan Cas9 endonükleaz olan pUF1, pL6CK1GT145M/S plazmidinden eksprese edilen kılavuz RNA yardımıyla cdpk1 lokusu içindeki hedef bölgeye yönlendirilir. Cas9, hedef bölgede PAM dizisinin 5 'tarafına doğru çift iplikçik kopması sağlar. DSB, pL6CK1GT145M/S plazmidindeki homoloji kolu kullanılarak onarılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg"> Şekil 5: P'nin şematik gösterimi. cdpk1 lokusunda kapı bekçisi mutasyonunun (T145M) tanıtılması için CRISPR plazmitleri ile falciparum transfeksiyonu. i) Asenkron P. Falciparum kültürü, senkronize halka aşamalı parazitler elde etmek için sorbitol ile muamele edilir. ii) Senkronize halka aşamalı parazitler, tampon çözelti içinde yeniden süspanse edilmiş pL6CK1GT145M/S ve pUF1 plazmitleri ile birlikte bir elektroporasyon küvetine alınır. iii) Parazitler 310 volt, 950 μF ve sonsuz dirençte elektropore edilir. iv) Transfeksiyonu takiben, parazitler taze tam RPMI ortamı (cRPMI) içeren bir T25 şişesine aktarılır ve 48 saat boyunca kültürlenir. 48 saat sonra, transfekte edilen parazitler, WR99210 ve DSM267 ilaçları ile desteklenmiş cRPMI'ye geçirilir ve T75 şişesinde genişletilir. v) 14. günde slaytlar hazırlanır ve Giemsa boyası kullanılarak boyanır. vi) Daha sonra, parazitleşmiş eritrositlerin varlığını değerlendirmek için kan yayması bir ışık mikroskobu altında görüntülenir. vii) Görselleştirme üzerine, parazitlerin ilaçların varlığında büyümesine izin verilir. Daha sonra, parazitler, hedef cdpk1 lokusunun istenen modifikasyonunun doğrulanması için PCR ve DNA dizilimi şablonunu elde etmek üzere işlenir. viii) Doğrulamayı takiben, 96 oyuklu bir plakada sınırlayıcı seyreltme ayarlanarak klonal transgenik parazitler elde edilir. ix) Pozitif kuyucuklardan klonal transgenik parazitler T25 şişelerine aktarılır ve büyümelerine izin verilir. x) Klonal transgenik parazitler, DNA dizilimi ve kromatogramın analizi yoluyla PCR ve kapı bekçisi konumunda istenen SNP'lerin varlığı yoluyla daha da doğrulanır. Şekil32'den değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg"> Şekil 6: Gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) yoluyla hedef genlerin transkript analizi için kullanılan adımların şematik gösterimi. i ) S. Ağırlıklı olarak olgun Schizon evre parazitleri olan Falciparum kültürü, aynı döngüde sorbitol tedavisi ile elde edilir. ii) Parazitler, olgun şizont evre parazitlerin zenginleştirilmesi için 15 mL'lik bir konik tüp içinde 70/40 Percoll / sorbitol gradyanı üzerine nazikçe katmanlanır. iii) @ ve p kişisel / sorbitol interfazındaki siyah renkli halka, 50 mL'lik taze bir tüpe aktarılır, işlenir ve cRPMI'de yeniden süspanse edilir. Şizont evresinde zenginleştirilmiş parazitler, istila için 37 ° C'de önceden inkübe edilmiş taze RBC'ler ile inkübe edilir. iv) Parazitler 4 saat boyunca kültürlenir ve daha sonra yüksek oranda senkronize 0-4 saat halka aşamalı parazitler elde etmek için% 5 sorbitol ile muamele edilir. v) Parazitler, yüksek derecede senkronize 44-48 saat şizont evre parazitleri elde etmek için sorbitol sonrası 44 saatlik ek bir tedavi için daha fazla kültürlenir. vi) Senkronize parazitler, RBC'lerden serbest bırakılması için saponin ile muamele edilir ve RNA ekstraksiyon reaktifinde saklanır. Toplam RNA, RNA ekstraksiyonu yeniden askıya alınmış parazitlerden izole edilir. vii) cDNA, izole edilen RNA'dan hazırlanır. viii) Gene özgü primerler kullanılarak hedef genleri amplifiye etmek için cDNA şablonuyla gerçek zamanlı bir PCR deneyi kurulur. Plaka, gerçek zamanlı bir PCR sistemi üzerinde çalıştırılır. ix) Transkript ifade verileri bir analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Grafik, CDPK1 T145M parazitlerinde vahşi tipe (WT) kıyasla 11 kinazın diferansiyel transkript ekspresyon seviyelerini temsil etmektedir. Bu rakam32'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Gen adı</td>
			<td colspan="4">Astar dizisi</td>
		</tr><tr><td>Pk1fpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGTGTGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr><tr><td>Pk1rpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S Serisi</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAATATTTTTTTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAATATATTTTTTTTTATTTAGTAATTGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145M_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTATTACTAAAAAATATCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEREV</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA</td>
		</tr><tr><td>ck1f1 </td>
			<td colspan="4">ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG</td>
		</tr><tr><td>CK1R3WT</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Çalışmada Kullanılan Primerlerin Listesi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Gen Adı</td>
			<td colspan="2">İleri Astar</td>
			<td colspan="2">Ters Astar</td>
		</tr><tr><td>CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2">GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2">ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT</td>
		</tr><tr><td>CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2">GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2">TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG</td>
		</tr><tr><td>CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2">CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2">CAGCGTCCATTGTAAG ACATCTTTTTATTAAATC</td>
		</tr><tr><td>CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2">ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2">CTTATCACTAATTTTTTT GAATTGTGGTAAATCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2">GGAGGTCGAAGATATGGATAÇGAATAG</td>
			<td colspan="2">TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2">CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCG</td>
			<td colspan="2">ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC</td>
		</tr><tr><td>CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2">AGTCCTAAAAAAGATATA TAAAGAACTAGGTAGTAG</td>
			<td colspan="2">TTTAAAAATAATCTTTCCCCACCACCC</td>
		</tr><tr><td>PKA (PF3D7_0934800)</td>
			<td colspan="2">AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG</td>
			<td colspan="2">CTTTTGTTTCTTCTTAAA AATGTAAAAAATTCTCC</td>
		</tr><tr><td>Paket (PF3D7_1436600)</td>
			<td colspan="2">AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGC</td>
			<td colspan="2">CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr><tr><td>PKB (PF3D7_1246900)</td>
			<td colspan="2">CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2">GAGAGCGCAATTAGCCATATTG</td>
		</tr><tr><td>PI3K (PF3D7_0515300)</td>
			<td colspan="2">CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2">ATCACATTTGTTATACTT ATTATCATCACATTTGTT</td>
		</tr><tr><td>GAPDH (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2">GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG</td>
			<td colspan="2">GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr><tr><td>ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2">TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Gerçek zamanlı PCR analizi için kullanılan primerlerin dizisi ile birlikte hedef genlerin listesi (PlasmoDB kimlik numarası).

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

One of the mechanisms for subverting the effect of drugs by&#160;the malaria parasite is through rewiring of its transcriptome. The effect is more ...

understanding-development-compensatory-pathways-mutant-malaria

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu röportajda, George Dimopoulos sivrisinekler tarafından Plasmodium falciparum ve dang virüs enfeksiyonları ile mücadele için kullanılan fizyolojik mekanizmaları üzerinde odaklanmaktadır. Açıklama ne kadar önemli refrakter genler için verilen, bu genlerin, vektör patojenlere karşı direnç göstermesini sağlayan sivrisinek tanımlanır ve bu bilgiyi nasıl sıtma paraziti veya dang virüs gerçekleştiremiyor transgenik sivrisinek oluşturmak için kullanılan olabilir.

Bina daha iyi Sivrisinek: Sıtma ve Dang Ateşi Direnç A. gambiae ve A. aegypti Sivrisinekler etkinleştirilmesi Genler belirlenmesi

Kemirgen sıtma parazitleri Genetik haçlar sivrisineklerin genetik olarak iki farklı parazitler besleyerek yapılmaktadır. Rekombinant döl sivrisinek enfekte farelerde ısırık izin sonra fare kandan klonlanmış. Bu video genetik haçlar üretmek nasıl...

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

İnsan mikroRNA'ları, konak eritrositlerinden Plasmodium falciparum parazitlerine yer değiştirir. Burada, sentetik mikroRNA'ları konakçı eritrositlere transfekte etmek ve tüm RNA'ları P. falciparum'dan izole etmek için kullanılan teknikler açıklanmaktadır.  Ek olarak, bu makale, parazit transkriptlerinin ribozomal doluluğunu ve translasyon potansiyelini belirlemek için P. falciparum'da bir polizom izolasyon yöntemini detaylandıracaktır.

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Biz glmSoluşturmak için bir yöntem tarif- Plasmodium falciparum CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak koşullu devirme mutantlar dayalı.

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve tamamlayıcı Split Lusiferaz assay dahil raf aile kinazları, hastalık ile ilgili mutantlar karakterize için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi sundu.

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

Burada sunulan, gözenek oluşturan toksinlerin neden olduğu bağlanma, sitotoksisite ve sinyalleşmeyi belirlemek için Leishmania majör promastigotlarını kullanan bir protokoldür. Streptolizin O ile bir kavram kanıtı sağlanır. Diğer toksinler, toksin direncinin yeni mekanizmalarını tanımlamak için L. major'da bulunan genetik mutantlardan yararlanmak için de kullanılabilir.

Leishmania major kullanarak Gözenek Oluşturan Toksinlerin Moleküler Mekanizmasını ve İşlevini Deşifre Etmek

Keşfedin sıtma parazitlerinde telafi edici yolları, temel protein kinazlarının hipomorfik alellerini CRISPR-Cas9 ile inceleyerek. Çift kinaz hedefleme, ilaç direncini önlemek için yeni tedavi stratejileri sunar.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Daha fazla video keşfet