Name: NMR 15N Proteinlerin Pikosaniye ve Nanosaniye Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Gevşeme Deneyleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin, NMR spektroskopisi ile proteinlerin pikosaniye ve nanosaniye ölçeğindeki yapısal dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem, kalıtsal olarak düzensiz proteinlerin esnekliğini ve moleküler işlevlerini anlamak için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Protein Dinamiği Çalışmasında NMR 15N Gevşeme ve hetNOE Deneyleri için Protokol

Bu protokol, Lakomek ve ark.69 ve Stief ve ark.70 tarafından NMR 15N gevşeme deneylerinin kurulumunu tanımlamıştır. Hassasiyeti artırılmış bir HSQC algılama şeması kullanarak NMR darbe dizilerine odaklandık. 15NR 1 ve R1ρ deneyleri, Stief ve ark.70 tarafından ayrıntılı olarak açıklandığı gibi uygulanmıştır ve hetNOE deneyi, Lakomek ve ark.69 tarafından tanımlanmıştır.
NMR gevşeme deneylerini kurarken, 15N R1ρ en kritik olanıdır, çünkü çok uzun bir maksimum gevşeme periyodu veya döndürme kilidinin çok yüksek bir RF genliği seçmek proba zarar verebilir. Gevşeme dönemi için, tam bozunma eğrisinin 0 yoğunluktan % yoğunluğa (referans deneyine kıyasla) eşit olarak örneklenmesi arzu edilir. Uzun 15NT 2 kez ile IDP'ler gibi yavaş gevşeyen proteinler için, proba güç birikiminin sınırlandırılması gerektiğinden, bozunma eğrisini tam olarak örneklemek genellikle uygun olmayacaktır.
15N radyo frekansı (RF) genliği için, teorik olarak, RF genliği ne kadar yüksekse, νspin-lock, o kadar iyidir, çünkü daha fazla değişim işlemi yeniden odaklanabilir. Genel bir kural olarak, 1 / (2π νspin-lock) 'dan daha yavaş değişim işlemlerine yeniden odaklanılabilir. Ancak, RF güç sınırlamaları geçerlidir. Örneğin, bizim elimizde, güvenli tarafta kalmak için 65 kHz'lik bir RF genliği uygulandığında maksimum 2 ms'lik bir döndürme-kilit süresini aşmayız. Aynı zamanda, 600 MHz'lik bir spektrometredeki spin-lock RF genliği 1 kHz'den daha yüksek olmalıdır, örneğin 600 MHz'de 1.4 kHz'dir, bu da küçük küresel protein gb369 için yeterli olduğu kanıtlanmıştır. Spektral genişlikleri kapsamak ve daha yüksek alan kuvvetlerinde rezonans dışı etkilerden kaçınmak için, karşılık gelen RF genliği manyetik alanla ölçeklenmelidir, örneğin 1.5 MHz'de 900 kat daha yüksek (νdöndürme kilidi<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67088/67088eq03.jpg" style="margin: auto;"> 2 kHz). Ancak, probun sınırlamaları içinde kalmalıdır. (Yerel spektrometre güç sınırlamaları listesine bakın ve tavsiye için NMR tesis yöneticinizle iletişime geçin.) 
Referans deney (kısa gecikme) ile en uzun gecikme süresi (yukarıda tartışılan faktörler tarafından belirlenir) arasındaki gevşeme gecikmelerinin aralığının seçimi için, gevşeme gecikmesi veri noktalarının eşit aralığını tercih ederiz ve 8 sayısını seçeriz (tahsis edilen ölçüm süresi ve sinyal-gürültü izin veriyorsa). İlk artışa (ve sonraki artışlara) en yoğun (ve genellikle en yavaş gevşetici) kalıntılar hakim olacaktır. Bu nedenle, proteinin dinamik aralığına bağlı olarak, protein dizisindeki birkaç kalıntının NMR sinyalleri, seçilen maksimum gevşeme periyodundan sonra zaten bozulmuş olabilir. Gecikme noktalarını eşit aralıklarla yerleştirerek, hızlı gevşeme kalıntılarının gevşeme eğrilerinin, gevşeme eğrisini örnekleyen yeterli sayıda veri noktası tarafından da kapsanmasını sağlıyoruz.
Ayrıca, doğru gevşeme verileri elde etmek ve probda uzun vadeli hasarı önlemek için iyi bir kurtarma gecikmesi seçimi çok önemlidir. Probun herhangi bir hasar görmesini önlemek için en az D1 = 2 s'lik bir kurtarma gecikmesi seçiyoruz. Doğru sonuçlar için, protein 1H ve 15N uzunlamasına polarizasyona da dengeye veya en azından kararlı, kararlı bir duruma dönmesi için yeterli zaman verilmelidir. 1H T1 genellikle küçük veya orta büyüklükte bir protein için (20 kDa'ya kadar) 600 MHz'de 1 s ile 4 s arasında değişir; daha büyük proteinler ve daha yüksek alanlar için 1H T1 daha da artacaktır. Küçük küresel protein gb3 için, 15N R1 ve R1ρ deneyleri için D1 = 3.5 s'yi yeterli bulduk. Bu protokolde sunulan küçük IDP Syb-2 için, yakın zamanda D1 = 2 s'ninyeterli 70 olduğunu gösterdik.
15N hetNOE en düşük hassasiyete sahiptir, çünkü uyarma 15N'de başlar ve nabız dizisinin başlangıcında 1 H-15N BECERIKLİ uygulanmaz. Ayrıca, doğru verileri elde etmek için 1H doygunluk süresi ve 15N geri kazanım gecikmesi 5 kez 15N T1 olmalıdır. Burada sunulan IDP Syb-2 için 5 sn doyma/geri kazanım gecikmesi artı fazladan 2 sn D1 geri kazanım gecikmesi (toplam 7 sn) yeterliyken, daha büyük proteinler ve/veya döteryumlu proteinler için bu süre önemli ölçüde daha uzun, örneğin 10 sn veya daha uzun olabilir. Bununla birlikte, nitel veriler yeterince iyiyse, hafif bir sistematik sapma kabul edilebilir. Bu durumda, doygunluğun% 95'i elde edileceğinden, 3 kez 15N T1'de makul sonuçlar elde edilebilir. Bu durumda, ortaya çıkan hetNOE değerleri, daha yüksek değerlere sistematik bir sapma gösterecektir.
Bu protokolde, en uygun maliyetli olan tam protonlanmış 15N Syb-2 ile çalıştık. Gevşeme yollarının sayısını azaltmak ve en izole edilmiş 1 H-15N omurga amid spin çiftleri ile çalışmak için yan zincir döterasyonu önerilir. Bununla birlikte, 15N2H Syb-2 ve 15N Syb-2 karşılaştırıldığında, döteryumlu ve tamamen protonlanmış numuneler arasında çok az fark görüyoruz70. Pratik amaçlar için, NMR gevşeme verileri sıklıkla çift veya üçlü etiketli numunelere (15N13C veya 2H15N13C) kaydedilir. Tartışılan NMR darbe dizileri, 13C ile 1H veya 15N çekirdek arasındaki J birleştirme evrimini yeniden odaklama yeteneğine sahiptir. Açıkçası, 13C etiketlemesi getirildiğinde gevşeme yolları da artacaktır. Bununla birlikte, bizim elimizde, pratik amaçlar için, ortaya çıkan hata, eğer varsa, %5'ten azdır ve yalnızca nitel verilere ihtiyaç duyulduğunda kabul edilebilir olabilir.
Tespit için farklı boyutlardaki proteinlerle çalışırken, sıklıkla duyarlılığı artırılmış HSQC ile tespit edilen deneylerin70 veya TROSY ile tespit edilen deneylerin69 seçilip seçilmeyeceği sorusu vardır. Küçük proteinler için, duyarlılığı arttırılmış HSQC ile tespit edilen NMR deneyleri, sinyal-gürültüde iki kat kazanç sunar (iyi su bastırma elde edilebilmesi şartıyla). Daha büyük proteinler için, TROSY tarafından tespit edilen deneyler kazanacak. Katlanmış proteinler için başabaş noktası kabaca 20 kDa'dır. Artan zincir uzunlukları ile kabaca doğrusal olarak artan düşükR2 hız sabitlerinin elde edilebildiği IDP'ler için, başabaş noktası daha yüksek moleküler ağırlıklara kaydırılabilir. Pratik amaçlar için, şüpheye düştüğünüzde hem hassasiyeti artırılmış HSQC tarafından tespit edilen hem de TROSY tarafından tespit edilen deneyleri uygulamanızı öneririz. Ardından, ilk artışta en iyi sinyal-gürültü sinyalini vereni seçin.
Duyarlılığı artırılmış HSQC ile tespit edilen deneylerin mi yoksa TROSY ile tespit edilen deneylerin mi seçileceği tartışması, yalnızca sinyal-gürültü ana kriter olduğunda geçerlidir. En küçük çizgi genişlikleri ve en yüksek çözünürlük gerektiğinde, TROSY her zaman kazanacaktır. TROSY ayrıca her zaman en iyi su bastırmayı sunar, çünkü daha az proton darbesi ve proton ayrışması gerekmez. Daha geniş bir tartışma için daha önce yayınlanan69 . makaleye atıfta bulunuyoruz.
Su bastırma konusunda bir açıklama daha. Bruker Avance NEO konsollarında alıcı kazancının (rg) 16'ya ayarlanması yeterli olabilirken, (eski) Bruker Avance konsolları için genellikle 128-256 aralığında bir alıcı kazancı arzu edilir. Ulaşılabilir rg (Bruker komutu rga tarafından belirlenir) genellikle artık su sinyalinin yoğunluğundan gürültü seviyesine kadar elde edilir. Kötü bir su bastırma, spektrumlarda her zaman ek gürültüye neden olur. Bu nedenle, bir Bruker Avance NEO konsolunda bir rg = 16 elde edilebilse bile, kalan su sinyali gürültü seviyesine önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu nedenle, sinyal-gürültü oranı azalacaktır. Sonuç olarak, 128-256 rg seviyesini hedeflemenizi öneririz. Sunulan darbe dizileri70 , 600 MHz ve 1200 MHz'de test edilmiştir. Her iki alan kuvveti de darbe dizisinde yazıldığı gibi aynı gradyan kurulumuyla çalışır. Bunları en azından daha fazla optimizasyon için iyi bir başlangıç noktası olarak öneriyoruz.
Giriş bölümünde belirtildiği gibi, tartışılan NMR gevşeme deneyleri yalnızca pikosaniye ila nanosaniye zaman aralığını kapsar. Mikrosaniye ila milisaniye dinamikleri hakkında bilgi edinmek için, gevşeme dağılım deneylerine, CPMG deneylerine ve değişen spin-lock genlikleri (veya taşıyıcı frekansları) ile R1ρ deneylerinin bir uzantısına atıfta bulunuyoruz 44,46,58,59,60,61,85,86 . Mikrosaniyelerden daha yavaş dinamikler yakalanabilir 15N CEST (Kimyasal değişim doygunluk transferi) NMR62, değişim spektroskopisi (EXSY, milisaniye ila saniye) veya RT (Gerçek zamanlı) NMR (saniye ila saat)63,64. Paramanyetik probların yanı sıra artık dipolar kuplajların (RDC'ler) PRE (paramanyetik gevşeme geliştirme) etkisi, ps ila msdinamikleri 65,66,67,68 arasındaki tüm aralığı değerlendirmek için kullanılabilir.
Tüm bu deneyler sadece omurga dinamiklerini kapsar. Yan zincir dinamiklerini araştırmak için Kay ve meslektaşları, 1 MDa 2,87'ye kadar olan proteinler için yan zincir dinamikleri hakkında bilgi sağlayan çok sayıda NMR deneyi başlattılar.
Protein omurga dinamikleri hakkında daha nicel bilgiler elde etmek için, üç NMR parametresinin, 15NR1,R2 ve hetNOE'nin birleşik bir analizi gereklidir - bazen çapraz ilişkili gevşeme hızı sabitleri gibi daha da ileri parametreleri içerir. Farklı sofistike analiz yöntemleri geliştirilmiştir. Modelsiz yaklaşım olarak adlandırılan yaklaşım, biyomoleküler NMR 43,88,89,90,91'de yaygın olarak uygulanmıştır. Ayrıca, spektral yoğunluk haritalaması değerli bilgiler sağlayabilir 55,92,93. Bunlar, iyi tanımlanmış rotasyonel korelasyon süresine sahip küresel proteinler için güçlü analiz yöntemleri olsa da, uygulanabilirlikleri IDP'ler için sınırlıdır. Dönme korelasyon süresini tanımlamak için katlanmış bir alan gereklidir39. Korelasyon fonksiyonu C(t), ilgili farklı zaman ölçeklerinin iyi bir şekilde ayrılabilmesi durumunda, üstel olarak azalan fonksiyonların toplamı ile modellenebildiğinde, bu kısmen atlatılabilir 23,31,84. İyi tanımlanmış bir dönme korelasyon süresinin yokluğunda, korelasyon sürelerinin dağılımını içeren alternatif yaklaşımlar, örneğin IMPACT analizi94 veya DETECTOR analizi95,96 bir alternatiftir. Ayrıca, NMR gevşeme verilerinin ve MD simülasyonlarının birleşik bir analizi de IDP'ler97 için umut vericidir; şu anda, daha büyük IDP'lerin tam atom simülasyonları için hala örnekleme ve kuvvet alanı sınırlamalarıyla karşı karşıyayız31,98.

<table><tbody><tr><td>Bruker 600 MHz AVANCE III HD spektrometre&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html</td><td>NMR deneyleri yapıldı&nbsp;</td></tr></tbody></table>

nmr 15n proteinlerin pikosaniye ve nanosaniye yapısal dinamiğinin İncelenmesi için gevşeme deneyleri

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

Aşağıda, sıklıkla VAMP2 (vezikül ile ilişkili protein 2) olarak adlandırılan veziküler SNARE proteini Synaptobrevin-2 (1-96) üzerinde kaydedilen bazı örnek NMR gevşeme verileri gösterilmektedir. NMR verilerini kaydetmek için, 150 mM NaCl, 0.1 mM TCEP ve 1 mM EDTA içeren 50 mM MES (pH 6.0) tamponunda 171 μM 15N Sinaptobrevin-2 (1-96) örneği (aşağıda Syb-2 olarak adlandırılmıştır) kullandık. Tüm deneysel veriler, 3 mm'lik bir NMR numune tüpüne doldurulmuş 250 μL'lik bir hacim kullanılarak 278.15 K'da kaydedildi. Deneyler, Bruker 5 mm QCI 1H, 15N, 13C, 31P dörtlü rezonans kriyoprob ile donatılmış bir Bruker 600 MHz AVANCE III HD spektrometresinde gerçekleştirildi.
Şekil 3, NMR gevşeme deneylerinden elde edilen NMR gevşeme eğrilerine takılan kalıntıya özgü 15NR 1 ve R2 gevşeme hızı sabitlerini göstermektedir. Y ekseninde, ilgili gevşeme hızı sabitleri, protein dizisi boyunca (x ekseninde) bireysel kalıntılar için çizilir. Ayrıca, 1 H-15N heteronükleer NMR ölçümünün doymuş ve doymamış (referans) deneylerinin yoğunluk oranlarından çıkarılan 1 H-15N heteronükleer NOE değerleri (hetNOE) gösterilmiştir.
Heteronükleer NOE verileri ve 15N R2 hız sabitleri, 15N R1 verilerinden daha kolay yorumlanır. Bu nedenle, onlarla başlayacağız.
Heteronükleer NOE: Heteronükleer {1H}-15N NOE, hızlı pikosaniye zaman ölçeğindeki iç dinamiklere (çapraz gevşeme bağımlılığı nedeniyle &lt;100 ps) ve aynı zamanda ps - ns dinamiklerine (R1 bağımlılığı nedeniyle) duyarlıdır ve katlanmış proteinler için genellikle 0 ile (1'den biraz daha az) arasında değerler alabilir. Daha yüksek alanlarda sistematik olarak daha yüksek olacaklardır (ancak her zaman 1'den düşük).
Proteinin iç esnekliğini tanımlarlar. Aynı alan kuvvetlerindeki hetNOE değerleri karşılaştırıldığında, şu tutar: {1H}-15N NOE ne kadar küçükse, ilgili kalıntı o kadar dinamik olur. IDP'ler için, tipik olarak küçük kalıntıya özgü {1H}-15N NOE, örneğin 0,5 mertebesinde ve 600 MHz'de daha küçük gözlenir. Bununla birlikte, negatif {1H}-15N NOE, 500 MHz'de -2'ye kadar bile IDP'ler için bulunur. Monomerik Syb-2 için, {1H}-15N NOE, N-terminali için -0.5 ile C-terminal bağlayıcı alanı için 0.5 arasında 600 MHz aralığında ölçülmüştür. Değerler N-'den C-terminaline kademeli olarak artar, bu da kademeli olarak azalan bir esneklik/artan rijitliği gösterir (Şekil 3C).
15N R2 hız sabiti 15N R2 hız sabitleri, proteinin genel yuvarlanması, peptit düzlemlerinin hareketi ve omurga dihedral açılarının burulması ile NH bağ vektör oryantasyonunu modüle eden ps - ns dinamiklerine duyarlıdır. {1H}-15N NOE değerlerinden ve R1'den farklı olarak, 15NR2 hız sabitlerine, proteinin genel (rotasyonel) yuvarlanması ile ilişkili J (0) spektral yoğunluğu hakimdir. Bu nedenle, küresel katlanmış proteinler için, 15NR2 hız sabitleri, proteinin genel yuvarlanmasına ve boyutuna göre boyut olarak ölçeklendirilir. Gerçek IDP'ler için küresel rotasyonel korelasyon süresi atanamaz. Yine de, polimerler için beklendiği gibi, zincir uzunluğuna bağlı bir yavaş korelasyon süresi84 takılabilir, ancak kalıntıya özgü iç dinamikler, 15NR2 hız sabitleri üzerinde daha büyük bir etkiye sahiptir. Aynı protein içinde, 15NR2 hız sabitleri, farklı iç kalıntıya özgü hareketliliğe sahip yapıların yapılandırılmamış bölgelere karşı ayrımına izin verir. Gözlemlenen 15NR2 hız sabiti ne kadar küçükse, ilgili kalıntı o kadar hareketlidir. Yüksek 15N R2 hız sabitleri, α sarmallar veya β iplikçikler gibi ikincil yapı elemanlarının karakteristiğidir. DüşükR2 gevşeme hızı sabitleri, döngü ve içsel olarak düzensiz bölgelerin karakteristiğidir. Monomerik Syb-2 (1-96) için, içsel olarak düzensiz karakteriyle tutarlı olarak genel olarak düşük 15NR2 oran sabitlerini gözlemliyoruz. İç rijitlik, esnek C-terminaline gitmeden önce N-terminalinden C-terminal bağlayıcı alanına kadar artar (hareketlilik azalır) (Şekil 3B).
15N R1 hız sabiti R1 gevşeme oranları, pikosaniye (ps) ve daha hızlı nanosaniye (ns) dinamiklerine duyarlıdır. Bununla birlikte, iç dinamikleri doğrudan yorumlamaları öncekilerden daha karmaşıktır. T1, dönme korelasyonu τR'nin bir fonksiyonu olarak çizildiğinde minimum(maksimum) bir T1 (R 1) alanı vardır: τ R'de T1dk, min = 1/ ω. τ R &lt; τR, min olan hızlı yuvarlanan moleküller için, örneğin küçük moleküller veya küçük küresel proteinler için, daha düşük R1 hız sabitleri, artmış protein omurga dinamiklerini gösterir (R2 ile aynı). Daha büyük proteinler söz konusu olduğunda, τR &gt; τR, min ile, bunun tersidir ve daha yüksekR1 gevşeme oranı sabitleri, artan dinamikleri temsil eder (R2'nin tersi).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67088/67088fig03.jpg"> Şekil 3: NMR gevşeme verileri. Veriler, yukarıda açıklanan protokol ve iş akışı izlenerek kaydedildi ve değerlendirildi. (A) Syb2'nin (1-96) protein omurgası boyunca kalıntıya özgü 15N R1 gevşeme oranı sabitleri. (B) Formül (1) kullanılarak R1ρ ve R1 verilerinden hesaplanan 15NR 2 gevşeme hızı sabiti. (C) Syb2'nin omurgası boyunca hetNOE transfer hızları (1-96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/67088fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: NMR parametrelerinin okunması. Macro rpar arayüzü görüntülenir. (A) Tüm parametre setlerine genel bakış. Kırmızı kutu arama çubuğunu işaretler. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. Bir parametre kümesi seçmek için DoubleClick tuşuna basın. (B) Mevcut deneye aktarılabilecek parametrelere genel bakış. Getprosol'u çalıştırma veya mevcut deneyin belirli parametrelerini koruma seçenekleri kırmızı kutularla işaretlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: Optimum su bastırma için 1H taşıyıcı frekansının konumlandırılması. Makro gs arayüzü görüntülenir. Deney döngüye girerken, deneyin farklı parametrelerini değiştirmek mümkündür. İşaretleyici, edinme sırasında seçilen parametreyi değiştirmek için burada kullanılabilir. İşaretçinin üzerine tıklamak, parametreyi "hassasiyet" altında belirtilen değere yükseltir. Hassasiyet anahtarı, işaretleyicinin adım boyutunu ayarlamak için kullanılabilir. Sağ tarafta, canlı FID görünür. O1'in kalibrasyonu için amaç, FID'ye genellikle su sinyalinin hakim olması nedeniyle kırmızı bir kutu ile işaretlenmiş FID alanını en aza indirmektir. FID alanının azaltılması, azaltılmış su sinyali ve iyileştirilmiş su bastırma ile el ele gider. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 3: 1 H-15N HSQC darbe dizisine ve edinim parametrelerine daha yakından bir bakış. (A) 1 H-15N HSQC deneyinin darbe dizisi parametreleri HSQCFPF3GPPHWG. B'de nabız programı düzenleyici penceresini açmak için "E"ye tıklayın. (B) 1 H-15N HSQC deneyinin nabız programı düzenleyicisi HSQCFPF3GPPHWG. 15N 90° darbeli yorumlanan çizgi (satır 91), 1 H-15N HSQC deneyi için orijinal çizgiyi gösterir. 92. satırda, 15N 90° darbe, 15N 180° darbeye değiştirilir. Bu değişiklik, 1 H-15N HSQC deneyini 90 ° 15N sert darbe kalibrasyonu için bir kalibrasyon darbe programı haline getirir. Darbe dizilerini düzenlemek için, önce diziyi yeni bir adla kaydedin. Aşağıdaki iş akışını kullanın: Dosya'yı tıklatın, Farklı kaydet'i tıklatın, yeni adı girin, Tamam'ı tıklatın ve PULPROG'u veri kümesine ayarla'yı tıklatın. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 4: Degradelerin ayarlanması. Degrade şekilleri, uzunlukları ve güçleri değiştirmek için gpnam makrosunun arayüzü gösterilir. Kullanılan darbe dizisi parametre arayüzünü açmak için tüm gradyan şekilleri GPNAM girilmelidir. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 5: Gevşeme gecikmelerinin ayarlanması. Vplist makrosunun arayüzü (vclist makrosu ile aynı). (A) Bir vplist seçmek için arayüz. Üç noktaya tıkladığınızda B arayüzü açılır. (B) DoubleClick ile bir vplist seçmek veya Dosya ve Yeni'ye tıklayarak yeni bir liste oluşturmak için arayüz. (C) Arayüz, yeni bir liste oluşturarak veya mevcut bir listeyi düzenleyerek açılır. Liste, Dosya ve Kaydet'e tıklanarak kaydedilebilir. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 6: 15N R1ρ deneyinin darbe dizisi parametreleri. (M.S.) Protokolde değiştirilmesi gereken tüm temel parametreler kırmızı kutular ve ilgili adımlarla işaretlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%206.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 7: Shapetool makrosunun arayüzü. Bir I-BURP2 (deneylerde kullanılır) bir şekil darbesi olarak açılır. (A) Seçilen şekil darbesinin parametreleri. Kırmızı kutu ile işaretlenmiş NMR Simülasyonunu Başlat düğmesine tıklandığında, Şekillendirilmiş darbe uzunluğu [μs] (= 2000 μs) ve Dönüş açısı [°] (= 180°) simülasyon parametreleri ile Simülasyon parametre pencereleri açılır. NMR-SIM'i Başlat düğmesine tıklamak, I-BURP2 darbesinin ters çevirme bant genişliğini gösteren (B) simülasyon penceresini açar. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%207.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 8: calcpowlev makrosunun arayüzü. (A) Gücü hesaplanacak olan darbenin darbe uzunluğu için giriş penceresi. (B) Referans darbesinin giriş penceresi (çoğunlukla 90° sert darbe). (C) Sonuç penceresi, yeni darbe uzunluğuna sahip bir darbe ile referans darbe uzunluğuna sahip bir darbe arasındaki dB cinsinden darbe gücü farkını gösterir. Dikkat: Bu fark, yalnızca her iki darbe uzunluğu da şekil ve dönüş açısı ile ilgili olarak aynı darbeye karşılık geliyorsa geçerlidir. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%208.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 9: NMR spektrum işleme: NMRPipe dönüştürme aracının arayüzü. Parametreleri Oku'ya tıklamak, denemenin parametrelerini otomatik olarak okur. Dönüşüm komut dosyası sağ tarafta gösterilir. Tüm parametreler ayrı ayrı ayarlanabilir. Clear Script'i kullanarak parametreleri değiştirdikten sonra,Script'in Güncellenmesi önerilir. Komut dosyasını sağda gösterildiği gibi fid.com altında kaydetmek için Komut Dosyasını Kaydet'e tıklayın. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%209.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 10: Spektral işleme için nmrproc.com dosyası. NMRPipe biçimindeki ham verileri işlemek için nmrproc.com dosyasında kullanılan kod gösterilir. tauValues girişi ve idxExpmt girişi işlenmeden önce ayarlanmalıdır. tauValues, 15N R1ρ deneyi için ms cinsinden vplist girişlerine karşılık gelir (vclist girişleri, 15N R1 deneyi için ms cinsinden yeniden hesaplanır). Gevşeme gecikme uzunlukları ile ilgili olarak, idxExpmt girişleri, vplist girişlerinin sırasına karşılık gelir (15N R1 deneyi için vclist girişleri). Komut dosyasında, spektrumun fazını değiştirecek pozisyonlar kırmızı kutularla işaretlenmiştir. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2010.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 11: NMR spektrum gösterimi ve tepe toplama. Açık spektrumlu nmrDraw'a genel bir bakış gösterilmektedir. Kontur seviyesindeki bir değişiklikle birlikte gelen Faktörü değiştirmek için + ve - işaretlerini kullanın. Z boyutunun değiştirilmesi, farklı gevşeme gecikmeleri ile HSQC deneyi arasında geçişe izin verir. Spektrumu değiştirilen parametrelerle yeniden çizmek için Çizim'i kullanın. P0 kaydırıcısı ve P1 kaydırıcısı, spektrumun fazında değişikliklere izin verir. Bu faz değişiklikleri işlenen verilere kaydedilmeyecektir; Faz değişikliği nmrproc.com dosyasına manuel olarak girilmeli ve nmrproc.com dosyası tekrar çalıştırılmalıdır. Tepe Algılama makrosu, ayarlanan kontur seviyesinde spektrum tepe noktalarının seçilmesine izin verir. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2011.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 12: NMRDraw ile yarı otomatik NMR tepe ataması. ass.com dosyasının kodu gösterilir ve NMR sinyal atamasını başlatmak için yürütülmesi gerekir. -assName'i oluşturulan ilgi alanının en üst listesine değiştirin. Bu tepe listesi, ekteki tepe listesiyle aynı formatta olmalıdır ass.syb2.hn_1200.tab klasöründeki peaklist (https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences adresinden indirilen zip klasöründe). Kırmızı sayı, protokoldeki ilgili adımı ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2012.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 13: Görsel NMR tepe noktası ve atama denetimi. Atama makrosunun Arayüzü, ass.com yürütülerek açılır. Tepe noktaları atamak için farenin sol düğmesini ve tepe noktalarının atamasını kaldırmak için sağ fare düğmesini kullanın. Aşağıdaki amino aside gitmek için İleri'yi ve önceki amino aside gitmek için Prev'i kullanın. + ve - ile, kontur seviyesi, spektrumu yeniden çizen Draw kullanılarak değiştirilebilir. İş akışını kullanma: Çık, Kaydet ve Çık seçenekleri atamayı kaydeder ve programı sonlandırır. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2013.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 14: R1ρ ve R 1verilerinden 15NR 2 hız sabitlerinin çıkarılması. Aşama 1. t1rho.tab dosyasının içeriği gösterilir. R1ρ oranlarından R2 oranlarını hesaplamadan önce kırmızı kutu ile işaretlenmiş bir kod eklenmelidir. Kırmızı sayı, protokoldeki ilgili adımı ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2014.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 15: R1ρ ve R 1 verilerinden 15NR 2 hız sabitlerinin çıkarılması. Adım 2. crtR1p.tcl dosyasının içeriği gösterilir. Yürütmeden önce, kırmızı kutudaki girişler protokolde açıklandığı gibi değiştirilmelidir. Kırmızı sayılar, protokoldeki ilgili adımları ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Figure%2015.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

NMR 15N Proteinlerin Pikosaniye ve Nanosaniye Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Gevşeme Deneyleri

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

nmr-15n-relaxation-experiments-for-investigation-picosecond-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada 15 Ngevşeme dispersiyon profillerinin çözelti NMR spektroskopisi ile edinilmesi ve analizi için laboratuvarda uygulanan protokolün detaylı bir açıklaması sağlanmaktadır.

15 μs-ms Zaman Ölçeğinde Protein Konformasyonsal Dinamiklerinin Araştırılması için N CPMG Gevşeme Dağılımı

TIRF mikroskobu ile büyük verici-alıcı ağlardan smFRET verilerini elde etmek için kurulum ve deneysel prosedürü sunuyoruz. Bu ölçümlerin Bayes çıkarım yazılımı Fast-NPS ile adım adım analizi, uyarlanmış boya modellerinin uygulanması yoluyla yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler verir.

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Büyük sarmal bobin alanlarının karakterizasyonuna ve kristalizasyonuna rehberlik etmek için basit biyokimyasal ve hesaplamalı analizi içeren bir çerçeve tanımlıyoruz. Bu çerçeve, küresel proteinler için uyarlanabilir veya çeşitli yüksek verimli teknikleri içerecek şekilde genişletilebilir.

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

13C,15N etiketli mantar ve bitki örnekleri çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi ve dinamik nükleer polarizasyon (DNP) araştırmalar için hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

Bu protokol, proteinleri ve kompleksleri çözelti mutlak karakterize etmek için çok açılı ışık saçılma (SEC-,) ile boyut dışlama Kromatografi kombinasyonu açıklar. SEC-, saf proteinler, yerli oligomerler, heterokompleksleri ve glikoproteinler gibi değiştirilmiş proteinlerin molekül ağırlığını ve boyutunu belirler.

Boyutlar-dışlama kromatografi ile çok açılı ışık saçılmasına bağlı proteinlerin karakterizasyonu (SEC-,)

Bu protokolün amacı, EGFR kinazproteininin aktive mutasyonları nedeniyle meydana gelen dinamik yapısal değişiklikleri incelemek için moleküler dinamik simülasyonları kullanmaktır.

EGFR Somatik Mutasyonları Moleküler Dinamik Simülasyonu ile Aktive Etmenin Yapısal Etkilerinin Deşifre Edilmesi

Bu protokol, taramalı elektron mikroskopisi kullanılarak endosperm ve nişaste granül morfolojisinin analizi için tahıl tohumlarının enine bölümlerinin (örneğin pirinç) hazırlanmasına izin verir.

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

gP2S, cryoEM deneylerinin izlenmesi için bir web uygulamasıdır. Ana özellikleri, uygulamayı yüklemek ve yapılandırmak için gereken adımlar gibi açıklanmıştır. Yapılandırıldıktan sonra, uygulama negatif leke ve cryoEM denemeleriyle ilişkili meta verileri doğru bir şekilde kaydetmeye izin verir.

gP2S, CryoEM Deneyleri için Bir Bilgi Yönetim Sistemi

13 C/ 15 Netiketli ve etiketsiz RNA'da mikro-milisaniye dinamikleri1H R1φ  gevşeme dağılımı nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ile ölçmek için bir protokol sunuyoruz.  Bu protokolün odak noktası, NMR deneylerinin yüksek saflıkta numune hazırlanması ve kurulumunda yatmaktadır.

RNA'nın 1 H R1φ Gevşeme Dispersiyon Deneylerinin Numune Hazırlama ve Kurulumunun Pratik Yönleri

Öğrenin, NMR spektroskopisi ile proteinlerin pikosaniye ve nanosaniye ölçeğindeki yapısal dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem, kalıtsal olarak düzensiz proteinlerin esnekliğini ve moleküler işlevlerini anlamak için güçlü bir araçtır.

NMR ¹⁵N Proteinlerin Pikosaniye ve Nanosaniye Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Gevşeme Deneyleri

Daha fazla video keşfet