Name: Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Öğrenin kemirgen kalp dokusundan sağlam mitokondri izolasyon yöntemini. Yüksek çözünürlüklü respirometri ve solunum kontrol oranları ile kalite değerlendirmesi yaparak hastalık mekanizmalarını araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Yüksek Kaliteli Biyoenerjetik Çalışmalar için Kemirgenlerden Mitokondriyal İzolasyon

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li>
<li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation%3A+Ii.+Experimental+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li>
<li>Ernster, L., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: A historical review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li>
<li>Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+tca+cycle+metabolites+control+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 102(2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation%2C+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+metabolism%3A+Glycolysis%2C+the+TCA+cycle+and+mitochondrial+electron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).</li>
<li>Kalpage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+C+phosphorylation%3A+Control+of+mitochondrial+electron+transport+chain+flux+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).</li>
<li>Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).</li>
<li>Mitchell, P., Moyle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiosmotic+hypothesis+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation.</a> Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+I.+Kinetics+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization.</a> J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).</li>
<li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+heart+disease%3A+Critical+appraisal+of+an+overlooked+association%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association.</a> Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).</li>
<li>Zhou, B., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+pathophysiology+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure.</a> J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).</li>
<li>Holzem, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+not+different+between+nonfailing+donor+and+end-stage+failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts.</a> FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).</li>
<li>Cordero-Reyes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshly+isolated+mitochondria+from+failing+human+hearts+exhibit+preserved+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function.</a> J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).</li>
<li>Norat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurological+disorders%3A+Exploring+mitochondrial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation.</a> NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).</li>
<li>Diaz-Vegas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+mitochondrial+dysfunction+a+common+root+of+noncommunicable+chronic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases.</a> Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+subsarcolemmal+and+interfibrillar+mitochondria+display+distinct+responsiveness+to+protection+by+diazoxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide.</a> PLoS One. 7 (9), e44667(2012).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+Functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Micakovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pure+mitochondria+from+rat+kidneys+and+western+blot+of+mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Hubbard, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionated+mitochondrial+magnetic+separation+for+isolation+of+synaptic+mitochondria+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue.</a> Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+mitochondrial+isolation+and+sub-cellular+localization+assay+for+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).</li>
<li>Hernandez-Camacho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+mouse+skeletal+muscle+for+respirometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays.</a> J Vis Exp. (180), e63336(2022).</li>
<li>Farrugia, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+and+parallel+isolation+of+myocytes+and+non-myocytes+from+multiple+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).</li>
<li>Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+respiration+buffer+composition+on+mitochondrial+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function.</a> PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).</li>
<li>Vinnakota, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-loop+control+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+and+cardiac+muscle+mitochondria+by+ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2).</a> Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).</li>
<li>Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+and+time+hierarchy+of+oxidative+phosphorylation+in+cardiac+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria.</a> Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).</li>
<li>Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarnock%2C+LB+%22Statpearls%22">Statpearls</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).</li>
<li>Sercel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+stable+isolated+mitochondrial+recipient+clones+in+mammalian+cells+using+mitopunch+mitochondrial+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> J Vis Exp. (97), e52076(2015).</li>
<li>Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+bubble+contact+with+endothelial+cells+causes+a+calcium-independent+loss+in+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential.</a> PLoS One. 7 (10), e47254(2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+of+citrate+synthase+activity+in+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (155), e59454(2020).</li>
<li>Tomar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-dependent+differential+regulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+the+heart+and+kidney+cortex+and+outer+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).</li>
<li>Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+affinity+for+ADP+is+twofold+lower+in+creatine+kinase+knock-out+muscles.+Possible+role+in+rescuing+cellular+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis.</a> FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).</li>
<li>Gouspillou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+the+oxidative+phosphorylation+affinity+for+ADP+in+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (6), e20709(2011).</li>
<li>Strubbe-Rivera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+phenomenon+elucidated+by+cryo-em+reveals+the+genuine+impact+of+calcium+overload+on+mitochondrial+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function.</a> Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functions+of+cytochrome+C+in+cell+death+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease.</a> Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+bcl-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members.</a> Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).</li>
<li>Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+network+control+of+oxidative+phosphorylation%3A+Multiple+roles+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate.</a> J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).</li>
<li>Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glycolysis+and+mitochondrial+function+in+endothelial+cells+using+the+seahorse+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer.</a> Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).</li>
<li>Huerta, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+lamprey+cardiac+mitochondrial+bioenergetics+after+exposure+to+TFM+and+its+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites.</a> Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).</li>
<li>Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+precipitation+inhibits+mitochondrial+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism.</a> PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL cam beher</td><td></td><td></td><td>Organ diseksiyonu ve kıyma için</td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>Adenozin 5'-difosfat monopotasyum tuzu dihidrat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5285</td><td>Respirometri tahlilleri</td></tr><tr><td>BSA Protein Test Kiti</td><td>Termo Kantifik</td><td>PI23225</td><td>Mitokondriyal protein miktar tayini</td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>DX0145</td><td>Tampon (CB) için</td></tr> <tr><td>Etilen glikol-bis (2-amino-etileter) -N, N, N ', n'-tetraasetik asit&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E4378</td><td>Tamponlar (CB ve IB) ve respirometri deneyleri için</td></tr><tr><td>Cam kanül</td><td>Radnoti</td><td></td><td>Kobay ve sıçan kalbi perfüzyonu</td></tr><tr><td>Heparin sodyum domuz mukozası</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>SRE0027-250KU</td><td>Hayvan IP enjeksiyonu</td></tr><tr><td>Yüksek çözünürlüklü respirometre</td><td></td><td></td><td>Clark tipi elektrot; 2 mL odacıklı oksigraf</td></tr><tr><td>İndüksiyon odası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>792632</td><td>Anestezi&nbsp;</td></tr><tr><td>L-malik asit</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>02288-50G</td><td>Respirometri tahlilleri</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür heksahidrat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M9272</td><td>Tampon (RB)</td></tr> <tr><td>Mannitol</td><td>Sigma için&nbsp;</td><td>MX0214</td><td>Tampon (IB) Mikrolitre</td></tr> <tr><td>şırıngalar</td><td></td><td></td> için <td>5 & ndash arasında değişen boyutlar; 50 ve mikro; L</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td></td><td></td><td>37 ° C'de inkübe edebilmelidir; C&nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>475898</td><td>Tüm tamponlar için</td></tr><tr><td>O2 tankı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMNI THQ Homojenizatör</td><td>OMNI International&nbsp;</td><td>12-500</td><td>Benzer rotorlu stator homojenizatörler çalışacak</td></tr><tr><td>pipetler Hacimler</td><td></td><td></td><td>&nbsp; 2&ndash; 20 ve mikro; L; 20&ndash; 200 ve mikro; L; 200&ndash; 1000 ve mikro; L</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P3911</td><td>Tamponlar için (RB ve CB)</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496</td><td>Tamponlar için (IB ve RB)</td></tr> <tr><td>Bacillus licheniformis Sigma'dan proteaz</td><td>&nbsp;</td><td>P5459</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S9888</td><td>Tampon (CB)</td></tr> <tr><td>Sodyum piruvat</td><td>için Fisher biyoreaktifleri</td><td>BP356-100</td><td>Respirometri tahlilleri</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8510-OP</td><td>Tampon (IB)</td></tr> <tr><td>için Cerrahi diseksiyon kiti</td><td></td><td></td><td>Hayvan ve doku kaynağına bağlıdır</td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj</td><td></td><td></td><td>4 dereceye kadar soğumalıdır; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kemirgen kalp dokusundan sağlam mitokondriyal İzolasyon 

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Mitokondriyal izolasyonun tamamlanmasının ardından, izolatların kalitesi ve işlevselliği, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak oksijen tüketim oranlarının (JO2) ölçülmesi yoluyla test edilmelidir. Bunu yapmak için, mitokondriyal stoklar, izole kardiyak mitokondri kullanılarak yapılan tüm respirometri testleri için 2 mL RB'de 0.1 mg / mL'lik çalışma konsantrasyonlarına izin vermek için 40 mg / mL'ye seyreltildi. Solunum, bir kalsiyum şelatörü olan 1 mM EGTA varlığında 5 mM sodyum piruvat ve 1 mM L-malat ile beslendi ve Durum 2 solunumu oluşturmak için 5 dakika dengelenmesine izin verildi. Bu durum sırasında, oksijen tüketim oranları ortalama 45-55 pmol/mL/s veya 27-33 nmol/mg/dk olmalıdır. Elektroda bağlı oksijen tüketim oranının farkında olun ve gerektiğinde uygun arka plan düzeltmelerini yapın. Oksidatif fosforilasyon (Durum 3), 5 μM ADP'lik bir bolus ile 5 dakika işaretinde başlatılır. Alt tabaka eklemeleri ve temsili izleme Şekil 1'de detaylandırılmıştır. Fonksiyonel mitokondri, Şekil 2'de gösterildiği gibi, doku kaynağına göre değişen ADP'nin eklenmesinden sonra JO2'de ani bir artışa sahip olacaktır. EGTA kullanılmadan, artık kalsiyum, mitokondriyal konsantrasyona, substrat mevcudiyetine ve diğer çevresel faktörlere bağlı olarak OXPHOS sırasında maksimum JO2 oranları üzerinde değişken etkilere sahiptir. Tampon bileşimi, mitokondriyal membran bütünlüğünün ve işlevselliğinin korunması için önemlidir. Protokol boyunca bahsedilen tüm tampon tarifleri Tablo 1'de daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve burada açıklanan tüm mitokondriyal preparatlar için kullanılabilir.
Mitokondrinin başarılı bir şekilde izole edilmesi, Tablo 2'de gösterildiği gibi, her tür ve doku kaynağı için verilen aralıkta yer alan RCR değerlerinin elde edilmesiyle gösterilir. Bu protokol kullanılarak toplanan verilere dayanarak, kobay, sıçan veya farelerden kardiyak mitokondri izole ediliyorsa, RCR'ler sırasıyla ≥16, ≥8 ve ≥5 olmalıdır. Sıçan karaciğerinden veya böbreğinden izole ediliyorsa, RCR'ler ≥6 olmalıdır, hücrelerden gelen RCR'ler ise 3.8'in üzerindeyse kabul edilebilir olarak kabul edilir. RCR değerleri bu aralıkların altına düşerse veya respirometri izlemelerinde kalitatif farklılıklar varsa, kontaminasyondan kaynaklanan sorunları ekarte etmek için yeni RB ve substratlar ile ek bir test yapılması önerilir. 1-1/RCR dönüşümü 0 ile 1 arasında değerler sınırlasa da, RCR değeri 10'dan büyük olduğunda cinsiyetler veya türler arasında mitokondriyal kaliteyi karşılaştırırken bu ölçüm önerilmez. Bu nedenle, tüm deneyler sırasında standart RCR değerleri (Durum 3/Durum 2 veya OXPHOS/LEAK) ölçülmüştür. Mitokondriyi fare kalplerinden, karaciğerden, böbreklerden ve hücrelerden daha iyi izole etmek için bu protokolde yapılabilecek modülasyonlarla ilgili bilgiler Tablo 3'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig01.jpg"> Şekil 1: Yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak yapılan kalite kontrol kontrolleri için ilgi alanları. Solunum odaları 2 mL RB ile yüklendi ve oksijen tüketim oranı 0'a yakın olana kadar 37 ° C'de dengelenmeye bırakıldı. Dengelendikten sonra, 5 mM sodyum piruvat ve 1 mM L-malat ile birlikte bir kalsiyum şelatörü olan 1 mM EGTA ilave edildi. Bu substratların eklenmesini takiben, istenen çalışma konsantrasyonunda (0.1 mg / mL) mitokondri ilave edildi ve Durum 2 solunumuna (sarı) ulaşmak için 5 dakika solunum yapmasına izin verildi. 5 dakika işaretinde, Durum 3 solunumunu (kırmızı) başlatmak için 500 μM ADP eklendi. RCR'ler, Durum 3 ile Durum 2'yi karşılaştırmak için kırmızı ve sarı kutularla gösterilen oksijen tüketim oranlarının ortalaması alınarak zamana göre belirlendi. Durum 4, yeşil kutu ile gösterilir ve ATP'nin ekstramitokondriyal ATPaz hidroliz periyodunu temsil eder ve sitokrom C deneylerinde dış zar bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir. Görüntülenen veriler SD sıçan kardiyak mitokondri kullanılarak toplandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig02.jpg"> Şekil 2: Hayvan ve doku kaynaklarında temsili JO2 izlemeleri ve solunum kontrol oranları. İzole edilmiş mitokondrinin kalitesi, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak oksijen tüketim oranlarının ölçülmesiyle test edildi. Solunum, 1 mM EGTA varlığında 5 mM sodyum piruvat ve 1 mM L-malat ile beslendi. Durum 2 solunumunun stabilize olması için mitokondri ve substratların 5 dakika solunum yapmasına izin verildi. ADP ilavesinden sonra maksimum oksijen tüketimi oranları, her doku için solunum kontrol oranlarını (RCR'ler) hesaplamak için ADP'den önceki Durum 2 oksijen tüketimi oranlarıyla karşılaştırıldı. Mitokondriyal kalite, PL kontrol verimliliği standartları ile karakterize edilen 1-1 / RCR değerleri hesaplanarak daha da değerlendirildi. Her izlemenin sağındaki çubuk grafikler, belirli bir doku için erkek (mavi) ve dişi (yeşil) ortalama RCR ve SD'± 1-1/RCR değerlerini gösterir. (A), (B) ve (C) sırasıyla kobaylar, Sprague Dawley (SD) sıçanları ve Friend lösemi virüsü B (FVB) fare kalpleri kullanılarak toplanan verileri ifade eder. (D) ve (E) SD sıçan karaciğeri ve böbreğinden elde edilen sonuçları detaylandırırken, (F) HEK293 hücrelerini ifade eder. Üç büyük karaciğer lobu toplanırken, her iki böbrek de izolasyon için kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Tampon tarifleri. İzolasyon işlemi boyunca kullanılan kardiyopleji tamponu (CB), izolasyon tamponu (IB) ve solunum tamponu (RB), listelenen talimatlara göre önceden hazırlanmalıdır. CB 4 °C'de bir aya kadar saklanabilirken, IB ve RB -80 °C'de 4 ay saklanabilir. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%201.xlsx" target="_blank">tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 2: Solunum kontrol oranı analizi. Fonksiyonel analizler için mitokondriyal izolasyon, hem erkek hem de dişi kemirgenlerde ve ayrıca HEK293 hücrelerinde çok çeşitli tür ve doku kaynaklarında gerçekleştirildi. Her cinsiyetin, doku kaynağının ve türün örneklem boyutu, SD'± ortalama RCR ve 1-1/RCR değerleri ile birlikte detaylandırılmıştır. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%202.xlsx" target="_blank">Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 3: Protein verimini artırmak için farklı dokular için mitokondriyal izolasyon protokolüne önerilen modülasyonlar. Doku kaynağına göre proteaz ve santrifüj miktarlarındaki değişiklikler görüntülenir. Ortalama toplam protein (mg) miktarları, BSA protein testinin sonuçlarından ve nihai mitokondriyal peletin yeniden süspansiyon hacminden hesaplandı. Değerler ortalama ± SD olarak rapor edilir. Santrifüjleme sütununda yer alan kalın talimatlar, süpernatantın atılıp atılmayacağı, tutulup tutulmayacağı veya bir havuzda toplanıp toplanmayacağı konusunda tavsiyede bulunur. Atma, süpernatantın bir biyolojik atık kabına atılmasını ifade ederken, tutma ve havuzlama, süpernatantın sırasıyla bir sonraki santrifüj tüpüne aktarılmasını veya son dönüş için toplanmasını ifade eder. Protokolde yapılan değişikliklerle ilgili daha fazla ayrıntı tartışma bölümünde bulunabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%203.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

robust-mitochondrial-isolation-from-rodent-cardiac-tissue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz а hücresel biyoenerjetik, biyofiziksel ölçümleri, proteomik veya mitokondriyal DNA ve lipidler analizi fonksiyonel veya yapısal çalışmalar mitokondri saf, çok birleştiğinde sıçan kalp izolasyonu için protokol açıklar.

Mitokondri Yüksek Coupled Sıçan Kalp hazırlanması

Bu protokol, iskelet kaslarının izole edilen mitokondri solunum çalışması için bir prosedür açıklanmıştır. Bu yöntem Scorrano...

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika - Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla &lt;30 dk.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Burada, daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli ve saflaştırılmış mitokondrinin izolasyonuna izin veren daha önce bildirilen bir yöntemin bir modifikasyonunu sunuyoruz. Bu prosedür, mikroplaka bazlı respirometirk testleri sırasında yüksek işlevle solunum yapan yüksek oranda bağlanmış mitokondri ile sonuçlanır.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Burada, anestezi uygulanmış bir domuzdan kuadriseps kas örneği alınır ve mitokondri diferansiyel santrifüjleme ile izole edilir. Daha sonra, mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri I, II ve IV'ün solunum hızları, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak belirlenir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

Öğrenin kemirgen kalp dokusundan sağlam mitokondri izolasyon yöntemini. Yüksek çözünürlüklü respirometri ve solunum kontrol oranları ile kalite değerlendirmesi yaparak hastalık mekanizmalarını araştırın.

Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon

Daha fazla video keşfet