Psödostratifiye Akciğer Hava Yolu Epitelinin Siliyer Fonksiyonunun ve Membran Geçirimsizliğinin Belirlenmesi

Araştırmamız, normal insan bronşiyal epitel hücrelerinin bir hava sıvısı arayüzünde ayırt edilmesiyle elde edilebilecek psödostratifiye hava yolu epitelinin iki kritik biyofiziksel özelliğini ölçmeyi amaçlamaktadır. Bu çalışmada psödostratifiye hava yolu epiteli kullanarak farklı solunum yolu virüslerinin farklı özellikleri tanımlanmıştır. Örneğin, bronşiolitin kanonik olmayan bir mekanizması olan respiratuar sinsityal virüs kaynaklı hücre iskeleti iltihabı.

Ayrıca goblet hücre hiperplazisinin kronik obstrüktif akciğer hastalığı hava yolu epitelinde SARS-CoV-2 replikasyonunu artırdığını tespit ettik. RSV enfeksiyonu ve virüsün neden olduğu bronşiolit ile mücadele için yeni terapötik hedefleri belirlemek için hücre iskeleti sinyalizasyonunun solunum sinsityal virüsü güdümlü modülasyonunun mekanizmasını aydınlatmaya odaklandık. Başlamak için, normal insan bronşiyal epitel veya NHBE hücre süspansiyonu alın.

Bir P200 pipeti ile, ekin apikal tarafına 200 mikrolitre tam hava yolu epitel hücresi veya AEC ortamında 50.000 yeniden askıya alınmış hücre ekleyin. Hücreleri% 85 ila% 95 nemlendirilmiş karbondioksit hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler birleştikten sonra, ekleri steril forseps kullanarak boş bir kuyuya aktarın.

Bir P1000 pipeti kullanarak tüm bazal AEC ortamını aspire edin. Daha sonra, bazal kuyucuğa% 2 penisilin-streptomisin ve% 1 amfoterisin B ile desteklenmiş 500 mikrolitre taze tam ALI farklılaşma ortamı ekleyin. Steril forseps kullanarak, eklenen tam ALI ortamı ile ekleri bazal kuyuya aktarın.

Bir P200 pipeti ile apikal AEC ortamını kuyudan nazikçe aspire edin ve inkübe edin. 48 saat sonra, ekleri steril forseps ile boş bir kuyuya aktarın. Bir P1000 pipeti kullanarak eski ortamı aspire edin ve 500 mikrolitre taze tam ALI ortamı ekleyin.

Ekleri steril forseps kullanarak taze ortamla kuyuya geri yerleştirin. 26. günde, bir P200 pipeti kullanarak, eklerin apikal tarafına 100 mikrolitre DPBS ekleyin. Nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Ardından, bir P200 pipeti kullanarak DPBS'yi aspire edin. Başlamak için mikroskobu, bağlı bilgisayarı ve ortam odasını açın. Hazne kapısını açın ve NBHE hücreli ekleri içeren plakayı mikroskop tablasına yerleştirin.

Plaka sahneye çıktığında, hazneyi kapatın. Ardından, plakayı hareket ettirmek ve ekleri görünüme getirmek için mikroskop aşaması çalıştırma düğmesini kullanın. Bilgisayar ekranında, SAVA programını açmak için SAVA sistem simgesine tıklayın.

Yazılım arayüzünde, Deneyi Yapılandır'a tıklayın. Bir sonraki sekmede, Deney Oluştur'a tıklayın. Ardından, yeni sekmede, Enter Experiment Directory Name (Deney Dizini Adını Girin) alanına verilerin depolanacağı dizini girin ve Enter Experiment Description (Deney Tanımını Girin) alanına ayrıntıları girin, ardından Tamam'ı tıklayın. Şimdi, oluşturulan ve Deneyler bölümünün altındaki dizinde gösterilen deneye tıklayın.

Daha sonra, Değiştir'e tıklayın ve Örnek Açıklama alanına örnek ayrıntılarını sağlayın. Ekle'yi tıklayın, ardından sekmeden çıkmak için Çıkış'ı tıklayın. Ana yazılım arayüzünde, Deney yuvasındaki açılır menüden oluşturulan denemeyi seçin.

Ardından, bilgisayar ekranındaki siliyer vuruş frekansını izlemek için Video Kaydet'e tıklayın. Ekran odaklanmış siliyer hareketi gösterecektir. Her ekleme için, saniyede 120 kare hızında 2,1 saniye boyunca altı farklı rastgele alan kaydedin.

Siliyer vuruş frekansı verilerini izlemek için Videoyu Kaydet'e tıklayın. Verileri analiz etmek için, yazılım arayüzünde Videoyu Analiz Et'e tıklayın. Ve bir sonraki sekmede, Tamam'ı tıklayın. Ardından aşağıdaki sekmeye gidin ve Tümünü Analiz Et'e tıklayın.

Her deney için oluşturulan elektronik tabloyu bilgisayarın SAVA Veri Toplama klasörüne indirin. Veri sunumu için Gauss ortalama frekansını alın. Siliyer atım frekansı, hem sağlıklı yetişkinlerin hava yolu epiteli hem de KOAH'lı olanlar için en az üç hertz'e ulaştı ve karşılaştırılabilir siliyer fonksiyon gösterdi.

Başlamak için, güç anahtarını kullanarak EVOM2 volt ohmmetreyi açın. Test direncini giriş yuvasındaki EVOM2'ye bağlayın. EVOM2 ekranındaki okumayı izleyin.

Okuma 1.000'in üzerinde veya altındaysa, cihazı kalibre etmek için tek tip 1.000 okuma gösterene kadar forseps kullanarak EVOM2 üzerindeki ADJ anahtarını çevirin. Şimdi, deneysel kontrol okuması için boş bir ek alın. Bir P200 pipeti kullanarak, boş ekin apikal tarafına 100 mikrolitre DPBS ekleyin.

Ardından, bir P1000 pipeti ile bazal tarafa 500 mikrolitre DPBS ekleyin. Daha sonra, test direncinin bağlantısını kesin ve STX2 elektrodunu EVOM2 üzerindeki giriş yuvasına bağlayın. Ardından STX2 elektrodunu %70 etanol ile nazikçe temizleyin.

STX2 elektrodunu, daha kısa elektrot bacağını apikal kısımda ve daha uzun elektrot bacağını bazal kısımda tutarak DPBS ile boş ek parçaya yerleştirin. Şimdi, EVOM2 ekranında kararlı okumayı kaydedin. Daha sonra, bir P200 pipeti kullanarak, ekin apikal tarafına 100 mikrolitre DPBS ekleyin.

STX2 elektrodunu, daha önce gösterildiği gibi 26 günlük farklılaşmış hava yolu epiteli ile ek parçaya yerleştirin. Ardından, EVOM2 ekranında kararlı okumayı kaydedin. KOAH'lı erişkinlerde transepitelyal elektriksel direnç değerleri artmıştır, bu da KOAH'ta membran geçirimsizliğinin arttığını göstermektedir.