Psödostratifiye Akciğer Hava Yolu Epitelinin Siliyer Fonksiyonunun ve Membran Geçirimsizliğinin Belirlenmesi
21 Şubat 2025
Hava-sıvı arayüz kültürü, akciğer hava yolunun apikal tarafını taklit eden primer normal insan bronşiyal epitel hücrelerini farklılaştırarak psödostratifiye hava yolu epiteli geliştirmek için yaygın olarak kullanılır. Burada, siliyer fonksiyon ve membran bütünlüğü gibi biyofiziksel özelliklerini izleyerek kalitesini belirlemek için kolay bir protokol açıklıyoruz.
Araştırmamız, normal insan bronşiyal epitel hücrelerinin bir hava sıvısı arayüzünde ayırt edilmesiyle elde edilebilecek psödostratifiye hava yolu epitelinin iki kritik biyofiziksel özelliğini ölçmeyi amaçlamaktadır. Bu çalışmada psödostratifiye hava yolu epiteli kullanarak farklı solunum yolu virüslerinin farklı özellikleri tanımlanmıştır. Örneğin, bronşiolitin kanonik olmayan bir mekanizması olan respiratuar sinsityal virüs kaynaklı hücre iskeleti iltihabı.
Ayrıca goblet hücre hiperplazisinin kronik obstrüktif akciğer hastalığı hava yolu epitelinde SARS-CoV-2 replikasyonunu artırdığını tespit ettik. RSV enfeksiyonu ve virüsün neden olduğu bronşiolit ile mücadele için yeni terapötik hedefleri belirlemek için hücre iskeleti sinyalizasyonunun solunum sinsityal virüsü güdümlü modülasyonunun mekanizmasını aydınlatmaya odaklandık. Başlamak için, normal insan bronşiyal epitel veya NHBE hücre süspansiyonu alın.
Bir P200 pipeti ile, ekin apikal tarafına 200 mikrolitre tam hava yolu epitel hücresi veya AEC ortamında 50.000 yeniden askıya alınmış hücre ekleyin. Hücreleri% 85 ila% 95 nemlendirilmiş karbondioksit hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler birleştikten sonra, ekleri steril forseps kullanarak boş bir kuyuya aktarın.
Bir P1000 pipeti kullanarak tüm bazal AEC ortamını aspire edin. Daha sonra, bazal kuyucuğa% 2 penisilin-streptomisin ve% 1 amfoterisin B ile desteklenmiş 500 mikrolitre taze tam ALI farklılaşma ortamı ekleyin. Steril forseps kullanarak, eklenen tam ALI ortamı ile ekleri bazal kuyuya aktarın.
Bir P200 pipeti ile apikal AEC ortamını kuyudan nazikçe aspire edin ve inkübe edin. 48 saat sonra, ekleri steril forseps ile boş bir kuyuya aktarın. Bir P1000 pipeti kullanarak eski ortamı aspire edin ve 500 mikrolitre taze tam ALI ortamı ekleyin.
Ekleri steril forseps kullanarak taze ortamla kuyuya geri yerleştirin. 26. günde, bir P200 pipeti kullanarak, eklerin apikal tarafına 100 mikrolitre DPBS ekleyin. Nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Ardından, bir P200 pipeti kullanarak DPBS'yi aspire edin. Başlamak için mikroskobu, bağlı bilgisayarı ve ortam odasını açın. Hazne kapısını açın ve NBHE hücreli ekleri içeren plakayı mikroskop tablasına yerleştirin.
Plaka sahneye çıktığında, hazneyi kapatın. Ardından, plakayı hareket ettirmek ve ekleri görünüme getirmek için mikroskop aşaması çalıştırma düğmesini kullanın. Bilgisayar ekranında, SAVA programını açmak için SAVA sistem simgesine tıklayın.
Yazılım arayüzünde, Deneyi Yapılandır'a tıklayın. Bir sonraki sekmede, Deney Oluştur'a tıklayın. Ardından, yeni sekmede, Enter Experiment Directory Name (Deney Dizini Adını Girin) alanına verilerin depolanacağı dizini girin ve Enter Experiment Description (Deney Tanımını Girin) alanına ayrıntıları girin, ardından Tamam'ı tıklayın. Şimdi, oluşturulan ve Deneyler bölümünün altındaki dizinde gösterilen deneye tıklayın.
Daha sonra, Değiştir'e tıklayın ve Örnek Açıklama alanına örnek ayrıntılarını sağlayın. Ekle'yi tıklayın, ardından sekmeden çıkmak için Çıkış'ı tıklayın. Ana yazılım arayüzünde, Deney yuvasındaki açılır menüden oluşturulan denemeyi seçin.
Ardından, bilgisayar ekranındaki siliyer vuruş frekansını izlemek için Video Kaydet'e tıklayın. Ekran odaklanmış siliyer hareketi gösterecektir. Her ekleme için, saniyede 120 kare hızında 2,1 saniye boyunca altı farklı rastgele alan kaydedin.
Siliyer vuruş frekansı verilerini izlemek için Videoyu Kaydet'e tıklayın. Verileri analiz etmek için, yazılım arayüzünde Videoyu Analiz Et'e tıklayın. Ve bir sonraki sekmede, Tamam'ı tıklayın. Ardından aşağıdaki sekmeye gidin ve Tümünü Analiz Et'e tıklayın.
Her deney için oluşturulan elektronik tabloyu bilgisayarın SAVA Veri Toplama klasörüne indirin. Veri sunumu için Gauss ortalama frekansını alın. Siliyer atım frekansı, hem sağlıklı yetişkinlerin hava yolu epiteli hem de KOAH'lı olanlar için en az üç hertz'e ulaştı ve karşılaştırılabilir siliyer fonksiyon gösterdi.
Başlamak için, güç anahtarını kullanarak EVOM2 volt ohmmetreyi açın. Test direncini giriş yuvasındaki EVOM2'ye bağlayın. EVOM2 ekranındaki okumayı izleyin.
Okuma 1.000'in üzerinde veya altındaysa, cihazı kalibre etmek için tek tip 1.000 okuma gösterene kadar forseps kullanarak EVOM2 üzerindeki ADJ anahtarını çevirin. Şimdi, deneysel kontrol okuması için boş bir ek alın. Bir P200 pipeti kullanarak, boş ekin apikal tarafına 100 mikrolitre DPBS ekleyin.
Ardından, bir P1000 pipeti ile bazal tarafa 500 mikrolitre DPBS ekleyin. Daha sonra, test direncinin bağlantısını kesin ve STX2 elektrodunu EVOM2 üzerindeki giriş yuvasına bağlayın. Ardından STX2 elektrodunu %70 etanol ile nazikçe temizleyin.
STX2 elektrodunu, daha kısa elektrot bacağını apikal kısımda ve daha uzun elektrot bacağını bazal kısımda tutarak DPBS ile boş ek parçaya yerleştirin. Şimdi, EVOM2 ekranında kararlı okumayı kaydedin. Daha sonra, bir P200 pipeti kullanarak, ekin apikal tarafına 100 mikrolitre DPBS ekleyin.
STX2 elektrodunu, daha önce gösterildiği gibi 26 günlük farklılaşmış hava yolu epiteli ile ek parçaya yerleştirin. Ardından, EVOM2 ekranında kararlı okumayı kaydedin. KOAH'lı erişkinlerde transepitelyal elektriksel direnç değerleri artmıştır, bu da KOAH'ta membran geçirimsizliğinin arttığını göstermektedir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, hava-sıvı arayüzünde (ALI) farklılaşmış normal insan bronşiyal epitel hücreleri kullanılarak psödostratifleşmiş hava yolu epitelisinin geliştirilmesine odaklanmaktadır. Araştırma, bu epitel modelinin kalitesini değerlendirmek için biyofiziksel özelliklerinin, özellikle sililerin işlevi ve zar bütünlüğünün izlenmesiyle ilgili bir yöntemi vurgulamaktadır ve bu özellikler, solunumsal viral enfeksiyonların anlaşılmasında kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Psödostratifleşmiş hava yolu epiteli
- Solunumsal virüsler
- Bronşiyolit ve KOAH komplikasyonları
Arka Plan
- Hava-sıvı arayüzü kültürü, akciğer hava yolu özelliklerini taklit eder.
- Solunumsal sinsiyal virüsü (RSV) klasik olmayan enflamatuar mekanizmalar gösterir.
- Goblet hücre hiperplazisi ve SARS-CoV-2 replikasyonu üzerindeki etkisi.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre farklılaşma protokolleri ve izleme teknikleri
- Normal insan bronşiyal epitel hücreleri (NHBE)
- Sililerin darbe frekansının değerlendirilmesi için videomikroskopi; zar bütünlüğü için transepitelyal elektriksel direnç
Ana Sonuçlar
- Sililerin darbe frekansı, hem sağlıklı yetişkinlerde hem de KOAH hastalarında üç hertz'e ulaşarak, benzer sililer işlevini göstermiştir.
- Transepitelyal direnç değerleri, KOAH'da zar geçirimsizliğinin arttığını düşündürmektedir.
- RSV'nin sitoskelet modülasyonuna yol açtığı ve bunun terapötik hedefleme için önemli sonuçları olduğu belirlenmiştir.
Sonuçlar
- Çalışma, hava yolu epitel kültürlerini değerlendirmek için güvenilir bir yöntemin kurulmasını başarıyla göstermiştir.
- Bulgular, solunumsal viral enfeksiyonların patofizyolojisine ve KOAH gibi kronik durumlardaki önemlerine dair önemli bilgiler sağlamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of ciliary function and membrane impermeability in pseudostratified airway epithelium provides critical quality control for preclinical respiratory models. These biophysical readouts underpin predictive confidence in disease-relevant systems for respiratory virus research and therapeutic target validation. Reliable measurement of ciliary beat frequency and transepithelial resistance supports risk-adjusted advancement of airway models across discovery and translational pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of airway epithelial models for respiratory disease research.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying ciliary activity and barrier integrity.
- Facilitates identification of novel therapeutic targets through disease-relevant phenotyping.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible metrics for assay readiness in airway models.
- Delivers quantitative outputs (CBF, TEER) essential for compound screening workflows.
- Ensures biological system quality for reliable downstream evaluation of antiviral agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro airway models with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables comparative studies of healthy and diseased epithelium, supporting biomarker development.
- Reduces translational risk by validating model integrity prior to preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method anchors airway model qualification from early discovery through preclinical research, supporting both target validation and screening inflection points.
- Discovery Biology: Quantitative CBF and TEER measurements clarify functional status and biological relevance of airway models.
- Screening: Standardized outputs enable reproducible assay development and compound evaluation.
- Analytics: High-speed video and volt-ohm readouts provide objective, comparable data across conditions.
- Translational Research: Disease-relevant measurements support alignment with clinical endpoints and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: The protocol establishes a reusable platform for respiratory virus and airway disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in airway disease models.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible quality control metrics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by ensuring model reliability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of respiratory research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in airway epithelial cell culture and differentiation.
- Needs access to high-speed videomicroscopy and volt-ohm instrumentation.
- Demands cross-team standardization of measurement protocols and data analysis.
- Adaptation may be needed for different donor sources or disease models.
- Dependent on consistent cell quality and environmental control for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Establishing Air Liquid Interface (ALI) Culture to Develop Pseudostratified Airway Epithelium
3:07
Determination of Ciliary Beat Frequency of the Airway Epithelium Obtained from Differentiating Primary NHBE Cells
5:37
Quantification of Transepithelial Electrical Resistance of Air Liquid Interface‐Cultured Pseudostratified Airway Epithelium
