Name: Nötr Kuyruklu Yıldız Deneyi ile İnsan Hücrelerini Bölmede DNA Kırılmalarının Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Keşfedin nötr kuyruklu yıldız deneyi ile insan hücrelerinde DNA kırılmalarının tespitini. Bu yöntem replikasyon stresi altında kromatin remodelleme ve genom stabilitesi araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dungrawala laboratuvar üyelerine katkıları ve geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibesi R35GM137800 HD'ye tarafından finanse edilmiştir.

Bu protokol (Şekil 1) esas olarak yapışık U2OS kanser hücre hatlarını kullanır, ancak doku kültüründe yetiştirilen çok çeşitli yapışık ve süspansiyon hücrelerine uyarlanabilir. Bu çalışmada kullanılan çözeltiler ve tamponlar Tablo 1'de detaylandırılmıştır. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Deney gününden önce, agarozun tamamen eridiğinden emin olmak için verilen düşük erime noktalı agaroz (PBS'de %1 düşük erime noktalı agaroz) şişesini 5-10 dakika sıcak su banyosuna koyun. NOT: Şişeyi mikrodalgada ısıtmayın.</li>
	<li>Eridikten sonra, 100 μL agarozu gerektiği gibi 1.5 mL santrifüj tüplerine hızlı bir şekilde ayırın ve tüpleri 4 °C'de saklayın. Katılaşmış agaroz 4 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.</li>
	<li>Deney günü, gerekli sayıda santrifüj tüpünü 4 °C'lik depodan çıkarın. Tüpleri 42 °C'de bir ısı bloğuna veya su banyosuna yerleştirerek agarozu eritin. NOT: Agarozun yeniden süspansiyon için tamamen eridiğinden emin olmak için hücreleri toplamadan önce tüpleri 42 °C'ye yerleştirin (adım 3.7).</li>
	<li>Deney günü taze lizis tamponu ve TAE tamponu hazırlayın ve kullanıma hazır olana kadar sırasıyla oda sıcaklığında ve 4 ° C'de saklayın. Ek olarak, 15 mL'lik konik tüpte 1x PBS'yi ayırın ve yeniden süspansiyon adımında kullanmak üzere buzdolabına koyun (adım 3.5).</li>
	<li>2 oyuklu kuyruklu yıldız slaytlarının buzlu ucundaki numune tanımlamalarını işaretleyin ve kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.</li>
</ol>2. Numunelerin hazırlanması
<ol><li>Deney gününden önce, hücreleri 6 oyuklu bir tabakta tohumlayın ve gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültürleyin. U2OS hücreleri için, her örnek için yaklaşık 2-3 x 105 hücre tohumlandı. NOT: Analizler için kullanılan hücre türüne bağlı olarak hücre numaralarının ayarlanması gerekebilir.</li>
	<li>Deney gününde, hücreleri deney tasarımına göre koşullarla tedavi edin. Replikasyona bağlı kırılma indüksiyonunu göstermek için pozitif bir kontrol olarak, hücreleri 1 saat boyunca 1 μM CPT ile tedavi edin. CPT, replikasyona bağlı bir şekilde çift iplikli kopmaları indükleyen bir topoizomeraz-1 inhibitörüdür14.</li>
</ol>3. Hücre yeniden süspansiyonu ve lizisi
<ol><li>Hücre kültürü ortamını aspire edin ve 1x PBS ile iki kez durulayın.</li>
	<li>Her kuyucuğa 300 μL tripsin ekleyin. Çanağı bir doku kültürü inkübatöründe 2-3 dakika inkübe edin. NOT: Tripsin içinde uzun süreli inkübasyon, kuyruklu yıldız analizleri sırasında sahte sonuçlar üretebilir.</li>
	<li>Her oyuğa 700 μL hücre kültürü ortamı ekleyin. Yavaşça yeniden süspanse edin ve numuneleri 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın. NOT: Analiz sırasında çakışan kuyrukların sıklığını azaltmak için adım 3.6'da uygun hücre yoğunluğunu elde etmek için bu adımda hücrelerin sayılması önerilir.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2400 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Adım 3.4 ve adım 3.5'i iki kez tekrarlayın ve hücreleri ml başına 2 x 105 hücre hücre yoğunluğunda soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse edin. NOT: Yeterli sayıda canlı hücrenin mevcut olduğundan emin olmak için bu adımda hücre canlılığının değerlendirilmesi önerilir. En az% 90 canlılık önerilir.</li>
	<li>10 μL hücre süspansiyonunu 100 μL erimiş agaroz alikotunda yeniden süspanse edin ve aynı pipet ucunu kullanarak hafifçe karıştırın ve karışımı slaydın bir oyuğuna eşit şekilde yayın. Gerektiği gibi tüm örnekler için bu adımı tekrarlayın. NOT: Agarozun katılaşmasını önlemek için tüm alikotları 42 ° C su banyosundan bir kerede çıkarmaktan kaçının. Bu adım tercihen su banyosu ile gerçekleştirilmelidir ve her numune yeniden askıya alınır ve kademeli bir şekilde yayılır. Hava cepleri elektroforez sırasında kuyruklu yıldız kuyruklarının göçünü etkileyeceğinden (adım 4.5) ve kurutma adımında çatlaklara neden olacağından, agarozu slayt üzerine yayarken kabarcıklar oluşturmaktan kaçının (adım 5.3)</li>
	<li>Agarozun tamamen katılaştığından emin olmak için slaytları 4 °C'de karanlıkta 15-20 dakika saklayın (Şekil 2A).</li>
	<li>Slaytları Coplin kavanozlarına yerleştirin ve slaytları oda sıcaklığında 1 saat boyunca lizis tamponuna daldırın.</li>
	<li>Slaytları soğuk TAE tamponu ile bir kez durulayın ve slaytları 4 °C'de 30 dakika boyunca soğuk TAE tamponuna daldırın.</li>
</ol>4. Elektroforez
<ol><li>Elektroforetik odayı düz bir yüzeye kurun ve aparatın kenarlarındaki dört tesviye düğmesini kullanarak sistemi düzleştirin. Elektroforez sırasında çözeltiyi soğuk tutmak için alt hazneye soğuk paketler yerleştirin.</li>
	<li>Aparatın içine yaklaşık ~ 850 mL soğuk 1x TAE tamponu dökün.</li>
	<li>Slaytları 4 °C'den çıkarın ve kırık DNA'nın göçüne izin vermek için elektroforez tepsisine uygun yönde yerleştirin. NOT: Tepside on adet 2 oyuklu slayt bulunur. Daha az sayıda örnekle çalışıyorsanız, slaytları tepsinin ortasına yerleştirin. Tek sayıda slaytla çalışıyorsanız, her kuyuya 2 slayt sığacak şekilde boş bir slayt ekleyin.</li>
	<li>Slaytları kaplamak için sağlanan kaydırma tepsisi kaplamasını yavaşça tepsinin üzerine yerleştirin. NOT: Aparatın düzgün çalışması için, TAE tamponunun hacmi, kaplamanın alt yüzeyinden daha düşük olmamalı ve kaplamanın üst yüzeyini aşmamalıdır.</li>
	<li>Kabloları bağladıktan sonra gücü 21 V'a ayarlayın ve 1 dakika boyunca elektroforez (40 V/cm) gerçekleştirin. NOT: Elektroforez süresinin, analizler için kullanılan hücre tipine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. İşlenmemiş numunelerdeki uzun kuyruklar, aşırı çalışma süresini gösterir. Tersine, pozitif kontrol numunelerindeki kısa kuyruklar yetersiz çalışma süresini yansıtabilir.</li>
</ol>5. Boyama
<ol><li>Elektroforezin tamamlanmasından sonra, slaytları cihazdan çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DNA çökeltme çözeltisine daldırın.</li>
	<li>DNA çökeltme solüsyonunu atın ve slaytları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 70 etanol solüsyonuna batırın.</li>
	<li>% 70 etanol çözeltisini atın. Slaytları çıkarın ve karanlıkta 30 dakika boyunca 45 °C'de bir hibridizasyon fırınında kurutun (Şekil 2B). NOT: Kurutma adımı için slaytlar gece boyunca karanlık ve kuru bir yerde bırakılabilir.</li>
	<li>Kuyucukları 100 μL 1x SYBR Green solüsyonu ile karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Slaytları eğerek ve kuyunun kenarını tüy bırakmayan bir bezle hafifçe vurarak fazlalığı gidererek SYBR Green solüsyonunu boşaltın.</li>
	<li>Slaytları bir çekmeceye yerleştirin ve 30 dakika kurumaya bırakın.</li>
	<li>Slaytları görüntülemeye devam edin.</li>
</ol>6. Görüntüleme ve analizler
<ol><li>Mikroskobu görüntüleme amacıyla ayarlayın. NOT: Tüm görüntüler epifloresan mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir. 0.45 sayısal diyafram açıklığına sahip 10x büyütme, 1/40s pozlama süresi ve +6dB kazanç ile kullanıldı. Monokrom 8 bit'in yakalama modu, 2 x 2 gruplama ve siyah dengesi düzeltmesi ile kullanıldı.</li>
	<li>Slaytları mikroskop tablasına yerleştirin ve FITC filtresini kullanarak görüntülemeye başlayın. NOT: Maruz kalma süresini test etmek için önce işlenmemiş numuneyi kullanın. DNA daha kompakt olduğu için çoğu hücre kuyruklu yıldız kuyruğu göstermez. CPT ile muamele edilmiş hücrelerle kuyuya geçin ve aynı pozlama süresini kullanarak görüntü alın. Kırık DNA uçlarının göçü nedeniyle bu örnekte artan uzunluklara sahip kuyruklu yıldız kuyrukları gözlenecektir.</li>
	<li>Üç teknik kopyada aynı pozlama süresini kullanarak numune başına en az 100 kuyruklu yıldız için görüntü elde edin. NOT: Lamellerin sonundaki kuyruklu yıldız kuyrukları eşit olmayan bir şekilde göç etme eğilimindedir ve numune dağılımında aykırı değerler olarak hareket eder. Analizler için yakalanan kuyruklu yıldızların çoğu, lamel merkezine yakın bir yerde bulunur (Şekil 3).</li>
	<li>Görüntüleri dışa aktarın ve kuyruklu yıldızları manuel olarak (Görüntü J'yi kullanarak) veya ücretsiz olarak kullanılabilen kuyruklu yıldız puanlama yazılımını kullanarak puanlayın. Puanlama için ayrı ayrı ayırt edilebilen ve görüş alanında tamamen yer alan kuyruklu yıldızlar seçilir. Üst üste binen veya kısmen görülebilen kuyruklu yıldızlar daha sonraki analizler için dikkate alınmamıştır (Şekil 4). NOT: Kullanıcılar, aşağıdaki eklentiyi kullanarak Image J'de kuyruklu yıldızları puanlayabilir: https://cometbio.org/index.html. CometScore yazılımını kullanarak kuyruklu yıldızları puanlamak için ayrıntılar Şekil 5'te yer almaktadır.</li>
	<li>Analizlerden elde edilen kuyruk momentlerini, 10-90 yüzdebirlik değerleri gösteren kutu ve yatay çizgi grafikleri olarak çizin. İstatistiksel analizler için parametrik veya parametrik olmayan testlerin kullanılması gerekip gerekmediğini belirlemek için normallik testleri yapın. NOT: Çoğu durumda, parametrik olmayan testler, yalnızca iki numuneyi karşılaştırıyorsanız Mann-Whitney testi veya üç veya daha fazla numuneyi karşılaştırıyorsanız Dunn'ın çoklu karşılaştırmaları ile Kruskal-Wallis testi kullanılarak uygulanır.</li>
</ol>

DNA replikasyonu sırasında meydana gelen DNA kırılmalarının derecesinin araştırılması 

<ol><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+as+a+requirement+for+development+of+the+contact+effect+in+Chinese+hamster+v79+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids.</a> Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>De Lapuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+and+its+applications+in+the+field+of+ecotoxicology%3A+A+mature+tool+that+continues+to+expand+its+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives.</a> Front Genet. 6, 180(2015).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+An+hcomet+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).</li>
<li>Speit, G., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+sensitive+genotoxicity+test+for+the+detection+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage.</a> Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+modifications+with+the+comet+assay%3A+A+compendium+of+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols.</a> Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).</li>
<li>Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet-fish+technique%3A+A+tool+for+detection+of+specific+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair.</a> Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+atr%3A+Ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atr: An essential regulator of genome integrity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA repair.</a> Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).</li>
<li>Strumberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+topoisomerase+I+cleavage+complexes+on+the+leading+strand+of+ribosomal+DNA+into+5%27-phosphorylated+DNA+double-strand+breaks+by+replication+runoff%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibitors%3A+Camptothecins+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond.</a> Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).</li>
<li>Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camptothecin+induces+protein-linked+DNA+breaks+via+mammalian+DNA+topoisomerase+i%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i.</a> J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+brca2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanism+for+the+parp+and+BRCA+synthetic+lethality%3A+Clearing+up+the+misunderstandings%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings.</a> Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).</li>
<li>Mcglynn, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromodeoxyuridine+comet+assay%3A+Detection+of+maturation+of+recently+replicated+DNA+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells.</a> Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).</li>
<li>Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+human+rad18-dependent+DNA+post-replication+repair+by+alkaline+bromodeoxyuridine+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay.</a> PLoS One. 8 (8), e70391(2013).</li>
<li>Thakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging+strand+gap+suppression+connects+BRCA-mediated+fork+protection+to+nucleosome+assembly+through+PCNA-dependent+CAF-1+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling.</a> Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).</li>
<li>Vaitsiankova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp+inhibition+impedes+the+maturation+of+nascent+DNA+strands+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).</li>
<li>Dungrawala, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radx+promotes+genome+stability+and+modulates+chemosensitivity+by+regulating+rad51+at+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks.</a> Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).</li>
<li>Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dcaf14+promotes+stalled+fork+stability+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity.</a> Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).</li>
<li>Lemacon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11+and+exo1+nucleases+degrade+reversed+forks+and+elicit+mus81-dependent+fork+rescue+in+brca2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 860(2017).</li>
<li>Leung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+protects+ongoing+and+newly+assembled+DNA+replication+forks+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms.</a> Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).</li>
<li>Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrator+facilitates+RNApii+removal+to+prevent+transcription-replication+collisions+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability.</a> Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).</li>
<li>Mosler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-loop+proximity+proteomics+identifies+a+role+of+ddx41+in+transcription-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability.</a> Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+rad51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).</li>
<li>Sestili, P., Cantoni, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+driven+radial+diffusion+of+single-stranded+DNA+fragments+on+an+agarose+bed+as+a+convenient+measure+of+DNA+strand+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission.</a> Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).</li>
<li>Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+halo+assay%3A+An+improved+method+to+quantify+genomic+DNA+strand+breakage+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level.</a> Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).</li>
<li>Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+strand+breaks+in+individual+apoptotic+cells+by+the+in+situ+terminal+deoxynucleotidyl+transferase+and+nick+translation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.</a> Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).</li>
<li>Hanada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-specific+endonuclease+mus81+contributes+to+replication+restart+by+generating+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Bu protokol, aktif replikasyon geçiren insan hücrelerindeki DNA kırılmalarını değerlendirmek için bir NC testini ana hatlarıyla belirtir. Protokolün gerçekleştirilmesi nispeten basittir ve araştırmacılar bunu alkali analizler için yüksek pH koşullarına kolayca uyarlayabilirler8. Adım 3.7 ve 4.5'te açıklandığı gibi iki kritik adım içerir. Adım 3.7'de, analiz sırasında kuyruklu yıldızların üst üste binmesini önlemek için erimiş agarozun hücrelerle birlikte kuyu boyunca eşit şekilde yayılması esastır. Hücreleri agarozda yeniden süspanse etmeden önce hücresel agregatların çözüldüğünden emin olun. Agarozu yayarken pipet ucunun serbest kalmasını önlemek, kabarcıkların girişini en aza indirmeye yardımcı olacaktır. Elektroforez koşulları, görüntüleme ve analiz için uygun kuyruklu yıldız kuyruğu göçünü elde etmek için çok önemlidir. Araştırmacılar, kuyruk göçünün kapsamı ve kuyruklu yıldız kuyrukları sergileyen hücrelerin yüzdesi hücre tiplerine göre değiştiğinden, analiz için kullanılan hücre hatlarının doğasını göz önünde bulundurmalıdır (Şekil 9). Bu nedenle, deneyden önce elektroforez çalışma süresinin ampirik olarak belirlenmesi önerilir.
Pozitif kontrol örneklerinde (CPT ile tedavi edilen hücreler) kuyruklu yıldız kuyruğu gözlenmezse, ilaç etkinliği, DNA hasar belirteci γH2AX için immün boyama gibi alternatif yaklaşımlar kullanılarak paralel olarak doğrulanmalıdır. Kapsamlı kuyruk göçü, kırılma indüksiyonunun analizini engelleyebilir. Elektroforez süresini en aza indirmek ve analizden önce hücre morfolojisini değerlendirmek, çok uzun kuyruklu yıldız kuyruklarının elde edilmesini önleyebilir. Slaytların yetersiz kurutulması, bulanık ve puslu kuyruklu yıldız görüntülerine neden olabilir. 1x SYBR çözeltisi ile boyamadan önce kuyruklu yıldız lamındaki agarozun eşit şekilde kurutulduğundan ve düzleştirildiğinden emin olun. Katlama indüksiyon aralığı darsa, CPT ile bir doz-yanıt eğrisi gerçekleştirmek, deneysel amaçlar için en uygun çalışma aralığının belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu sorun giderme ipuçlarını uygulamak, bu tahlillerden elde edilen sonuçları en üst düzeye çıkarmaya yardımcı olacaktır.
Bu tahlil metodolojisi, Halo tahlili 29,30, TUNEL tahlili31 ve darbeli alan jel elektroforezi32 gibi DNA kırılma indüksiyonunu incelemek için kullanılan diğer tekniklere kıyasla uygun maliyetli ve oldukça hassastır. Bununla birlikte, mevcut tahlil tekniğinin bazı sınırlamaları vardır. Kesin bir DNA lezyonu sayısı sağlamaz, ancak hasar görmemiş hücrelere kıyasla kırılma birikiminin göreceli bir tahminini sunar. Ek olarak, hücre döngüsüne bağlı bir şekilde meydana gelen kırılma indüksiyonunu değerlendiremez. Hücre döngüsü ilerlemesindeki farklılıklar nedeniyle kırılma indüksiyonundaki değişiklikleri dışlamak için, akış sitometrisi ile hücre döngüsü analizleri paralel olarak yapılmalıdır.

Kuyruklu yıldız testi, tek hücre düzeyinde DNA kırılmalarını tespit etmek için kullanılan bir jel elektroforez yöntemidir. Açık uçlu DNA kırılmalarının elektroforetik koşullar altında göç etmesi, bozulmamış DNA'nın ise büyük ölçüde statik kalması ilkesine dayanır. Kırık DNA göç eder, çünkü kırılmalar süper sarmal DNA'nın gevşemesine neden olur ve elektroforetik odadaki anoda doğru kademeli olarak uzaysal yer değiştirmesine neden olur, bu da immünofloresan 1,2 tarafından gözlemlenen kuyruklu yıldız benzeri bir görünüme neden olur. DNA hasarının derecesi daha sonra kompakt DNA'ya göre göç eden kırık DNA miktarının ölçülmesiyle ölçülür.
En yaygın olarak kullanılan iki kuyruklu yıldız tahlili yöntemi, alkali kuyruklu yıldız (AC) tahlili ve nötr kuyruklu yıldız (NC) tahlilidir. AC testi, yüksek alkali pH çözeltisi kullanılarak denatüre etme koşulları altında gerçekleştirilirken, NC testi, nötr pH'lı bir çözelti içinde gerçekleştirilir. Hem NC hem de AC tahlilleri, çekirdekte meydana gelen DNA kırılmalarını güvenilir bir şekilde tespit edebilir. Bununla birlikte, alkali versiyon, alkali-kararsız bölgeleri tespit etmek için de avantajlıdır3. Testin her iki formatı da, elektroforezden önce DNA'nın protein içermediğinden emin olmak için lizis koşullarının kullanılmasını gerektirir.
Bu test, DNA kırılmalarını tespit etmek için basit bir yöntemdir ve hücresel DNA hasarını belirlemek için birkaç benzersiz avantaj sunar. Yöntemin kurulumu nispeten kolaydır ve laboratuvarda hazırlanabilen veya ticari satıcılardan satın alınabilen reaktifler gerektirir. Tek hücreli bir çözünürlük tekniği olarak, tahlil çok az başlangıç materyali gerektirir. Özellikle, NC testi, hücre başına 50 ila 10.000 kırılmayı tespit ettiği bildirilen yüksek hassasiyetle kırılmaları ölçebilir4. Bu tekniğin çok yönlülüğü, ekotoksikoloji5, insan biyoizleme6 ve genotoksisite çalışmaları7 dahil olmak üzere geniş uygulama yelpazesi ile gösterilmiştir. Test ayrıca çeşitli hücre tiplerinde güvenilir bir şekilde kullanılabilir ve yüksek verimli tahliller8 ve belirli genomik bölgelerdekikırılmaları değerlendirmek için 9 uyarlanabilir. Bu nedenle, bu tahlil, tek hücre düzeyinde kırılma oluşumunu araştırmak için hızlı ve güvenilir bir teknik olarak hizmet eder.
DNA replikasyonu süreci, çeşitli endojen ve eksojen stresörler tarafından sürekli olarak sorgulanmaktadır10,11. Bu tür lezyonlara bağlı olarak replizomların durması, DNA kırılmalarına neden olabilir ve genom kararsızlığının artmasına neden olabilir. DNA kırılmaları da sıklıkla DNA onarımını kolaylaştırmak için replikasyon ara ürünleri olarak ortaya çıkar12. Ek olarak, kamptoteksin (CPT)13,14,15 ve PARP inhibitörleri 16,17 gibi çeşitli kemoterapötik ajanlar, replikasyona bağlı çift iplikçik kırılmalarını (DSB'ler) indükler. Bu nedenle, bu tahlil, DNA lezyonlarının doğasını incelemek, replikasyon çatallarının işlenmesini değerlendirmek ve DNA'ya zarar veren ajanların terapötik potansiyelini araştırmak için güçlü bir metodoloji görevi görür. Yeni sentezlenmiş DNA'nın BrdU ile etiketlenmesini içeren testin adaptasyonları, replikasyonla ilişkili stres fenotiplerini incelemek için yararlı olmuştur 18,19,20,21. Özellikle, NC testi, çatal proteinlerininkarakterizasyonunu içeren çalışmalarda gösterildiği gibi, replikasyon bağlamında DNA kırılma indüksiyonunu incelemek için güvenilir bir yöntemdir 22,23, replikasyon ara ürünlerinin analizi24,25 ve genom bakımında transkripsiyon-replikasyon çatışmalarının araştırılması26,27. Burada, insan hücrelerinde replikasyon sırasında DNA kırılmalarını ölçmek amacıyla bir NC test protokolünün ana hatlarını çiziyoruz. Bu protokol, çok çeşitli bölünen insan hücrelerinde replikasyon stresi ile ilişkili hasarı değerlendirmekle ilgilenen araştırmacılar tarafından kolayca uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Selleckchem</td><td>S1288</td><td></td></tr><tr><td>Kuyruklu Yıldız LMAgarose (LMA)</td><td>R& D sistemleri</td><td>4250-050-02</td><td></td></tr><tr><td>Kuyruklu Yıldız Testi Elektroforez Sistemi II</td><td>R& D sistemleri</td><td>4250-050-ES</td><td>Elektroforez tankı, güvenlik kapağı, kablolar, 2/20 kuyu kayar tepsileri ve kayar tepsi yerleşimi içerir</td></tr><tr><td>CometScore yazılımı</td><td>TriTek</td><td></td><td>açık kaynaklı</td></tr><tr><td>CometSlide</td><td>R& D sistemleri</td><td>4250-050-03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikozlu</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>D128-4</td><td></td></tr><tr><td>Epifloresan mikroskobu</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu - Premium</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>hTERT-RPE-1 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hidroksiüre</td><td>Millipore Sigma</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>PARP inhibitörü Olaparib</td><td>Selleckchem</td><td>S8096</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac ve nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>FB300Q</td><td></td></tr><tr><td>Yüzey İşlem Görmüş Steril Doku Kültürü Plakası</td><td>FisherSci</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nükleik Asit Jel Lekesi (10.000x)</td><td>FisherSci</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>U2OS hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>UVP&nbsp; HB-1000 Hibridizasyon İnkübatörü</td><td>FisherSci</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr></tbody></table>

nötr kuyruklu yıldız deneyi ile İnsan hücrelerini bölmede dna kırılmalarının tespiti

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

DNA replikasyonu, DNA'ya zarar verebilecek çok çeşitli endojen ve eksojen stresörler tarafından sürekli olarak sorgulanmaktadır. Genom duplikasyonu sırasında karşılaşılan bu tür lezyonlar, replizomları durdurabilir ve replikasyon çatallarını çift iplikli kırılmalara dönüştürebilir. Onarılmadığı takdirde, bu toksik DNA kırılmaları kromozomal yeniden düzenlemeleri tetikleyebilir, bu da genom kararsızlığının artmasına ve hücresel dönüşüm olasılığının artmasına neden olabilir. Ek olarak, kanser hücreleri kalıcı replikasyon stresi sergiler ve bu da tümör hücrelerindeki replikasyon çatalı güvenlik açıklarının hedeflenmesini kemoterapi için çekici bir strateji haline getirir. Replikasyon sırasında DNA kırılmalarını incelemek için çok yönlü ve güçlü bir teknik, kuyruklu yıldız testidir. Bu jel elektroforez tekniği, tek hücre düzeyinde DNA kırılmalarının indüksiyonunu ve onarımını güvenilir bir şekilde tespit eder. Burada, araştırmacıların, birden fazla hücre tipinde çatal durdurucu ajanlar kullanarak insan hücrelerini mitotik olarak bölmedeki DNA hasarının derecesini ölçmelerine olanak tanıyan bir protokol özetlenmiştir. Bunu otomatik kuyruklu yıldız puanlaması ile birleştirmek, hızlı analizi kolaylaştırır ve DNA kırılmalarının indüksiyonunun incelenmesinde güvenilirliği artırır.

Replikasyon gerilimi reaktifleri ile kırılma indüksiyonunun analizi U2OS hücreleri 4 saat boyunca DMSO, 4 mM hidroksiüre (HU) veya 100 nM CPT ile muamele edildi ve NC testi ile kırılma birikimi açısından analiz edildi (Şekil 6A). CPT, topoizomeraz-113'ü bloke ederek S fazı sırasında kırılmalara neden olurken, HU'nun neden olduğu nükleotid havuzlarının tükenmesi, aşamalı olarak DSB'lere28 dönüştürülen replikasyon çatallarını durdurur. Veriler, HU veya CPT'ye maruz kalmanın, NC testi ile tespit edilebilen S fazında kırılma indüksiyonunu tetiklediğini göstermektedir.
Farklı sıcaklıklarda lizizi karşılaştıran kırılma indüksiyonunun analizi İşlem görmemiş U2OS hücreleri, kırılma indüksiyonu analizlerinden önce oda sıcaklığında (RT) veya 4 ° C'de lizis tamponunda inkübe edildi (Şekil 6B). Sonuçlar, lizisin gerçekleştirildiği sıcaklığın, tahlildeki kuyrukların göçü üzerinde minimum etkiye sahip olduğunu göstermektedir.
Hidroksiüre (HU) ile kırılmaların zamansal analizi U2OS hücreleri, NC testi ile kırılma indüksiyonu analizlerinden önce 4 saat ve 8 saat boyunca tedavi edilmeden veya 4 mM HU ile muamele edildi (Şekil 7). Sonuçlar, HU ile çoğaltma çatallarının uzun süre durmasının, çoğaltma çatalının DSB'lere çökmesine neden olduğunu göstermektedir.
Kamptotezin ile kırılmaların doza bağlı analizi U2OS hücreleri, 1 saat boyunca artan CPT dozları ile muamele edildi ve NC testi kullanılarak kırılma analizleri için hasat edildi (Şekil 8). CPT ile tedavi edilmeyen hücrelerde kırılma birikimi minimal iken, kırılma indüksiyonunun derecesi, artan CPT dozu ile kademeli olarak artar, böylece DNA replikasyonu sırasında kırılma birikimi üzerindeki doza bağlı etkilerin incelenmesinde testin faydasını gösterir.
Birden fazla hücre tipindeki kırılmaların karşılaştırmalı analizi DNA kırılmalarının bazal seviyeleri, hTERT ölümsüzleştirilmiş retina pigment epitel hücreleri (hTERT-RPE-1), simian virüsü 40 (SV40), insan embriyonik böbrek hücrelerini (HEK293T) ve kemik osteosarkom hücrelerini (U2OS) eksprese eden büyük T-antijeni olmak üzere üç farklı mitotik hücre tipinde değerlendirildi (Şekil 9). Her hücre hattı, hücre döngüsü dağılımı, kromatin organizasyonu veya aktif replikasyon çatallarının sayısındaki farklılıklardan kaynaklanabilecek ilave replikasyon stresinin yokluğunda kuyruk momentlerinin diferansiyel göçünü gösterdi. Her hücre tipi, replikasyona bağlı DNA kırılmalarındaki artışı doğrulamak için 1 saat boyunca 1 μM CPT'ye maruz bırakıldı.
AC testi ile kırılma indüksiyonu analizleri U2OS hücreleri DMSO, 4 mM HU, 1 μM CPT veya 10 μM PARP inhibitörü (PARPi) Olaparib ile tedavi edildi ve kırılma indüksiyonu için analiz edildi (Şekil 10). Hücreler 2 saat DMSO, HU ve PARPi ile tedavi edilirken, CPT tedavisi 1 saat sürdü. Sonuçlar, replikasyon stresine maruz kalmanın, AC testi tarafından gözlemlenebilen kırılma birikimine neden olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig01.jpg"> Şekil 1: NC testinin şematik gösterimi. (A) Gerekli sayıda hücre, 6 oyuklu bir tabakta bir gün önce ekilir. (B) İlaç tedavilerinden sonra, hücreler tripsinizlenir ve soğuk PBS'de hasat edilir. (C) Hücreler, bir pipet ucu kullanılarak 10:1 oranında (1 μL hücre süspansiyonu için 10 μL agaroz) erimiş agaroz içinde nazikçe yeniden süspanse edilir. (D) Hücre süspansiyonu, bir pipet ucu kullanılarak bir kayar kuyucuk üzerine aktarılır ve kuyu yüzeyini tamamen agaroz ile kaplamak için düzgün bir şekilde yayılır. (E) 4 ° C'de inkübasyonun ardından, slaytlar lizis tamponuna daldırılır, ardından soğuk 1x TAE tamponu uygulanır. (F) Numuneler, uygun aparat kullanılarak elektroforez işlemine tabi tutulur. (G) Slaytlar daha sonra DNA çökeltme çözeltisine daldırılır, ardından p'lik bir etanol çözeltisi uygulanır. (H) Kuruduktan sonra, kuyucuklar 1x SYBR Green çözeltisi ile boyanır. (I) Slaytlar bir epifloresan mikroskobu kullanılarak görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig02.jpg"> Şekil 2: Kuyruklu yıldız kayma kuyuları üzerindeki agarozun yandan görünümü. (A) 4 °C'de inkübasyondan sonra (adım 3.8), katılaşmış agaroz dışbükey bir şekle sahip bir 'kabarcık' olarak görünür. (B) 45 °C'de kurutulduktan sonra (adım 5.3), agaroz kuyucuk üzerinde düzleşmiş olarak görünür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig03.jpg"> Şekil 3: Kuyruklu yıldızların görüntülenmesi ve analizi. (A) Kuyunun iç çemberi içindeki kuyruklu yıldızlar (mavi ile vurgulanmıştır) analiz için seçilir. Kuyunun dış kenarına doğru olan kuyruklu yıldızlar, alışılmadık derecede uzun kuyruk momentleri nedeniyle dışlanır ve bu da onları aykırı değerler olarak işaretler. (B) Mavi renkli bölgeden en az 100 temsili kuyruklu yıldız rastgele seçilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig04.jpg"> Şekil 4: NC testinden elde edilen kuyruklu yıldızların temsili görüntüsü. Sağ panel, SYBR Yeşil lekeli çekirdekler için temsili bir görüş alanı gösterirken, sol panel kuyruklu yıldızları puanlamak için kullanılan bölgeyi (yeşil anahat) vurgular. Kısmen görülebilen veya birbirine yakın yığılmış çekirdekler (kırmızı anahat, sağ panel) analize dahil edilmez. Puanlama için seçilen kuyruklu yıldızlar ayrı ayrı ayırt edilebilir olmalı, tamamen görüş alanı içinde yer almalı ve tek tip boyama yoğunluğu sergilemelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig05.jpg"> Şekil 5: NC testinden elde edilen kuyruklu yıldızların temsili puanlaması. (A) Bireysel çekirdekler CometScore yazılımı kullanılarak özetlenmiştir. (B) Tam spektrum görünümü (sol panel) etkinleştirilir ve eşik (kesme çubuğu) minimum arka planla optimum sinyal yoğunluğunu elde etmek için ayarlanır. 'Tam spektrum' sinyali, 'tek renk tonu' görüntüsüne (üst resim, sağ panel) karşılık gelmeli ve anahattı aşmamalıdır (alt resim, sağ panel). (C) Kutudaki dikey sarı çizgi, kuyruklu yıldız kafasının merkeziyle hizalanır ve kuyruklu yıldız kafasının en geniş kısmı tutarlılık için bir referans olarak kullanılır. (D) Analiz edilen her kuyruklu yıldızın puanı sağ üst köşede rapor edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig06.jpg"> Şekil 6: Replikasyon gerilimi reaktifleri ile kırılma indüksiyonunun analizi. (A) U2OS hücreleri, kırılma indüksiyon analizinden önce DMSO, 100 nM kamptotekin (CPT) veya 4 mM hidroksiüre (HU) ile muamele edildi. Temsili grafik, CPT veya HU ile tedavi edilen hücrelerde artan kırılma birikimini göstermektedir. (B) İşlem görmemiş U2OS hücreleri, kuyruklu yıldız slaytları üzerine ekildi ve lizis sıcaklığının etkisini karşılaştırmak için oda sıcaklığında (RT) veya 4 ° C'de lizis (adım 3.9) için inkübe edildi. Analizlerden elde edilen kuyruk momentleri, 10-90 yüzdebirlik değerleri gösteren kutu ve bıyık grafikleri olarak çizilir ve medyan değerler kutuların içinde yatay çizgilerle temsil edilir. P değerleri, Dunn'ın çoklu karşılaştırmaları ile Kruskal-Wallis testi kullanılarak hesaplandı (kesme p değeri 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig07.jpg"> Şekil 7: Hidroksiüre tarafından indüklenen kırılmaların zamansal analizi. U2OS hücreleri, kırılma indüksiyon analizinden önce 4 saat veya 8 saat boyunca ya tedavi edilmedi ya da 4 mM HU ile muamele edildi. Temsili grafik, HU ile tedavi edilen hücrelerde kırılma birikiminde kademeli bir artışı göstermektedir. Analizlerden elde edilen kuyruk momentleri, 10-90 yüzdebirlik değerleri gösteren kutu ve bıyık grafikleri olarak çizilir ve medyan değerler kutuların içinde yatay çizgilerle temsil edilir. P değerleri, Dunn'ın çoklu karşılaştırmaları ile Kruskal-Wallis testi kullanılarak hesaplandı (kesme p değeri 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig08.jpg"> Şekil 8: Kamptothecin tarafından indüklenen kırılmaların doza bağlı analizi. U2OS hücreleri, kırılma analizinden önce 1 saat boyunca DMSO veya artan CPT konsantrasyonları (25 nM, 100 nM, 500 nM ve 1 μM) ile muamele edildi. Analizlerden elde edilen kuyruk momentleri, 10-90 yüzdebirlik değerleri gösteren kutu ve bıyık grafikleri olarak çizilir ve medyan değerler kutuların içinde yatay çizgilerle temsil edilir. Temsili grafik, CPT'nin neden olduğu kırılmalarda doza bağlı bir artış göstermektedir. P değerleri, Dunn'ın çoklu karşılaştırmaları ile Kruskal-Wallis testi kullanılarak hesaplandı (kesme p değeri 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig09.jpg"> Şekil 9: Birden fazla hücre tipindeki kırılmaların karşılaştırmalı analizi. hTERT-RPE-1, HEK293T ve U2OS hücreleri 1 saat boyunca DMSO veya 1 μM CPT ile tedavi edildi. Temsili grafik, CPT'nin varlığında veya yokluğunda üç hücre tipi boyunca DNA hasarının göreceli derecesini gösterir. Analizlerden elde edilen kuyruk anları, 10-90 yüzdelik değerleri gösteren kutu ve bıyık çizimleri olarak çizilir ve medyan değerler kutuların içindeki yatay çizgilerle temsil edilir. P değerleri, Dunn'ın çoklu karşılaştırmaları ile Kruskal-Wallis testi kullanılarak hesaplandı (kesme p değeri 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig10.jpg"> Şekil 10: AC tahlili ile kırılma indüksiyonunun analizi. U2OS hücreleri, kırılma indüksiyon analizinden önce DMSO, 4 mM HU, 1 μM CPT veya 10 μM PARP inhibitörü Olaparib ile tedavi edildi. Hücreler 2 saat boyunca DMSO, HU ve PARP inhibitörü ile tedavi edilirken, CPT tedavisi 1 saat sürdü. Temsili grafik, CPT, HU veya PARP inhibitörleri ile tedavi edilen hücrelerde artan kırılma birikimini göstermektedir. Analizlerden elde edilen kuyruk momentleri, 10-90 yüzdebirlik değerleri gösteren kutu ve bıyık grafikleri olarak çizilir ve medyan değerler kutuların içinde yatay çizgilerle temsil edilir. P değerleri, Dunn'ın çoklu karşılaştırmaları ile Kruskal-Wallis testi kullanılarak hesaplandı (kesme p değeri 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Çalışma çözümü</td>
		</tr><tr><td>Lizis Tamponu</td>
			<td>% 0.5 SDS, 200 mM Tris-Cl (pH 7.4), 50 mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>1x TAE Tamponu</td>
			<td>40 mM Tris baz, 20 mM Asetik asit, pH 8.45'te 1 mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>DNA Çökeltme çözeltisi</td>
			<td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Bu protokol, DNA replikasyonu sırasında meydana gelen DNA hasarının derecesini araştırmak için tasarlanmıştır. Nötr koşullar altında, DNA kırılmalarının indüksiyonu kısa bir zaman dilimi içinde kolayca değerlendirilebilir. Ek olarak, protokol diğer hücre tiplerine ve çeşitli replikasyon stres reaktiflerine uyarlanabilir.

Nötr Kuyruklu Yıldız Deneyi ile İnsan Hücrelerini Bölmede DNA Kırılmalarının Tespiti

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

detection-of-dna-breaks-in-dividing-human-cells-by-neutral-comet-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Video, zararlı ajanlara maruz kaldıktan sonra DNA hasarını tespit etmek için kuyruklu yıldız testini göstermektedir. Alkali koşullar altında, DNA gevşer ve denatüre olur ve elektroforez üzerine, hasar görmemiş ve hasar görmüş DNA, agaroz jeli içinde farklı şekilde göç ederek kuyruklu yıldız şeklinde bir yapı oluşturur. Yavaş göç eden hasarsız DNA, dairesel kuyruklu yıldız kafasını oluştururken, hızla göç eden hasarlı DNA parçaları, uzun kuyruklu yıldız kuyruğunu oluşturur.

Hücrelerde DNA Hasarı Tespiti için Comet Deneyi

Comet assay alkali labil siteleri ve hipokampal nöronlar da dahil olmak üzere tüm hücrelerde DNA üzerinde DNA-DNA/DNA-protein çapraz bağlantılar dahil tek ve çift zincir kırıkları, tespit etmenin en etkin yoludur. Yöntem DNA hasar miktarının farklılıklara bağlı olarak, bir elektrik alanı içinde DNA diferansiyel göç yararlanır.

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

Biz burada görülmemiş verimlilik ile DNA hasarı kuyrukluyıldız tahlil tespiti sağlayan bir platform açıklar. Cihaz desenler mikroarreylerinin içine memeli hücreleri ve 96 örneklerinin paralel işleme sağlar. Yaklaşımı temel düzeyde DNA hasarı, pozlama kaynaklı DNA hasarı ve DNA onarım kinetik analizini kolaylaştırır.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

Kuyruklu yıldız tahlil tek ve çift iplikçikli DNA içeren DNA hasarı tatili algılamak için verimli bir yöntemdir. Kemoterapi tedavi edici etkisini değerlendirmek için kanser hücrelerinin DNA hasarı ölçmek için alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri tarif.

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

Bu protokol, DNA hasarı değerlendirmek için kuyruklu yıldız testinde kullanılmak üzere nekropsi sırasında yüksek kaliteli dondurulmuş doku örnekleri hazırlamak için çeşitli prosedürler açıklar: 1) kıyılmış doku, 2) gastrointestinal sistemden kazınmış epitel hücreleri, ve 3) küp doku bir doku kıyma cihazı kullanarak homojenizasyon gerektiren örnekler.

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

Burada, lezyon indüksiyonundan sonra DNA'nın kopyalanmasında tek sarmallı DNA boşluklarını araştırmak için DNA lif testinin iki modifikasyonunu açıklıyoruz. S1 fiber testi, ssDNA'ya özgü S1 endonükleazı kullanarak replikatif sonrası boşlukların tespit edilmesini sağlarken, boşluk doldurma testi, boşluk onarımının görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine izin verir.

DNA Fiber Testi Kullanılarak İnsan Hücrelerinde Replikasyon Sonrası Boşlukların Birikmesi ve Onarımının Tespiti

Kuyruklu yıldız tahlili, DNA hasarını tespit etmenin popüler bir yoludur. Bu çalışma, kuyruklu yıldız testinin temsili varyantlarında slaytları çalıştırmaya yönelik bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, numune sayısını önemli ölçüde artırırken, tahlil çalışma süresini, slayt manipülasyonlarının sayısını ve jellere zarar verme riskini azalttı.

Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Bu protokol, kuyruklu yıldız tahlilinin uygulanması yoluyla FLT3 mutant hücrelerinde tip I ve tip II inhibitörlerin neden olduğu DNA hasarındaki farkı ölçmek için etkili bir yöntemi açıklamaktadır.

Tip I ve Tip II FLT3 İnhibitörlerine Maruz Kaldıktan Sonra FLT3 Mutant Eksprese Eden 32D Hücrelerde DNA Hasarını Ölçmek için Kuyruklu Yıldız Testi

"E-DNA" sensörleri, reagentless, kan ve diğer karmaşık matrisler doğrudan meydan bile iyi bir performans elektrokimyasal biyosensörler, nükleik asit, protein ve küçük molekül analitler geniş bir algılama için adapte edilmiştir. Burada bu tür sensörlerin üretimi ve kullanımı için genel bir prosedür mevcut.

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

Biz topoizomeraz bir protein tarafından desteklenmektedir moleküler ölçekli cihaz montaj ve uygulama göstermektedir. Inşa uçları iki farklı fluorophores ekleyerek doku kesitlerinde DNA kırıkları başlıca iki tipi etiketler moleküler biyo-sensör.

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Keşfedin nötr kuyruklu yıldız deneyi ile insan hücrelerinde DNA kırılmalarının tespitini. Bu yöntem replikasyon stresi altında kromatin remodelleme ve genom stabilitesi araştırmalarında kullanılır.

Nötr Kuyruklu Yıldız Deneyi ile İnsan Hücrelerini Bölmede DNA Kırılmalarının Tespiti

Daha fazla video keşfet