Proteinle İlgili Yeni DNA Zincirlerinin Zenginleştirilmesi ve Dizilenmesi Yoluyla Proteinlerin Zincire Özgü Analizi
2 Mayıs 2025
Proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın zenginlenmesi ve dizilenmesi (eSPAN), iki çoğalan DNA zincirinde kromatin ilişkili proteinin göreceli bolluğunu tespit etmek için geliştirildi ve böylece kromatin replikasyonu ve bağlı süreçler hakkında moleküler içgörüler ortaya çıktı. Bu protokol, maya ve fare embriyonik kök (ES) hücrelerinde eSPAN prosedürlerini tanımlar.
Araştırmamız epigenetik kalıtım mekanizmasına odaklanmaktadır. Spesifik olarak, DNA replikasyonu, epigenetik kalıtımda ilk yayma adımını temsil eden ebeveyn histon geri dönüşüm sürecini birleştirdi. DNA replikasyonunda yer alan çoklu ebeveyn histon birikiminin ebeveyn histon geri dönüşümünde önemli rol oynadığı tespit edilmiştir.
Bu, D helikaz kompleksi, DNA polimeraz ve koruma kompleksi için replikasyonu içerir. Geleneksel genetik ve biyokimyasal yaklaşımlar bu araştırma alanında kullanılan değerler olmuştur. Geleneksel olarak, ebeveyn histon transfer sürecini anlamak için yüksek verimli dizileme yöntemleri kullanılmaktadır.
Proteinle ilişkili DNA'nın zenginleştirilmesi ve dizilenmesi veya deney yöntemi geliştirilmeden önce, ebeveyn histon transfer sürecini incelemek zordu. Deney yöntemi, bu temel soruları ele almak için güçlü bir araç sağladı. Başlamak için, maya hücresi peletlerini törpüleyin ve hafif girdaplama ile yeniden askıya alın.
Daha sonra aynısını proteaz inhibitörleri içeren 0.4 mililitre CHIP lizis tamponu ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için bir antibiyotik karışımı ile yıkayın. Karışımı bir dakika boyunca 5.000 G'de santrifüjleyin. Daha sonra, pelete proteaz inhibitörleri ve antibiyotik karışımı içeren 0.1 mililitre CHIP lizis tamponu ekleyin.
Bunu yaklaşık 100 mikrolitre 0,5 milimetre cam boncuk takip ediyor. Hücreleri, dört santigrat derece soğuk odada üç döngü boyunca boncuk boncuk ile parçalayın. 16 gauge sıcak iğne kullanarak tüpün altına delikler açın.
Delinmiş tüpü 1.5 mililitrelik boş bir DNA düşük bağlayıcı tüpe yerleştirerek lizatı toplayın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 1.600 G'de santrifüjleyin. Peletleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre kalıntısı fraksiyonu kromatini içerecektir.
0.35 mililitre takviye edilmiş Mikrokok nükleaz veya MNaz sindirim tamponu içinde pipetleyerek hücre peletlerini yeniden süspanse edin. Ardından, süspansiyona 10 birim MNase ekleyin. Dört ila altı kez ters çevirerek nazikçe karıştırın ve 37 santigrat derece su banyosunda 20 dakika inkübe edin.
10 milimolar nihai konsantrasyona beş mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyerek MNase sindirimini söndürün. Ters çevirerek hafifçe karıştırın ve tüpü en az 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. 1.5 mililitre Bioruptor mikrotüpleri kullanarak, reaksiyon karışımını 30 saniye açık ve 30 saniye kapalı döngülerle üç dakika boyunca yüksek güçte sonikleştirin.
Ardından, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı yeni tüplere aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 G'de tekrar santrifüjleyin. Ardından, süpernatanın yaklaşık 400 mikrolitresini toplayın.
DNA ekstraksiyonu için giriş DNA'sı olarak 30 mikrolitre kaydedin ve eksi 20 santigrat derecede dondurun. Histon kromatin immünopresipitasyonu için kalan 370 mikrolitre hücre lizatını kullanın. Başlamak için, daha önce elde edilen girdi ve H3K4me3 CHIP numunelerinin yaklaşık 150 mikrolitresini 100 santigrat derecelik bir ısı bloğunda kaynatın Beş dakika boyunca, numuneyi hemen beş dakika buz üzerinde soğutun.
Ardından, belirtilen bileşenlerden gerekli miktarda numuneye ekleyin. Numuneyi dört santigrat derece ve 10 RPM'de bir rotor üzerinde iki saat boyunca mutasyona uğratın. Karışımı, 20 mikrolitre yıkanmış protein G Sefaroz boncukları içeren 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Karışımı, rotor üzerinde 10 RPM'de dört santigrat derecede bir saat boyunca mutasyona uğratın. Tüpleri oda sıcaklığında 800 G'de bir dakika döndürün. Boncukları bir mililitre soğuk Bromo-deoksiuridin veya her yıkama için üç dakika döndüren BrdU immünopresipitasyon tamponu ile üç kez yıkayın.
Tüpü tekrar santrifüjleyin ve üç dakika boyunca bir mililitre TE tamponu ile yıkayın. Tüpleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 800 G'de tekrar döndürün ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Boncuklara %1 SDS içeren 100 mikrolitre TE tamponu ekleyin.
Karışımı 65 santigrat derecede beş dakika inkübe edin, ardından oda sıcaklığında bir dakika boyunca 800 G'de döndürün. BrdU immünopresipitasyon ve H3K4me3 eSPAN örneklerini elde etmek için DNA saflaştırma kolonlarını kullanarak süpernatanı 18 mikrolitre elüsyon tamponuna saflaştırın. Tek sarmallı DNA kitaplığını, ssDNA ve düşük girdili DNA kitaplığı hazırlama kiti kılavuzunu izleyerek belirtilen örneklerle hazırlayın.
Ligasyon ürününü 20 mikrolitre düşük EDTA'lı Elüsyon tamponuna saflaştırın. Tek sarmallı DNA kütüphanesi hazırlama kitinden 50 mikrolitre reaksiyon karışımı kullanarak DNA kütüphanesini çoğaltın. Görüntülenen döngüyü takiben, PCR karışımını yükseltin.
PCR ürünlerini, önceden 30 santigrat dereceye ısıtılmış 60 mikrolitre boncukla karıştırarak saflaştırın. PCR ürünlerini ve boncukları iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika bekletin.
Boncukları manyetik bir standa üç dakika boyunca bağlayın ve 200 mikrolitre taze hazırlanmış% 80 etanol ile iki kez yıkayın. Boncukları iki dakika havayla kurutun ve DNA'yı DNA kütüphanesi hazırlama kitinde sağlanan 20 mikrolitre düşük EDTA'lı tampona seyreltin. Yüksek çözünürlüklü elektroforez sistemlerini kullanarak kütüphane konsantrasyonunu ve parça boyutu dağılımını ölçün.
Paralel eşleştirilmiş uç dizileme gerçekleştirmek için giriş H3K4me3 kromatin immünopresipitasyonu, BrdU immünopresipitasyonu, eSPAN örnekleri dahil olmak üzere eşit miktarda bireysel kitaplığı bir araya getirin. H3K4me3 eSPAN'ın DNA dizileme kütüphanesinin tipik bir jel analizi, bir kromatin nükleozom merdiven modeli ortaya çıkardı. Ana mononükleozom bandı, adaptörlerin sindirimden elde edilen DNA parçasına eklendiği 270 baz çiftinde ortaya çıktı.
Farklı numune haritalaması, vahşi tip ve mcm2-3A hücrelerinde orijini otonom olarak kopyalayan 607 dizisini çevreleyen bireysel nükleozomlarda zirveler ortaya çıkardı. Ortalama iplik yanlılığı, yabani tip maya hücrelerinde, ebeveyn histon birikiminin, gecikmeli ipliğe doğru hafif bir eğilim sergilediğini ortaya koydu. Bununla birlikte, mutant ebeveyn histonunda H3H4 önde gelen ipliğe aktarıldı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu araştırma, epigenetik mirasın mekanizmasını ele alır ve özellikle DNA replikasyonu sırasındaki ana histon geri dönüşüm sürecine odaklanır. Maya ve fare embriyonik kök hücreleri kullanarak, çalışma histon birikimi analizini gerçekleştirmek için proteine bağlı yeni oluşan DNA'nın (eSPAN) zenginleştirilmesi ve sekanslamasını kullanır. Bu yaklaşım, kromatin replikasyon dinamikleri hakkında önemli bilgiler ortaya koyar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Epigenetik miras
- DNA replikasyonu sırasında histon geri dönüşümü
- Kromatin dinamiği
Arka Plan
- Ana histon geri dönüşümü, epigenetik mirasın temel bir adımıdır.
- Çalışma, helikaz kompleksleri ve DNA polimerazları da dahil olmak üzere bu süreçteki kilit oyuncuları tanımlar.
- Geleneksel yöntemlerin eSPAN'ın etkili bir şekilde ele aldığı sınırlamaları vardır.
Kullanılan Yöntemler
- Proteine bağlı yeni oluşan DNA'nın (eSPAN) zenginleştirilmesi ve sekanslama.
- Model organizmalar arasında maya ve fare embriyonik kök hücreleri bulunur.
- Veri analizi için yüksek verimli sekanslama teknolojileri kullanılır.
Ana Sonuçlar
- Yabani tip mayada, gecikmeli iplik yönünde ana histon birikimi mekanizmasını ortaya çıkarmıştır.
- Otonom olarak replike olan sekansları çevreleyen farklı nükleosom desenlerini belirlemiştir.
- Tanımlanan proteinlerin histon transfer süreçlerindeki rollerini doğrulamıştır.
Sonuçlar
- Çalışma, kromatin replikasyonu ve epigenetik etkileri hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
- Bulgular, epigenetik miras mekanizmalarını açıklayarak daha geniş moleküler biyoloji alanına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Strand-specific analysis of protein association at replicating DNA strands enables precise mapping of chromatin protein dynamics during genome duplication. The eSPAN method provides actionable insights into the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage. This capability is critical for biopharma R&D teams seeking to reduce biological ambiguity and improve risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin protein function and localization at replication forks.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying protein strand preference during DNA synthesis.
- Facilitates functional target validation for chromatin-associated proteins implicated in genome stability.
- Provides predictive confidence for advancing epigenetic targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chromatin systems for downstream screening of modulators affecting replication-coupled processes.
- Delivers quantitative, strand-specific readouts for robust assay development.
- Enables reproducible measurement of protein-DNA interactions across experimental conditions.
- Supports scalability and platform reuse for high-throughput screening initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin protein dynamics with disease-relevant models when studying genome maintenance pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation for epigenetic and DNA repair targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking mechanistic findings to translational endpoints.
- Enhances predictive de-risking for chromatin-targeted therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The eSPAN method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target identification and functional characterization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of chromatin protein function at replication forks and clarifies pathway involvement in DNA replication and repair.
- Screening: Provides quantitative, strand-specific outputs for assay readiness and reproducibility.
- Analytics: Delivers high-resolution measurements of protein enrichment on leading versus lagging strands, supporting comparative analyses.
- Translational Research: Connects mechanistic chromatin insights to disease-relevant systems when supported by model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for mapping protein-DNA interactions in diverse chromatin contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin biology.
- Operational Value: Standardizes strand-specific protein analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target function early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chromatin and DNA repair targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin immunoprecipitation, CUT&Tag, and next-generation sequencing workflows.
- Demands access to high-resolution sequencing and analytical infrastructure for strand-specific data analysis.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data interpretation protocols.
- May require adaptation for different model systems or protein targets based on chromatin context.
- Dependent on robust BrdU labeling and immunoprecipitation efficiency for optimal results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:08
Yeast Cell Lysis and Chromatin Fragmentation for Histone Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
4:10
Bromodeoxyuridine (BrdU) Immunoprecipitation Following Histone ChIP and DNA Extraction
6:07
Single-Stranded DNA Library Preparation and Sequencing
7:56
Representative Results
