Name: Proteinle İlgili Yeni DNA Zincirlerinin Zenginleştirilmesi ve Dizilenmesi Yoluyla Proteinlerin Zincire Özgü Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Öğrenin, eSPAN yöntemiyle maya ve fare embriyonik kök hücrelerinde epigenetik kalıtım mekanizmalarını ve histon geri dönüşüm süreçlerini nasıl analiz edebilirsiniz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) ve Hormel Startup Fund (C.Y.) hibeleri tarafından desteklendi.

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Önde ve gecikmeli replikasyon zincirleriyle ilişkili proteinlerin tespiti, kromatin replikasyon mekanizmalarını ve ilişkili süreci anlamak için önemlidir; bu mekanizmalar insan kanseri araştırmaları ve ilaç direnci mekanizmalarıyla doğrudan ilgilidir. 2D jel, yerli Kromatin immünopresipitasyonu (nChIP), iPOND ve yeni başlayan kromatin yakalama 29,30,31 gibi çeşitli yöntemler, DNA çoğaltımı ve DNA onarımı gibi ilgili süreçleri in...

Ökaryot organizmalarda, genom çoğaltması, replikasyon kökenleri adı verilen birden fazla bölgeden başlatılır; burada köken tanıma kompleksi (ORC) CMG helikazını da dahil olmak üzere toplama protein mekanizmasına bağlanır ve başlatarak DNAreplikasyonunu başlatır. Her replizom başlangıcındaki replisome mekanizması, iki yönlü hareket eden iki replikasyon çatalıoluşturur 2,3. İkiz replikasyon çatalları, öncü zincirin sürekli sentezi ve gecikmeli zincirin kesintisiz sentezi yoluyla DNA'nın iki ana zincirini çoğaltır. Her replikasyon çatalının bu asimetrik yapısı göz önüne alındığında, öncü ve gecikmeli ipliklerdeki DNA polimerazları dahil olmak üzere çoğaltma bileşenleri farklıdır. Mutant DNA polimerazlara dayalı önceki genetik analizler, DNA Pol ε ve DNA Pol δ'nin iplik çoğalmasını önde ve gecikmeli olarak sorumlu başlıca polimerazlar olduğunugöstermektedir 4,5. DNA polimerazının iplik tercihini tespit etmek için Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 ve emRiboSeq veya RiboSeq 9,10 gibi çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Zincir özgüllüğünü disseksiye yönelik bu genetik yöntemler, DNA polimerazlarla sınırlıdır ve herprotein 4,5,11,12 üzerinde mutasyonların getirilmesini gerektirir. Herhangi bir hedef proteinin önde gelen ve geciken DNA replikasyon çatalları zincirleriyle ilişkisini izlemek, DNA çoğaltımı hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır. Bu çabada, maya hücrelerinde önce eSPAN tekniğini (proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın zenginleştirmesi ve dizilenmesi, Şekil 1) geliştirdik. Bir temel kanıt çalışması olarak, önce Pol δ ve Pol δ'nin sırasıyla önde ve gecikmeli ipliklerde zenginleştiğini gösterdik. Ayrıca, replikatif DNA helikazı, tek zincirli DNA bağlayıcı protein (replikasyon proteini A) ve çoğalan hücre nükleer antijeni (PCNA) lambası ile yükleyici replikasyon faktörü C (RFC)13 dahil olmak üzere önemli DNA replikasyon bileşenlerinin iplik tercihini de ortaya çıkardık. Önemli olarak, biz ve diğerleri bu yöntemi ebeveyn histon transferi mekanizmalarını ortaya çıkarmak için kullandık; bu süreç 4 on yılı aşkın süredir çözülemezdi(14,15,16,17).
eSPAN yöntemi iki ardışık adımdan oluşur: hedef proteinin ChIP18 veya CUT&Tag19 ile zenginleştirilmesi ve proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın BrdU immünopresipitasyonu ile zenginlenmesi. Standart bir maya suşunda (W303 veya S288C), ekstrasellüler BrdU veya EdU hücrelere girip kromozomlara dahil olamaz. Bu suşlar, timidin alımı için uygun bir nükleozid taşıyıcıya ve timidini TMP'ye fosforile getirmek için gereken timidin kinazına sahip değildir; bu da BrdU'yu (veya EdU) BrdUMP'ye (EdUMP) dönüştürür. İnsan dengeleyici nükleozid taşıyıcısı 1 (hENT1) ve herpes simpleks virüsü timidin kinazın (HSV-TK) ekspresyonu timidin alımını ve BrdU'nun (veya EdU) BrdUMP'ye (EdUMP)20'ye dönüşümünü artırır. Bu nedenle, eSPAN deneyini maya üzerinde yapmak için suşların BrdU-Dahil (BrdU-Inc) yapısı (HSV-TK ve hENT1)13,21 ile yerleştirilmesi gerekiyordu.
Daha önce, maya22'deki DNA replikasyon proteinleri için eSPAN protokolünü sağlamıştık. Son zamanlarda, CUT&Tag yöntemini memeli hücrelerinde eSPAN protokolüne entegre ettik; böylece çapraz bağlama, kromatin kesme gibi optimizasyon gerektiren teknik olarak zor adımları ele aldık ve başlangıç hücre sayısınıen aza indirdik 17,23. Burada, maya hücreleri kullanılarak görselleştirme için histon eSPAN sağladık (Şekil 2). Bu yöntem, esas olarak değiştirilmiş histon formlarının çoğalan DNA zincirlerindeki dağılımını analiz etmek için kullanılır. Birkaç histon işaretini test ederken, örnek olarak ebeveyn histon H3 üzerindeki bir işaret olan H3K4me3'ü kullandık. Replioz bileşenlerini ve DNA onarımında rol alan faktörleri replikasyon çatallarında analiz etmek için, kromatinin sonikasyon kullanılarak küçük parçalara kesilmesini öneriyoruz22. Memeli hücreleri için, maya23'te tanımlanan ChIP adımının yerine değiştirilmiş Cut&Tag prosedürlerini benimsedik. Bu modifikasyon, başlangıç materyali (hücreler) miktarını azaltır ve en önemlisi, tek zincirli DNA hazırlık kitleri kullanmadan dizileme için eSPAN kütüphanelerinin oluşturulmasını sağlar. Mayalama protokolü için, başlangıç malzemesi miktarı yeterli olduğu için Cut&Tag yöntemini kullanmamayı tercih ettik. Daha da önemlisi, Cut&Tag prosedürlerinin elimizdeki maya hücreleri için tutarlı şekilde etkili olmadığını bulduk.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA düşük bağlanma tüpleri&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>10x ampligaz tamponu</td><td>Lucigen</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>BioRad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlid İğnesi</td><td>BD Biosciences</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>ACCEL-NGS 1S VE DNA KÜTÜPHANE KITI</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>10009817</td><td>ssDNA ve düşük girdili DNA kütüphanesi hazırlık kiti&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent 2100 biyoanalizörü&nbsp;</td><td>Çevik</td><td>2100 biyoanalizi</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 kit&nbsp;</td><td>Çevik</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>Ampligase&nbsp;</td><td>Lucigen</td><td>A0110K</td><td>Paraformaldehidi dikkatli kullanın, yanıcı katı ve tehlikeli bir yapımdır.</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP SPRI Reaktifi</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU antikor&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3 antikor&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik hücre sayacı&nbsp;, model TC10</td><td>BioRad</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin Hidroklorür&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B2417</td><td>Yanıcı Katı Maddeler</td></tr><tr><td>BrdU&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>BrdU'yu dikkatli kullanın çünkü potansiyel bir mutajen ve teratozendir.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kuluçka makinesi &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; model Forma serisi II su kaplamalı CO2 kuluçka makinesi</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü ortamı&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre hattı ES-E14&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1422842</td><td>200&ndash; 400 kuru ağ boyutu</td></tr><tr><td>Kloroform&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A (ConA) kaplı manyetik boncuklar&nbsp;</td><td>Çok bilimler</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp; tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Etanolü dikkatli kullanın, yanıcıdır</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td>İzoproponol'ü dikkatle kullanın, yanıcı</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart Hazır Karışımı</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td>KOH ile dikkatli davranın, aşındırıcı</td></tr><tr><td>Düşük hızlı vakum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mıknatıs standı&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient PCR Termal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>mikrokokk nükleaz&nbsp; (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR arıtma kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Mini boncuk vurucu</td><td>Mini BeadBeater 24 Bozucu</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-santrifüj&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Çok platformlu sallayıcı</td><td>Fisherbrand</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>Çok platformlu sarstırıcı kuluçka makinesi</td><td>Kıyaslama</td><td>INCU-SHAKER 10L</td><td></td></tr><tr><td>Çok termal ısı bloğu&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Termomikser C</td><td></td></tr><tr><td>N-[Tris(hidroksimetil)metil]-3-aminopropansülfonik asit&nbsp; (TIKLAMA)</td><td>Sigma</td><td>T5130</td><td>200&ndash; 400 kuru ağ boyutu</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>NaOH'yu dikkatli kullanın, aşındırıcı</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2&times; PCR master mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Igepal CA-630</td><td>Termo Bilimsel</td><td>J61055. AP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldhyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Paraformaldehidi dikkatli kullanın, yanıcı katı ve tehlikeli bir yapımdır.</td></tr><tr><td>pA-Tn5 enzimi &nbsp;</td><td>Addgene</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc</td><td>Sigma</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>Fenol-kloroform-izoamil alkolü&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>Pipet P1000, P200, P20 ve P2</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyl tableti</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyl tableti &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Protein G-sefaroz boncukları&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>Protein çökeltme çözümü</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Protein çökeltme çözümü</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td>KOH ile dikkatli davranın, aşındırıcı</td></tr><tr><td>Protein çökeltme çözeltisi&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR arıtma kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre & nbsp;</td><td>Termo Bilimsel.</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Pol</td><td>New England Biolabs,&nbsp;</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüjü&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>maya ekstraktı&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212730</td><td></td></tr></tbody></table>

proteinle İlgili yeni dna zincirlerinin zenginleştirilmesi ve dizilenmesi yoluyla proteinlerin zincire Özgü analizi

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genom çoğaltması, çift zincirli DNA'yı bireysel antiparalel tek zincirlere ayıran helikazlar dahil olmak üzere repliozom proteinler tarafından organize edilir; bu proteinler çift zincirli DNA'yı ayrı antiparalel tek zincirlere ayırır ve her biri farklı replikasyon modları gerektirir: sürekli (önde) ve kesintili (gecikmeli). Kromatin ile ilişkili proteinlerin in vivo çoğalan DNA zincirleriyle etkileşimlerini anlamak, kromatin montajı ve DNA onarımının DNA çoğalmasına bağlı olarak nasıl etkileşim mekanizmalarını aydınlatmak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, proteinle ilişkili yeni başlayan DNA (eSPAN) zenginleştirme ve dizileme yöntemini sunar; bu yöntem, çoğaltma çatallarındaki yeni ve geride kalan DNA zincirlerinde göreceli protein seviyelerini nicelendirmek için tasarlanmıştır. eSPAN prosedürü, ilgi çekici bir proteinin kromatin immünpresipitasyonu (mayada ChIP) veya hedefler altında bölünmesi ve etiketlenmesi (CUT&Tag; memeli hücrelerinde) ile başlar, ardından proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın bromodeoksiyuridin (BrdU) immünopresipitasyonu ile zenginlenmesi yapılır. İzole edilmiş ssDNA'ya zincire özgü yeni nesil dizileme uygulanır. Bu teknik, bir proteinin önde mi yoksa gecikmeli replikasyon çatallarında zenginleşip zenginleşmediğini belirlemek için kullanılabilir. eSPAN, kromatinle ilişkili proteinlerin genom çapında iplik tercihi sağlar; bunlar arasında replikasyon çatallarındaki histonlar da bulunur.

eSPAN, hedef protein hakkında histonlar ve histon modifikasyonları gibi ipliğe özgü bilgi elde etmek için kullanılabilir. Bu temsilci sonuçta, Şekil 2'de belirtilen şematik izlenerek tomurcu maya sistemi kullanılarak örnek toplama ve eSPAN süreçleri gerçekleştirilmiştir. Örnek tedavisi ve toplama, hidroksiüre ile işlenmiş erken S faz durumuna uygun bu protokolü takip eder. İki maya suşu, WT (vahşi tip) ve mcm2-3A mutantı kullanıldı. DNA helikaz alt birimi MCM2, ebeveyn histon H3-H4 ...

Proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın zenginlenmesi ve dizilenmesi (eSPAN), iki çoğalan DNA zincirinde kromatin ilişkili proteinin göreceli bolluğunu tespit etmek için geliştirildi ve böylece kromatin replikasyonu ve bağlı süreçler hakkında moleküler içgörüler ortaya çıktı. Bu protokol, maya ve fare embriyonik kök (ES) hücrelerinde eSPAN prosedürlerini tanımlar.

Proteinle İlgili Yeni DNA Zincirlerinin Zenginleştirilmesi ve Dizilenmesi Yoluyla Proteinlerin Zincire Özgü Analizi

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

strand-specific-analysis-proteins-at-replicating-dna-strands

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

NGS dizilimi için gDNA zenginleştirme, yapısal mutasyonların incelenmesi için kolay ve güçlü bir araçtır. Bu makalede, DNA hasarının onarımında yer alan 11 genin tam dizisini basitçe analiz etme prosedürünü sunuyoruz.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme BRCA1 BRCA2 ve 9 Genler

Bu protokolde, yeni sentezlenen veya yeni ortaya çıkan DNA ile ilişkili proteinleri ve histon modifikasyonlarını incelemek için yeni bir BrdU-ChIP-Slot-Western tekniğini açıklıyoruz.

Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Burada, Escherichia coli'deki replikasyon çatallarını durdurmak ve çökertmek için bölgeye özgü, geri dönüşümlü in vivo protein bloğu kullanan bir sistemi tarif ediyoruz. Replikasyon bloğunun kurulması floresan mikroskobu ile değerlendirilir ve replikasyon ara ürünlerini görselleştirmek için nötr-nötr 2 boyutlu agaroz jel elektroforezi kullanılır.

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran<i&gt; E. E. coli</i&gt; Bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sisteminin Kullanılması

Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralama genom kopyası geç kopyalayan bölgeleri tanımlamak için birleştirme tekniği tarif.

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım tahlil bir sigara etiketli ve radyo izotopik bir yöntem yüksek çözünürlüklü MALDI-TOF Kütle spektrometresi ve bir tek nükleotid uzantısı strateji kullanarak geliştirilmiştir. Tahlil çok özel, basit, hızlı ve kolay yazım denetleme için gerçekleştirmek ve tamir olmak için 9-nükleotit kısa yamalar kanıtladı.

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

Protein bağlayıcı mikrodizi (PBM) deneyleri biyokimyasal tahlillerle birleşince, şablon DNA üzerinde RNA astarlarını sentezleyen bir enzim olan DNA primazının bağlayıcı ve katalitik özelliklerini birbirine bağlar. Yüksek iş itrifli primase profilleme (HTPP) olarak tanımlanan bu yöntem, çeşitli enzimlerin DNA bağlayıcı desenlerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

ATP'ye bağımlı kromatin remodeler'in DNA ligand ile etkileşimi CD spektroskopisi kullanılarak açıklanmaktadır. Üretilen zirveler tarafından analiz edilen bir gen promotöründeki indüklenen konformasyon değişiklikleri transkripsiyonal regülasyon mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Burada, 2 boyutlu jel elektroforezi kullanarak patojenik, yapıya eğilimli tekrarlar yoluyla replikasyon ilerlemesini analiz etme prosedürünü özetliyoruz.

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Öğrenin, eSPAN yöntemiyle maya ve fare embriyonik kök hücrelerinde epigenetik kalıtım mekanizmalarını ve histon geri dönüşüm süreçlerini nasıl analiz edebilirsiniz.

Proteinle İlgili Yeni DNA Zincirlerinin Zenginleştirilmesi ve Dizilenmesi Yoluyla Proteinlerin Zincire Özgü Analizi

Daha fazla video keşfet