İnsan Eritropoezinin Etkinliğini Değerlendirmek için Kapsamlı Bir Boru Hattı İn Vitro ve Ex Vivo

Araştırmamız lösemi, özellikle miyelodisplastik sendromlar veya miyelodisplastik neoplazi üzerine odaklanmaktadır. Hematopoetik kök hücrelerden köken alan bir kök hücre hastalığıdır. Çeşitli kan hücresi soylarını, özellikle kalp kan hücresi üretiminden sorumlu olan eritroid soyunu etkiler.

Bu soyun bozulması, MDS hastalarında yaygın olarak görülen anemiye yol açabilir. Bu makalede sunduğumuz boru hattı, gen modifikasyonu veya ilaç tedavisi üzerine in vitro olarak insan eritroblast verimliliğini değerlendirmek için sağlam ve basitleştirilmiş bir yönteme izin verir. Hematopoetik kök hücreler doğumdan hayatımızın son anına kadar mevcuttur.

Her gün trilyonlarca hücre üretilen organizmamızda artık çoğalan doku yok. Hala anlaşılması gereken çok şey var, bu yüzden proteostaz ve RNA biyolojisine güçlü bir vurgu yaparak sağlıklı amino dokulardaki bu harika hücreleri incelemeye devam edeceğiz. Başlamak için, şişeyi 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda 30 saniye daldırarak 100.000 CD34 + UCB hücresini çözün.

Şişeye damla damla bir mililitre buz çözme ortamı ekleyin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunu damla damla beş mililitre buz çözme ortamına aktarın. Daha sonra hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 320 G'de sekiz dakika santrifüjleyin.

Hücreleri 10 mililitre floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasında veya DNAse ile FACS tamponunda yıkayın. Hücreleri tekrar santrifüjledikten sonra, peleti iki mililitre stimülasyon ortamında yeniden süspanse edin. İki mililitre hücre süspansiyonunu 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve plakayı 37 santigrat derecede dört ila altı saat inkübe edin.

Daha sonra hücreleri floresanla aktive edilen hücre ayırma tüplerinde toplayın ve bunları bir mililitre kök hücre ortamı ile doldurun. Virüsü çözdükten sonra, 30'luk bir enfeksiyon çokluğu elde etmek için gerekli hacmi stimülasyon ortamına ekleyin. Peletlenmiş hücreleri virüs içeren ortamda 100 mikrolitre virüs başına 100.000 hücre yoğunluğunda yeniden süspanse edin ve bunları 96 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna aktarın.

Boş kuyucuklara PBS ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, 96 oyuklu plakanın kuyusundan tam hacimli hücre süspansiyonunu bir mililitre kök hücre ortamı ile FACS tüplerine aktarın. FACS tüpüne iki mililitre kök hücre ortamı eklemek için kuyuyu ve pipet ucunu kök hücre ortamı ile yıkayın.

FACS tüpünü santrifüjledikten sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini iki mililitre genleşme ortamında yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın ve hücreleri inkübe edin. Başlamak için, EGFP raportörü ile dönüştürülen CD34 + hücrelerinin tam hacmini ayrı bir FACS tüpüne aktarın.

Oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 320 G'de santrifüjleyin. Peletlenmiş hücreleri 100 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Tüp başına beş mikrolitre CD34 antikoru ekleyin ve tüpleri karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra hücreleri DAPI içeren bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 320 G'de sekiz dakika santrifüjleyin. Hücreleri DAPI içeren 200 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse ettikten sonra, hücre süspansiyonunu sıralamadan önce 40 mikrometrelik bir süzgeçten süzün. Daha sonra, 100 mikrolitre PBS'deki bir damla boncuğa 0.5 mikrolitre CD34 antikoru ekleyin.

Karışımı karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Sonra karışıma bir mililitre PBS ekleyin. Oda sıcaklığında 320 G'de sekiz dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve peleti 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, bir FACS tüpüne GFP-negatif ve GFP-pozitif lösemik hücreler ekleyin. Hücreleri bir mililitre FACS tamponunda yıkayın.

Hücreleri santrifüjledikten sonra, her biri 500 mikrolitre FACS tamponunda bulunan 100.000 GFP negatif hücreyi ve 100.000 GFP pozitif hücreyi yeniden süspanse edin. Sıralamadan önce hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir süzgeçten süzün. Daha sonra sıralanan hücreleri kök hücre ortamında toplayın.

Hücreleri oda sıcaklığında 320 G'de sekiz dakika santrifüjleyin. Daha sonra hücreleri üç mililitre eritroid farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Şimdi yeniden askıya alınan hücrelerin bir mililitresini 24 oyuklu bir plakanın üç oyuğuna dağıtın.

Tüm dış kuyuları PBS ile doldurun. Ortamı yenilemek için, hücrelerin plakanın dibine yerleştiğinden emin olun. Plakayı yavaşça eğin ve 500 mikrolitre ortamı çıkarın.

Daha sonra plakayı yenilemek için 500 mikrolitre 2X sitokin eritroid farklılaşma ortamı ekleyin. Altıncı günde, hücreleri 12 oyuklu bir plakaya aktarın ve iki mililitrelik bir son hacme ulaşmak için her oyuğa bir mililitre ortam ekleyin. 12 oyuklu plakanın her bir oyuğundan 200 mikrolitre hücre toplayın.

Çıkarılan hacmi 250 mikrolitre 2X eritroid farklılaşma ortamı ile değiştirin. Her toplama tüpüne bir mililitre FACS tamponu ekleyin. Tüpleri santrifüjledikten sonra, peletlenmiş hücreleri 100 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Tüplere birer mikrolitre CD71, CD34 ve CD235a antikorları ekleyin. Daha sonra hücreleri DAPI içeren bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpleri oda sıcaklığında 320 G'de sekiz dakika santrifüjleyin.

Hücreleri DAPI ile 200 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Ölü hücreleri dışlamak için DAPI'yi yan saçılmaya veya SSC'ye karşı ayarlayın. Agregaları dışlamak ve tek hücreleri seçmek için SSC yüksekliğini SSC alanına karşı ayarlayın.

Boyuta göre kalıntıları kaldırmak için SSCA'ya karşı ileri saçılma alanını ayarlayın. CD235a'yı CD71 ile karşılaştırın. CD34'ü SSCA ile karşılaştırın.

Boncukları GFP pozitif hücreleri ve DAPI lekeli hücreleri çalıştırın. Okumaları telafi edin ve telafiyi sitometre ayarlarına uygulayın. Göbek kordonu kanından elde edilen CD34 pozitif hücreler, Annexin V pozitif apoptotik hücrelerde dördüncü günde% 14.4'ten 17. günde% 34.2'ye bir artış gösterdi.

Çubuk grafik, 17. güne kadar Annexin V-pozitif hücrelerin yüzdesinde önemli bir artış olduğunu ve yaklaşık% 40'a ulaştığını göstermektedir