Name: Mikrobiyolojik Numuneler için Bergmeyer Glikoz Miktar Tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Öğrenin mikrobiyolojik numunelerde Bergmeyer glikoz miktar tayini yöntemiyle glikoz konsantrasyonunu doğru ölçme tekniğini. Bu protokol spesifite ve duyarlılığı artırarak işlem süresini kısaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Çözelti hazırlama
<ol>
	<li>100 mL 0.1 M fosfat tamponu hazırlayın. 1.28 g potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4) ve 0.1304 g dipotasyum fosfat (K2HPO4) tartın ve bunları bir cam behere ekleyin. Şimdi 70 mL deiyonize su (H2Odi) ekleyin ve 1 M hidroklorik asit (HCl) veya potasyum hidroksit (KOH) kullanarak pH'ı 5.5'e ayarlayın. Çözeltiyi hacimsel bir şişeye aktarın ve son hacmi 100 mL'ye ayarlayın. Daha sonra çözeltiyi kehribar rengi bir kaba aktarın ve çözeltiyi 4-8 °C'de 3 aya kadar saklayın. DİKKAT: O-dianisidin dihidroklorür potansiyel olarak kanserojen olduğundan, cilt temasını ve olası kontaminasyonu önlemek için hazırlama işlemi boyunca nitril eldiven giyin.</li>
	<li>% 1'lik bir o-dianisidin dihidroklorür çözeltisi hazırlayın. 0.01 g o-dianisidin dihidroklorür tartın ve 2.0 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. 1.000 mL'lik bir mikropipet kullanarak, bileşiği çözmek için 1.0 mL H2Odi ekleyin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Kabı alüminyum folyoya sararak çözeltiyi ışıktan koruyun ve stabiliteyi korumak için -20 °C'de saklayın. NOT: Analitik terazide ölçüm sırasında tüpün desteklenmesini kolaylaştırmak için ek destek olarak 10 mL'lik bir beher kullanılabilir. Bu, tüpün stabilize edilmesine yardımcı olur ve terazide elde edilen sonuçları değiştirebilecek yer değiştirme veya devrilme riskini en aza indirerek doğru ölçüm sağlar.</li>
	<li>100 mL'lik hacimsel bir şişede, 10 mL fosfat tampon çözeltisi ve ardından 1 mL% 1 v / v o-dianisidin dihidroklorür çözeltisi ekleyin. Ardından,% 0.01 o-dianisidin tampon karışımının nihai konsantrasyonunu elde etmek için son hacmi fosfat tamponu ile 100 mL'ye ayarlayın. Çözeltiyi kehribar bir şişeye aktarın ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın. Solüsyonu 4-8 ° C'de 3-4 aya kadar saklayın. NOT: Soğutma, deneysel ölçümlerin bütünlüğünü tehlikeye atabilecek ayrışmayı önlemek için gereklidir. O-dianisidin-tampon karışımının bozulmasını önlemek için, 13 mL'lik küçük bir kısım (12 numune için yeterli), kullanıma kadar buz üzerinde 14 mL'lik bir plastik tüpe yerleştirilebilir.</li>
	<li>% 50 H2S04 çözeltisi hazırlayın. 30 mL H2Odi içeren 100 mL hacimsel bir şişeyi bir buz banyosuna yerleştirin ve 10 dakika soğumaya bırakın. Daha sonra, çözeltiyi homojenize etmek için dikkatlice çalkalayarak şişenin duvarlarından 51 mL H2S04 (% 98 v / v) yavaşça dökün. Reaksiyon ekzotermik olduğundan (ısı üretir) karışımın soğumasını bekleyin. Son hacmi H2Odi ile 100 mL'ye ayarlayın ve çözeltiyi bir cam kehribar şişeye aktarın. NOT: Çeker ocak kullanın ve tüm güvenlik protokollerine uyun, uygun koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun. Oluşabilecek olası dökülmeleri nötralize etmek için 50 mL @ kalsiyum karbonat solüsyonu hazırlayın.</li>
	<li>0.04 g sodyum asetatı bir beherde 5 mLH2Odi içinde çözerek 50 mM sodyum asetat çözeltisi hazırlayın. Buzlu asetik asit kullanarak pH'ı 5.1'e ayarlayın. Son olarak, H2Odi ile ses seviyesini 10 mL'ye ayarlayın.</li>
</ol>
2. Enzimlerin hazırlanması
<ol>
	<li>2.0 mL'lik steril bir mikrotüpte, 0.01 g glikoz oksidaz ağırlığında ve 10 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1 mL 50 mM sodyum asetat, pH 5.0 ile karıştırın. Tüpü alüminyum folyo ile örtün ve -20 °C'de saklayın. NOT: Çözelti -20 °C'de 2 aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Eq (1) kullanarak her bir plastik küvette (toplam hacmi 1.5 mL olan) istenen enzim aktivitesini elde etmek için gereken enzim çözeltisi V2 hacmini hesaplayın: V1C1 = V2C2, burada V1 1.500 μL, C1 28.5 U enzim aktivitesi ve C2 (enzim çözeltisinin konsantrasyonu) 12.970 U / mL'dir (1 mL'de 10 mg enzim [129.000 birim / g] H2Odi'nin). V2 = (1.500 μL × 28.5 U)/12.970 U = 3.29 μL (1) NOT: Daha doğru pipetleme için değer 3,3 μL'ye yuvarlanabilir.</li>
	<li>Yeni bir 2 mL mikrotüpte, 0.0031 g peroksidaz enzimi tartın ve 3.1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1 mL fosfat tamponu, pH 5.5 ekleyin. Mikrotüpün üzerini alüminyum folyo ile kapatın ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Eq (1) kullanarak küvet başına istenen enzim aktivitesini elde etmek için gereken peroksidaz çözeltisinin hacmini hesaplayın. Toplam 1.500 μL'lik bir küvet hacmi ve 1.25 U'luk bir hedef enzim aktivitesi ile başlayın. Ardından, 1.551 U konsantrasyonu göz önüne alındığında, enzim çözeltisinin gerekli hacmini belirleyin. V2 = (1.500 μL × 1.25 U)/1.551 U = 1.208 μL NOT: Daha doğru pipetleme için değer 1,20 μL'ye yuvarlanmıştır.</li>
</ol>
3. Glikoz standardı
<ol>
	<li>Hacimsel bir şişede 10 mLH2Odi'ye 0.01 g D-glikoz ekleyerek 1 g / L D-glikoz standardı hazırlayın. Konsantrasyonu 0.5 g / L'ye seyreltmek için, 500 μL stok çözeltisini alın ve 1 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için 500 μL H2Odi ile karıştırın. NOT: Bu seyreltme işlemi, doğru standart çözeltiler oluşturmak için gereklidir.</li>
</ol>
4. Standart eğri hazırlama
<ol>
	<li>Yeni bir 2 mL mikrotüp kullanarak, Tablo 1'de belirtilen tamponu ve glikoz hacimlerini ekleyin.</li>
	<li>Kuru termobanyoyu 37 °C'ye ayarlayın. Sıcaklık stabil olduğunda, tüm tüplere 3.3 μL glikoz oksidaz ekleyin ve ardından her tüpe 1.2 μL peroksidaz ekleyin. Tüpleri 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, her bir mikrotüpe hemen 750 μL% 50 H2S04 ( v / v) ekleyin ve karışımı 2 dakika buz banyosunda soğumaya bırakın. Bu, 1.500 μL'lik bir nihai hacim ile sonuçlanır. Son olarak, çözeltiyi plastik bir küvete aktarın ve emiciliği 529 nm'de ölçün.</li>
</ol>
Tablo 1: GOX-H2SO4 yöntemi için glikoz kalibrasyon eğrisi. Kısaltmalar: TANRI = glikoz oksidaz; POD = peroksidaz; H2S04 = sülfürik asit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67126/67126_Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
5. Mikrobiyolojik numunelerin test edilmesi
<ol>
	<li>Numuneyi, sıcaklık, çalkalama hızı ve inkübasyon süresi dahil olmak üzere belirli koşullar altında sıvı bir kültür ortamında bakteri veya maya yetiştirerek elde edin. Kültür, istenen optik yoğunluğa (OD) veya hücre konsantrasyonuna ulaştığında, daha sonraki işlemler için kültürü toplayın. NOT: Pseudomonas reptilivora 300 rpm ve 28 °C'lik sabit bir çalkalama hızında kültürlenirken, Debaryomyces hansenii bir orbital çalkalayıcıda 30 ° C'de 200 rpm'lik bir çalkalama hızı ile kültürlendi. D. hansenii'nin özel durumunda, lipaz üretimi için bir indükleyici olarak yenilebilir kanola yağı da kullanılmıştır.</li>
	<li>Çalışma alanını p alkol solüsyonu veya biyogüvenlik protokollerine göre uygun bir temizlik maddesi ile temizleyin. Asepsiyi sağlamak için bir brülör yakın.</li>
	<li>100 μL kültür ortamını steril uçlar kullanarak 1.5 mL veya 2 mL'lik bir mikro tüpe aktarın.</li>
	<li>Numuneleri 7,500 × g'da 4 °C'de 7 dakika veya sıcaklık kontrolü olmadan 7 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, çözelti içinde glikoz içeren süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti atın.</li>
	<li>1 ila 20 g / L arasında değişen glikoz konsantrasyonları için 0.5 μL süpernatan kullanın, daha sonra 749.5 μL o-dianisidin tamponu, 3.3 μL GOD ve ardından 1.2 μL POD ile karıştırın. Mikrotüpleri adım 4.2'de detaylandırıldığı gibi 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin ve hemen 750 μL% 50 H2S04 ekleyin ve 2 dakika buz banyosunda soğumaya bırakın.<ol>
		<li>20 g / L'nin üzerindeki konsantrasyonlar için, devam etmeden önce steril H2Odi ile 1: 1 seyreltme yapın.</li>
		<li>Süpernatan numuneler daha önce -80 °C veya -20 °C'de dondurulmuşsa, kullanmadan önce oda sıcaklığında çözdürün ve 30 saniye vorteksleyin. Seyreltme gerekiyorsa, steril H2Odi kullanın.</li>
		<li>Glikoz konsantrasyonları 30 g / L'nin üzerinde olan numuneler için, steril H2Odi ile 1: 1 seyreltme gerçekleştirin, bu da 2'lik bir seyreltme faktörü ile sonuçlanır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bir elektronik tablo programında Eq (2) kullanarak her numunedeki toplam glikoz konsantrasyonunu hesaplayın. 
	<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/67126/67126eq11.jpg" style="margin: auto;">(2) Nerede: 
	x = glikoz konsantrasyonu (g/L) δ = Son reaksiyon hacmi (0.0015 L) 
	y = absorbans M.S. = kullanılan numune miktarı* NOT: b ve m değerleri, yöntem için kalibrasyon eğrisinin eğilim çizgisini modelleyen denklemden alınmıştır (y = mx + b). *M.S. değeri, karşılık gelen seyreltmede oranı elde etmek için kullanılan numune miktarına dayanmalıdır (yani, süpernatanttan 0,5 μL alırsanız, MS = 0,0000005 L = 0,5 × 10-6 L); bir seyreltme faktörü (DF) kullanılıyorsa, elde edilen absorbansı DF ile çarpın. Örneğin, 0.5'lik bir absorbans elde edilirse ve 2'lik bir DF kullanılırsa, sonuç 1.0 olacaktır. Bu nedenle, y = 1.0 ve bu değer daha önce açıklandığı gibi Eşitlik (2) içine girilmelidir.</li>
</ol>
6. Analitik doğrulama
<ol>
	<li>Ulusal Metroloji Merkezi ve Meksika Akreditasyon Kurumu10 (CENAM-ema) tarafından belirlenenlere göre GOX-H2SO4 yönteminin analitik doğrulama parametrelerini hesaplayın.<ol>
		<li>Hassasiyeti, varyasyon katsayısının yüzdesi olarak veya %CV = (S/x) × 100 olarak hesaplayın, burada x , örneklem grubu ortalaması ve S , %≤10'luk bir kabul değeri ile standart sapmadır.</li>
		<li>Standart eğriyi 0,995'in üzerindeki doğrusal model R2'ye uydurarak doğrusallığı belirleyin.</li>
		<li>Şu denklemi kullanarak niceleme sınırını (LOQ) hesaplayın: LOQ = yB + 10sB, burada yB, hedef sinyale eşdeğer bir sinyal üreten analit konsantrasyonunu temsil eder ve 10sB, boşluğun standart sapmasının 10 katını gösterir</li>
		<li>Bu denklemi kullanarak sistematik hatayı hesaplayın: Eğim = x - m, burada x = deneysel konsantrasyonun ortalaması ve m teorik konsantrasyondur.</li>
		<li>Doğruluğu, gerçek bir değer ile teorik bir değer arasındaki uyum derecesi olarak belirleyin. Kurtarma% = (CR/CV) × 100 Burada CR, deneysel konsantrasyonun ortalamasıdır ve CV, teorik konsantrasyonun varyasyon katsayısıdır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Diğer indirgeyici şekerlerin müdahalesi
<ol>
	<li>Dört indirgeyici şekeri ayrı ayrı değerlendirin: 0.5 g / L'lik bir stok çözeltisinden glikoz, fruktoz, galaktoz ve ksiloz. Ek olarak, trehalozu negatif kontrol olarak kullanın. Tüm numuneler için protokolü takip edin ve absorbansı 545 ve 529 nm'de ölçün.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Mikrobiyal ve Maya Analizi için Enzimatik Bergmeyer Glikoz Miktar Tayini

<ol><li>Huang, W. C., Tang, I. C. Bacterial and yeast cultures: process characteristics, products, and applications. Bioprocessing for value-added products from renewable resources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuang%2C+WC+%22New+Technologies+and+Applications%22">New Technologies and Applications</a>. , Elsevier. 185-223 (2007).</li>
<li>Hernandez-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+reducing+sugars+based+on+the+qualitative+technique+of+Benedict%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Quantification of reducing sugars based on the qualitative technique of Benedict.</a> ACS Omega. 5 (50), 32403-32410 (2020).</li>
<li>Miller, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dinitrosalicylic+acid+reagent+for+determination+of+reducing+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.</a> Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).</li>
<li>Deshavath, N. N., Mukherjee, G., Goud, V. V., Veeranki, V. D., Sastri, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+the+3%2C5-dinitrosalicylic+acid+%28DNS%29+assay+for+the+reducing+sugars%3A+interference+of+furfural+and+5-hydroxymethylfurfural%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay for the reducing sugars: interference of furfural and 5-hydroxymethylfurfural.</a> Int J Biol Macromol. 156, 180-185 (2020).</li>
<li>De Abreu, J. R., Santos, C. D. D., De Abreu, C. M. P., Corrêa, A. D., De Oliveira Lima, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+fractionation+and+pectin+content+during+the+ripening+of+guava+cv.+Pedro+Sato%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Sugar fractionation and pectin content during the ripening of guava cv. Pedro Sato.</a> Food Sci Technol. 32 (1), 156-162 (2020).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K. -A., Hamilton, J. K., Roberts, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of sugars.</a> Nature. 168 (4265), 167(1951).</li>
<li>Gonzalez, N. M., Fitch, A., Al-Bazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+RP-HPLC+method+for+determination+of+glucose+in+Shewanella+oneidensis+cultures+utilizing+1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone+derivatization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a RP-HPLC method for determination of glucose in Shewanella oneidensis cultures utilizing 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatization.</a> PLoS ONE. 15 (3), e0229990(2020).</li>
<li>Galant, A. L., Kaufman, R. C., Wilson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%3A+Detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose: Detection and analysis.</a> Food Chem. 188, 149-160 (2015).</li>
<li>Bergmeyer, H. U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergmeyer%2C+HU+%22Methods+of+enzymatic+analysis%22">Methods of enzymatic analysis</a>. 2, Elsevier Inc. (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gu%C3%ADa+t%C3%A9cnica+sobre+trazabilidad+e+incertidumbre+en+las+mediciones+anal%C3%ADticas+que+emplea+la+t%C3%A9cnica+de+espectrofotometr%C3%ADa+de+ultravioleta-visible%22">Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en las mediciones analíticas que emplea la técnica de espectrofotometría de ultravioleta-visible</a>. , CENAM-EMA. (2008).</li>
<li>Yuen, V. G., McNeill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+glucose+oxidase+method+for+glucose+determination+by+manual+assay+and+automated+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of the glucose oxidase method for glucose determination by manual assay and automated analyzer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (3), 543-546 (2000).</li>
<li>Hansen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+glucose+oxidase+reaction+and+interference+with+quantitative+glucose+oxidase-peroxidase-O-dianisidine+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Investig%22%5BJournal%5D)">Specificity of glucose oxidase reaction and interference with quantitative glucose oxidase-peroxidase-O-dianisidine method.</a> Scand J Clin Lab Investig. 14 (6), 651-655 (1962).</li>
<li>Kumar, V., Gill, K. D. Estimation of blood glucose levels by glucose oxidase method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+V+%22Basic+concepts+in+clinical+biochemistry%3A+A+practical+guide%22">Basic concepts in clinical biochemistry: A practical guide</a>. , Springer eBooks. 57-60 (2018).</li>
</ol>

Glikoz, bakteriler, mayalar ve mantarlar dahil olmak üzere çok sayıda mikroorganizma için birincil enerji ve karbon kaynağı olarak hizmet eder. Bu mikroorganizmalar, hücre dışı zar üzerinde bulunan taşıyıcılar yoluyla glikozu alır ve burada piruvat1'e dönüştürülmek üzere glikoliz metabolik yolu içinde bir dizi biyokimyasal reaksiyona girer. Glikoz gibi indirgeyici şekerlerin miktarının belirlenmesi için çeşitli teknikler vardır. Örneğin, Benedict'in reaktifi2, 3,5-dinitrosalisilik asit (DNS)3,4, antrona yöntemi5 veya fenol-sülfürik asit6 yöntemi kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler, numunede bulunan fruktoz ve maltoz gibi, sinyale katkıda bulunabilecek ve belirli bir şekerin doğru miktar tayinini zorlaştırabilecek herhangi bir indirgeyici şekeri tespit eder.
Ek olarak, sıkı sıcaklık kontrolü ve tehlikeli maddelerin işlenmesini gerektirirler, bu da süreci karmaşıklaştırabilir ve doğruluğu etkileyebilir. Bu yöntemler ayrıca numunede bulunan diğer bileşiklerden kaynaklanan parazitlere maruz kalabilir ve bu da doğru glikoz miktar tayinini zorlaştırır. Tersine, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), daha yüksek işletme maliyetlerine rağmen, glikoz ve diğer indirgeyici şekerler arasında ayrım yapılmasına izin veren daha kesin bir alternatif sunar. Bu zıt yöntemler, doğru ve uygun maliyetli glikoz miktar tayin tekniklerinin geliştirilmesine yönelik devam eden ihtiyacı vurgulamaktadır7.
Glikoz oksidaz-peroksidaz-sülfürik asit (GOX-H2S04) yöntemi, glikoz oksidaz (GOD) ve peroksidaz (POD) olmak üzere iki enzim kullanır. GOD, β-D-glikoz8'in oksidasyonu için çok seçici olan bir oksidoredüktaz enzimidir. Bu kompleks, glikoz oksijen varlığında meydana gelen reaksiyon sırasında bir katalizör görevi görür ve glukonik asit ve hidrojen peroksit (H2O2) üretir. H2O2, POD ile etkileşime girdiğinde, oksidasyonuna ve H2O2 salınımına neden olan ve glukonik asidin tekrar glikoza dönüştürülmesini önleyen bir kromojenik oksijen alıcısı olan o-dianisidin vasıtasıyla tespit edilir (bkz. Şekil 1). Elde edilen renk, enzimatik reaksiyonu da durduran sülfürik asit (H2S04) ilavesiyle stabilize edilir, böylecereaksiyon devam ederse oluşabilecek olası girişimden kaçınılır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67126/67126fig01.jpg"> 
Şekil 1: Hidrojen peroksit (H2O2) ve glukonik asit üretmek için glikoz ile reaksiyona giren glikoz oksidaz enzimini kullanan glikoz miktar tayini yöntemine genel bakış. Daha sonra, peroksidaz enzimi, O-dianisidin dihidroklorür varlığındaH2O2ile reaksiyona girer. Son adımda, enzimatik reaksiyonu durdurmak için sülfürik asit (H2S04) eklenir ve 529 nm'de ölçülen pembe bir renk elde edilir. Kısaltmalar: POD = peroksidaz; TANRI = glikoz oksidaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67126/67126fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
GOX-H2S04 enzimatik yöntemi, çoğu klinik ilgi alanı olan biyolojik numunelerdeki glikoz konsantrasyonunu ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, az sayıda çalışma, tüketimini değerlendirmek için bir büyüme ortamındaki glikoz miktarının ölçülmesine izin veren bir tekniği araştırmıştır. Bu nedenle, mevcut protokolde, mikrobiyolojik sıvı numunelerde glikoz oksidaz, peroksidaz, o-dianisidin dihidroklorür ve H2S04'ün enzimatik reaksiyonu yoluyla glikozun miktarını belirleme metodolojisi sunulmaktadır, bu da Bergmeyer9 tarafından yapılan işin bir modifikasyonu olarak ortaya çıkan, P (h/h) H2S04 ve daha düşük miktarlarda reaktif kullanılarak.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL mikrotüp</td><td>Eppendorf</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>2.0 mL mikrotüp</td><td>Eppendorf</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>CaCO3</td><td>Meyer</td><td>471-34-1</td><td>Kalsiyum Karbonat</td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Meyer</td><td>50-99-7</td><td>D-Glikoz&nbsp;</td></tr><tr><td>Kuru Banyo</td><td>FisherScientific</td><td>11-718-4</td><td>Seri 911NO251. Blok GxDxY mm/inç: 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5</td></tr><tr><td>Glikoz oksidaz&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6125-50KU</td><td>Enzim tozu</td></tr><tr><td>H 2 O</td> <td>-</td><td></td> <td>Deiyonize su</td></tr><tr><td>H 2 SO 4 </td> <td>Meyer</td><td>7664-93-9</td><td>Sülfürik asit</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Meyer</td><td>7647-01-0</td><td>Hidrokloridrik asit ve nbsp;</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Meyer</td><td>7758-11-4</td><td>Dipotasyum fosfat</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Meyer</td><td>7778-77-0</td><td>Monopotasyum fosfat</td></tr><tr><td>KOH Meyer</td><td></td><td>1310-58-3</td><td>Potasyum hidroksit</td></tr><tr><td>Lambda 35</td><td>PerkinElmer-Spektrofotometre</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mikrotüp santrifüj</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>o-Dianisidin dihidroklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3252</td><td>Kromojenik</td></tr><tr><td>Peroksidaz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8125-50KU</td><td>Enzim tozu</td></tr><tr><td>pH-metre</td><td>Hanna ve nbsp;</td><td>1131</td><td>Hanna 1170</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Meyer</td><td>127-09-3</td><td>Meyer</td></tr><tr><td>Tartı spatulaları&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

mikrobiyolojik numuneler için bergmeyer glikoz miktar tayini

Bergmeyer Glucose Quantification for Microbiological Samples

GOX-H2S04'ün spektrofotometrik analizi, 529 nm'de (λmax) tek bir maksimum absorbans ortaya çıkardı (Şekil 2A) ve 545 nm'de ek absorbans değerleri gözlendi. Farklı glikoz konsantrasyonlarındaki absorbans değerlerini analiz ederek, λ529 nm için 0.9977 ve λ545 nm için 0.9967 R²'lik bir doğrusallık (R²) elde ettik (Şekil 2B). Doğrusallık, belirli bir aralık içinde, numunelerdeki glikoz konsantrasyonu ile doğru orantılı sonuçlar sağlama yete...

Mikrobiyolojik Numuneler için Bergmeyer Glikoz Miktar Tayini

The glucose concentration is a key indicator of cellular metabolism and could indicate the total metabolism rate, an aberration in glucose metabolism, ...

bergmeyer-glucose-quantification-for-microbiological-samples

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Tam olarak oluşturmak ve kapsamlı ipliksi mantar morfolojisi karakterize bir...

Ve Özelleştirme Aspergillus Nijer</emTalk Mikro Parçacıkların toplama yoluyla> Morfolojisi

Bu video, hücre içi glikoz alımını dolaylı olarak ölçmek için bir in vitro testi göstermektedir. Test, hücre dışı glikoz tükenmesi ile hücre içi glikoz alımı arasında bir korelasyon kurmak için floresan etiketli bir glikoz analoğu kullanır.

İn Vitro Glikoz Tükenme Testi: Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi Ölçümü Yoluyla Hücresel Glikoz Alımını Ölçmek İçin Floresan Tabanlı Bir Yöntem

Bu videoda, laktat dehidrojenaz enzimi kullanılarak hücre lizatlarında laktat ölçümü için bir kolorimetrik test açıklanmaktadır. Bu enzim, NAD'nin tetrazolyum boyalarla reaksiyona giren NADH'ye dönüştürülmesiyle birlikte laktatı piruvata dönüştürür ve laktatı kantitatlamak için spektrofotometrik olarak ölçülebilen renkli bir ürün verir.

Test Numunelerinde Laktat Miktarının Belirlenmesi için Kolorimetrik Test

Bu video, fare idrarını toplama ve glikoz seviyelerini değerlendirme prosedürünü göstermektedir. Glikoz seviyesini değerlendirmek için, enzimlerle kaplanmış bir test şeridini ve kromojenik bir boyayı numuneye daldırın ve glikoz seviyelerini gösteren bir renk değişikliği başlatın. İdrar glikoz seviyelerini ölçmek için, artan glikoz konsantrasyonlarına sahip çok kuyulu bir plakaya bir idrar örneği verin, reaksiyon karışımını ekleyin ve inkübe edin. Standart bir eğri oluşturmak için absorbansı...

Fare İdrar Glikoz Konsantrasyonlarının Kalitatif ve Kantitatif Değerlendirmesi için Testler

In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Küçük ölçekte mikrobiyal ekzopolisakkaritlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için otomatikleştirilmiş modüler yüksek verimli bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, yeni izole edilen bakteri suşlarının veya tüm suş koleksiyonlarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlamak için salgılanan polisakkaritlerin toplam miktarını ayrıntılı bir karbonhidrat parmak izi ile analiz etmek için hızlı bir ön seçimi birleştirir.

Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Bu protokol, ısmarlama bir taşınabilir FRET analizörü kullanarak Förster rezonans enerji transferi (FRET) sensörü verilerinin hızlı ve son derece hassas ölçümü açıklanır. Cihaz şeker içeriğinin pratik ve etkili bir değerlendirme sağlayan saptama hassasiyetini maksimuma kritik sıcaklık aralığında maltoz tespit etmek için kullanıldı.

Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Burada, bakteri sporu çimlenmesi sırasında indirgeyici şekerlerin varlığını tespit etmek için kolorimetrik bir testi açıklıyoruz.

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

Monositler, aktive edildiğinde glikolitik metabolizmaya dayanan insan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ayrılmaz bileşenleridir. Taze tam kandaki toplam monositler ve monosit alt popülasyonları tarafından glikoz taşıyıcı ekspresyonunu ve glikoz alımını ölçmek için bir akış sitometrisi protokolü tanımladık.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Aerobik metan oksitleyici bakterilerin doğal ortamlarında bulunan metan-oksijen karşı gradyanını yeniden oluşturan ve fizyolojilerinin mekansal olarak çözülmüş bir bağlamda incelenmesini sağlayan basit bir model ekosistem hazırlamak için bir protokol açıklanmaktadır. Agaroz bazlı model ekosistemi ile kullanım için yaygın biyokimyasal tahlillerde yapılan değişiklikler de açıklanmaktadır.

Metan-oksijen karşı gradyanında metanotrof yetiştirmek için agaroz tabanlı model ekosistem

Öğrenin mikrobiyolojik numunelerde Bergmeyer glikoz miktar tayini yöntemiyle glikoz konsantrasyonunu doğru ölçme tekniğini. Bu protokol spesifite ve duyarlılığı artırarak işlem süresini kısaltır.

Mikrobiyolojik Numuneler için Bergmeyer Glikoz Miktar Tayini

Daha fazla video keşfet