Mikrobiyolojik Numuneler için Bergmeyer Glikoz Miktar Tayini

Araştırma, bakteri ve maya filtrelerinden elde edilen miktar belirleme tekniklerini kullanarak mikrobiyal numunelerdeki glikoz konsantrasyonunu değerlendirir. Amaç, mikrobiyolojik çalışmalarda glukoz kütle gramının doğruluğunu arttırmaktır. Zorluklar arasında, karmaşık mikrobiyal numunelerde düşük glikoz konsantrasyonunun doğru bir şekilde ölçülmesi ve karışık kültürlerde mikrobiyal ve çevresel glikoz kaynakları arasında ayrım yapılması yer alır.

Araştırma, spesifik mikrobiyal suşlar ile glikoz tüketim oranları arasında açık bir ilişki olduğunu göstererek, çevresel faktörlerin metabolik yolları nasıl etkilediğini ortaya koymuştur. Protokolümüz, işlem süresini azaltırken özgüllüğü ve duyarlılığı artırarak glikoz tespitini geliştirir. Sülfürik asidin kontrollü bir şekilde kullanılması paraziti en aza indirir.

Gelecekteki araştırmalar, endüstriyel mikrobiyoloji uygulamaları için glikoz tespit yöntemlerini optimize etmeye ve değişen çevresel koşullar altında glikoz metabolizmasında belirli bir genin rolünü araştırmaya odaklanacaktır. Başlamak için, bir cam beherde 1.28 gram potasyum dihidrojen fosfat ve 0.1304 gram dipotasyum fosfat tartın. 70 mililitre deiyonize su ekleyin ve 1 molar hidroklorik asit veya potasyum hidroksit kullanarak pH'ı 5.5'e ayarlayın.

Daha sonra çözeltiyi 100 mililitrelik hacimsel bir şişeye aktarın ve hacmi deiyonize su ile 100 mililitreye ayarlayın. Hazırlanan çözeltiyi kehribar rengi bir kapta 4-8 santigrat derecede üç aya kadar saklayın. Daha sonra, 2 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 0.01 gram o-Dianisidin dihidroklorür tartın.

1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, bileşiği çözmek için 1 mililitre deiyonize su ekleyin ve çözeltiyi yavaşça karıştırın. Santrifüj tüpünü ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın ve 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra 100 mililitrelik hacimsel bir şişede alınan 10 mililitre fosfat tamponuna o-Dianisidin dihidroklorür çözeltisi ekleyin ve son hacmi fosfat tamponu ile 100 mililitreye ayarlayın.

Çözeltiyi kehribar bir şişeye aktardıktan sonra, 3-4 ay boyunca 4-8 santigrat derecede saklayın. Şimdi bir buz banyosuna 30 mililitre deiyonize su içeren 100 mililitrelik hacimsel bir şişe yerleştirin. 10 dakika sonra, hafifçe sallarken şişenin duvarlarından aşağı 51 mililitre %98 sülfürik asit dökün.

Daha sonra, son hacmi deiyonize su ile 100 mililitreye ayarlayın ve çözeltiyi saklamak için bir cam kehribar şişeye aktarın. Enzim hazırlığı için, 2 mililitrelik steril bir mikrotüpte 0.01 gram glikoz oksidaz tartın. Mikrotüpe pH 5'te 1 mililitre 50 milimolar sodyum asetat tamponu ekleyin ve hafifçe karıştırın.

Daha sonra 2 mililitrelik yeni bir mikrotüpte, 0.0031 gram peroksidaz enzimi tartın ve pH 5.5'e ayarlanmış 1 mililitre fosfat tamponunda çözün. Enzim içeren mikrotüplerin her ikisini de alüminyum folyo ile kapatın ve 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra deiyonize su kullanarak litre başına 1 gram D-Glikoz standart çözeltisi hazırlayın.

Başlamak için, tahlil için glikoz standardını ve diğer tüm gerekli çözeltileri hazırlayın. Taze 2 mililitrelik tüplere uygun hacimde glikoz ekleyin. Kuru bir termobanyoyu 37 santigrat dereceye ayarlayın ve stabilize olmasına izin verin.

Her bir mikrotüpe uygun hacimlerde tampon ekleyin, ardından 3.3 mikrolitre glikoz oksidaz ve 1.2 mikrolitre peroksidaz ekleyin. Tüpleri 37 santigrat derecede inkübe edin ve zamanlayıcıyı 20 dakikaya ayarlayın. İnkübasyondan hemen sonra, her bir mikrotüpe 750 mikrolitre% 50 sülfürik asit ekleyin ve soğuması için 2 dakika buz banyosuna koyun.

Soğutulmuş 1.500 mikrolitrelik karışımı plastik bir küvete aktarın ve absorbansı 529 nanometrede ölçün. Ardından çalışma alanını %70 alkol solüsyonuyla temizleyin ve asepsiyi sağlamak için bir brülör yakın. Sıvı bir kültür ortamında bakteri veya maya elde edin.

Steril uçlar kullanarak 100 mikrolitre kültürü 1.5 mililitrelik mikrotüplere aktarın. Numuneleri 7.500 G'de 4 santigrat derecede 7 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, çözelti içinde glikoz içeren süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Reaksiyon karışımını hazırlamak için 0.5 mikrolitre süpernatanı gerekli tüm bileşenlerle karıştırın. Mikrotüpleri 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin ve hemen 750 mikrolitre% 50 sülfürik asit ekleyin. Karışımı bir buz banyosunda 2 dakika soğumaya bırakın.

Son olarak, absorbansı 529 nanometrede ölçün. Spektrofotometrik analiz, 529 nanometrede maksimum absorbans zirvesini gösterdi. Debaryomyces hansenii ile glikoz tüketiminin analizi, 6, 8 ve 12 saatte önemli farklılıklar ortaya çıkana kadar glikoz oksidaz ve DNS yöntemleri arasında tutarlı sonuçlar göstermiştir.

Glikoz oksidaz sülfürik asit yönteminin uygulanması, litre başına 100 grama kadar yüksek glikoz konsantrasyonlarının analizini kolaylaştırdı ve seyreltmeyi takiben güvenilir sonuçlar verdi.