Name: Organ Düzeyinde Mikrobiyom Analizleri için Sivrisinek Yumurtalıkları, Midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:25:00.000+00:00
Duration: 3 min 58 s
Description: Öğrenin, sivrisineklerin yumurtalık, midgut ve tükürük bezlerinden organ düzeyinde mikrobiyom analizi için diseksiyon tekniklerini. Bu yöntem, vektör biyokontrol stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Mikrobiyom Analizleri için Yüksek Hassasiyetli Sivrisinek Organ İzolasyonu

<ol><li>Achee, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+strategies+for+mosquito-borne+arbovirus+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Alternative strategies for mosquito-borne arbovirus control.</a> PLOS Negl Trop Dis. 13 (1), e0006822(2019).</li>
<li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li>
<li>Porter, J., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+lives+of+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cellular lives of Wolbachia.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (11), 750-766 (2023).</li>
<li>Coon, K. L., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquitoes+host+communities+of+bacteria+that+are+essential+for+development+but+vary+greatly+between+local+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Mosquitoes host communities of bacteria that are essential for development but vary greatly between local habitats.</a> Mol Ecol. 25 (22), 5806-5826 (2016).</li>
<li>Didion, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome+reduction+prevents+lipid+accumulation+during+early+diapause+in+the+northern+house+mosquito%2C+Culex+pipiens+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microbiome reduction prevents lipid accumulation during early diapause in the northern house mosquito, Culex pipiens pipiens.</a> J Insect Physiol. 134, 104295(2021).</li>
<li>Gabrieli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+trilogy%3A+Microbiota%2C+immunity+and+pathogens%2C+and+their+implications+for+the+control+of+disease+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mosquito trilogy: Microbiota, immunity and pathogens, and their implications for the control of disease transmission.</a> Front Microbiol. 12, 630438(2021).</li>
<li>Garrigós, M., Garrido, M., Panisse, G., Veiga, J., Martínez-de La Puente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+West+Nile+Virus+and+the+microbiota+of+Culex+pipiens+vectors%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interactions between West Nile Virus and the microbiota of Culex pipiens vectors: A literature review.</a> Pathogens. 12 (11), 1287(2023).</li>
<li>Zheng, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holobiont+perspectives+on+tripartite+interactions+among+microbiota%2C+mosquitoes%2C+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Holobiont perspectives on tripartite interactions among microbiota, mosquitoes, and pathogens.</a> ISME J. 17 (8), 1143-1152 (2023).</li>
<li>Flores, G. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+dominance+influences+the+Culex+quinquefasciatus+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Wolbachia dominance influences the Culex quinquefasciatus microbiota.</a> Sci Rep. 13 (1), 18980(2023).</li>
<li>Hegde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkingdom+interactions+shape+the+fungal+microbiome+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Microbiome%22%5BJournal%5D)">Interkingdom interactions shape the fungal microbiome of mosquitoes.</a> Anim Microbiome. 6 (1), 11(2024).</li>
<li>Suo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+variation+of+midgut+bacterial+diversity+in+Culex+quinquefasciatus+populations+in+Haikou+city%2C+Hainan+province%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Seasonal variation of midgut bacterial diversity in Culex quinquefasciatus populations in Haikou city, Hainan province, China.</a> Biology. 11 (8), 1166(2022).</li>
<li>Gruber-Vodicka, H. R., Seah, B. K. B., Pruesse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((phyloFlash%3A+Rapid+small-subunit+rRNA+profiling+and+targeted+assembly+from+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">phyloFlash: Rapid small-subunit rRNA profiling and targeted assembly from metagenomes.</a> mSystems. 5 (5), e00920-e00920 (2020).</li>
<li>Graña-Miraglia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spirochetes+isolated+from+arthropods+constitute+a+novel+genus+Entomospira+genus+novum+within+the+order+Spirochaetales%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spirochetes isolated from arthropods constitute a novel genus Entomospira genus novum within the order Spirochaetales.</a> Sci Rep. 10 (1), 17053(2020).</li>
<li>Reveillaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wolbachia+mobilome+in+Culex+pipiens+includes+a+putative+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Wolbachia mobilome in Culex pipiens includes a putative plasmid.</a> Nat Commun. 10 (1), 1051(2019).</li>
<li>Ghousein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pWCP+is+a+widely+distributed+and+highly+conserved+Wolbachia+plasmid+in+Culex+pipiens+and+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Commun%22%5BJournal%5D)">pWCP is a widely distributed and highly conserved Wolbachia plasmid in Culex pipiens and Culex quinquefasciatus mosquitoes worldwide.</a> ISME Commun. 3 (1), 40(2023).</li>
<li>Juma, E. O., Kim, C. -H., Dunlap, C., Allan, B. F., Stone, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+and+Culex+restuans+egg+rafts+harbor+diverse+bacterial+communities+compared+to+their+midgut+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens and Culex restuans egg rafts harbor diverse bacterial communities compared to their midgut tissues.</a> Parasit Vectors. 13 (1), 532(2020).</li>
<li>Lee, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GToTree%3A+a+user-friendly+workflow+for+phylogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GToTree: a user-friendly workflow for phylogenomics.</a> Bioinformatics. 35 (20), 4162-4164 (2019).</li>
<li>Parks, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+domain-to-species+taxonomy+for+bacteria+and+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A complete domain-to-species taxonomy for bacteria and Archaea.</a> Nat Biotechnology. 38 (9), 1079-1086 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Alkol 96 derece;</td><td>Fisher bilimsel</td><td>10332562</td><td></td></tr><tr><td>Binoküler büyüteç&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>RAJA</td><td>145517</td><td>150 tablet 1.5 g</td></tr><tr><td>DNA hazırlık kiti</td><td>Illumina</td><td>MGX dizileme platformu tarafından sağlanmıştır</td><td>Daha önce Nextera DNA Flex</td></tr><tr><td>DNA-RNA Kalkanı (50 mL)</td> olarak biliniyorduZymo <td>araştırması</td><td>ZR1100-50</td><td>Koruma tamponu</td></tr><tr><td>DNeasy Kan ve Doku Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>DNA ekstraksiyon kiti</td></tr><tr><td>Filtre uçları 20 ve mikro; L</td><td>Starlab</td><td>S1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>Filtre uçları 200 ve mikro; L</td><td>Starlab</td><td>S1120-8710</td><td></td></tr><tr><td>Filtre uçları 1000 & L</td><td>Starlab</td><td>S1122-1730-C</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>FST (Güzel Bilim Araçları)</td><td>11252-20</td><td>Dumont Forseps #5</td></tr><tr><td>Kütüphane niceleme kiti</td><td>Roche</td><td>MGX sıralama platformu</td><td>KAPA tarafından sağlanan Kütüphane Niceliklendirme Kitleri</td></tr><tr><td>Mikropipetler 2-20 ve mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>6.291704</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetler 20-200 & mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>6.291703</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetler 100-1000 & mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>7.648488</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları&nbsp;</td><td>Epredia</td><td>J1800BMNZ</td><td>boyutu: 75 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>İğneler</td><td>Terumo</td><td>AN*2719R1</td><td></td></tr><tr><td>NGS kiti&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>MGX dizileme platformu tarafından sağlanmıştır</td><td>Fragman Analiz Sistemleri HS Genomik DNA 50kb Kiti</td></tr><tr><td>NovaSeq 6000</td><td>Illumina</td><td>MGX dizileme platformu tarafından sağlanmıştır</td><td>Sıralayıcı</td></tr><tr><td>PBS Fosfat Tamponlu Salin (Steril)</td> <td>Fisher scientific</td><td>10212990</td><td></td></tr><tr><td>Kalıcı siyah işaretleyici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril Eppendorf&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>33871</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>İğne desteği</td><td>FST (Güzel Bilim Araçları)</td><td>26016-12</td><td>Moria MC1 Pim Tutucu 12 cm</td></tr></tbody></table>

organ düzeyinde mikrobiyom analizleri için sivrisinek yumurtalıkları, midgut ve tükürük bezlerinin diseksiyonu

Dissection of Mosquito Ovaries, Midgut, and Salivary Glands for Microbiome Analyses at the Organ Level

x'Sivrisinek diseksiyonları Protokolü takiben, bir laboratuvar kolonisinden iki Culex pipiens molestus örneğinden (bir gravid dişi dahil) yumurtalıkları, orta bağırsakları, tükürük bezlerini ve karkası topladık ve izole ettik. Dürbün altında kalıntı kalmayan tüm (yani kırılmamış) ve iyi izole edilmiş organların gözlemini takiben temiz diseksiyonları doğruladık. Bir Culex pipiens molestus örneğinin tüm vücudu, başı ve göğüsleri, disseke tükürük bezleri, yumurtalıkları ve orta bağırsağı Şekil 2'de gösterilmiştir. Beklendiği gibi, orta bağırsak ve tükürük bezleri, sivrisinek yumurtalıklarından daha küçük bir büyüklük sırasıydı. Bir gravid Culex örneğinin yumurtaları, orta bağırsağı ve Malpighian tübülleri ile birlikte Şekil 3'te sunulmuştur. Materyal taze olmadığında ve dokunun kırılma olasılığı yüksek olduğunda diseksiyonların başarısız olmaya daha yatkın olduğu unutulmamalıdır (Şekil 4B, C). Bu nedenle, dokular hala elastik olduğundan, mümkün olduğunda materyalin toplandıktan hemen sonra (12 saatten daha kısa bir süre içinde) diseksiyonunu öneriyoruz (Şekil 4A). Benzer şekilde, donmuş materyalin diseksiyonu yapılabilir, ancak kırılgan dokular nedeniyle başarısızlık ve organlar arasında çapraz kontaminasyon riski çok daha yüksektir (Şekil 4).
Mikrobiyom verileri Ek olarak, aynı prosedürü izleyerek Noumea, Yeni Kaledonya'dan üç ayrı Culex quinquefasciatus örneğinden orta bağırsakları ve yumurtalıkları topladık ve ayırdık. Her organdan DNA çıkardık, tüm genom dizilimi için örnekler hazırladık ve Ek Dosya 1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi mikrobiyom veri analizleri gerçekleştirdik. PhyloFlash12 kullanılarak birleştirilmemiş kalite filtreli kısa okumalar üzerinde yapılan bir bakteri taksonomik çeşitlilik analizi, yumurtalıklara kıyasla orta bağırsaklarda belirgin baskın taksonlar gösterdi (Şekil 5A). Özellikle, yumurtalık bakteri topluluklarına Wolbachia hakimdi, bireysel 3'ün yumurtalıklarında ek bir Spirochaetaceae filotipi bulunurken, orta bağırsak toplulukları Gammaproteobacteria, Spirochaetaceae<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig01v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig01largev2.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig05large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67128_SupplementaryMaterial_15.07.2024_JR_fin.zip" target="_blank"></a>

Organ Düzeyinde Mikrobiyom Analizleri için Sivrisinek Yumurtalıkları, Midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu

The global burden of mosquito-transmitted diseases, including malaria, dengue, West Nile, Zika, Usutu, and yellow fever, continues to increase, posing a ...

dissection-mosquito-ovaries-midgut-salivary-glands-for-microbiome

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sıtma için potansiyel bir gen refrakter olarak tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde Plasmodium enfeksiyonları önlemede rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, sivrisinek Plasmodium enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Gametocyte kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı hazırlamak ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.

Sivrisinekler ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi Plasmodium falciparum Enfeksiyonlar Protokol

Sivrisinek midgut ve tükürük bezlerinin Plasmodium falciparum ve dang virüsü gibi vektör patojenler için anahtar giriş ve çıkış noktaları vardır. Bu video Aedes aegypti sivrisinek midgut ve tükürük bezleri kaldırmak için diseksiyon teknikleri göstermektedir.

Ae midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyon. aegypti Sivrisinekler

Zamansal ve mekansal gen ekspresyon analizleri fonksiyonel genomik önemli bir role sahiptir. Tüm montaj...

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Kaynak: Liu, X. ve diğerleri. Antibiyotikle aranmış sivrisineklerle bakteriyel ağız beslenme testi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, sivrisinek midgutunun bağırsak bakterilerini izole etmek için diseksiyonunu gösteriyor. Midgut, sindirim sisteminden çıkarılır, bakterileri serbest bırakmak için homojenleştirilir ve besin agara kaplanır ve bakteri kolonileri kültürlenir.

Sivrisinek Midgutundan Bakterilerin İzolasyonu

A ribozomal RNA (rRNA) azalması protokolü sivrisinek bağırsak metatranscriptome RNA-seq mesajcı RNA (mRNA) zenginleştirmek için geliştirilmiştir. Çıkarma yoluyla rRNA kaldırmak için kullanılan örnek belirli rRNA probları, sivrisinek ve onun bağırsak mikropları oluşturulmuş. Protokol performans rRNA yaklaşık olarak% 90-99 arasında kaldırma neden olabilir.

Sivrisinek Gut Metagenomic RNA-seq Ribozomal RNA tükenmesi

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Bu makalede, izole ve sivrisinek midgut kültlenebilir mikropların belirlenmesi, sivrisinek bağırsak bakterilerin antibiyotik tükenmesi de dahil olmak üzere bireysel sivrisinek bağırsak bakterilerin etkisini araştırmak için bir protokol sunuyor ve belirli bir bakteri türleri yeniden tanıtmak.

Antibiyotik Tedavi Sivrisinekler ile Bakteriyel Oral Beslenme Tsay

Sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamaları üzerinde ayrıntılı araştırmalar, etkili bulaşma engelleme stratejileri tasarlamak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, enfeksiyöz gametositlerin etkili bir şekilde nasıl kültüreılacağını ve daha sonra bu gametositlerin sivrisineklere nasıl beslendiğini gösterir P. falciparumsivrisinek aşamaları .

Plazmodium falciparum Yapay Membran Besleme Yoluyla Gametosit Kültürü ve Sivrisinek Enfeksiyonu

Bu protokol, Ramsay tahlilinin arkasındaki metodolojileri, iyon seçici mikroelekrodları, Tarama İyon seçici Elektrot Tekniğini (SIET) ve in vitro kasılma testlerini özetlemektedir, Malpighian tübülleri ve arkalarından oluşan yetişkin sivrisinek boşaltım sistemini incelemek için uygulanan, iyon ve akışkan salgı oranlarını, kontinentil aktiviteyi ve transepithelial iyon taşımacılığını toplu olarak ölçmek için.

Yetişkin Sivrisinekte Nöropeptitlerin ve Boşaltım Sisteminin Diğer Düzenleyicilerinin Aktivitesinin Incelenmesi

Yetişkin sivrisinek tükürük bezi (SG), virüsler ve parazitler de dahil olmak üzere sivrisinek kaynaklı tüm patojenlerin insan konakçılarına iletilmesi için gereklidir. Bu video, SG'lerin larva (L4) evresi Anopheles gambiae sivrisineklerinden verimli bir şekilde izole edilmesini ve daha fazla analiz için L4 SG'lerin hazırlanmasını göstermektedir.

Anopheles gambiae Sivrisineklerinden Larva Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu ve İmmünasyon

Oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon enfeksiyonunu içeren bu metodoloji, midgut ve / veya tükürük bezi bariyerlerinin arbovirüs enfeksiyonu üzerindeki etkisini etkili bir şekilde değerlendirebilir.

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon

Öğrenin, sivrisineklerin yumurtalık, midgut ve tükürük bezlerinden organ düzeyinde mikrobiyom analizi için diseksiyon tekniklerini. Bu yöntem, vektör biyokontrol stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Organ Düzeyinde Mikrobiyom Analizleri için Sivrisinek Yumurtalıkları, Midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu

Daha fazla video keşfet