Düşük DNA Parçalanma İndeksine Sahip Yüksek Kaliteli Sperm Hazırlamak İçin U Şeklinde Yatay Yüzme Tekniği

[Ekran Okuyucusu] Araştırma, UHS tekniğinin düşük DNA Fragmantasyon İndeksi ile yüksek kaliteli sperm hazırlamada avantajlar sunup sunmadığını belirlemeyi amaçlayan bir sperm optimizasyonu yöntemine odaklanmaktadır. Mikroakışkan teknolojisi, daha düşük DFI ile yüksek kaliteli sperm seçimini optimize etmek için kullanılmıştır. UHS yönteminin ana sınırlaması, yüksek kaliteli spermin kendi kendine yüzme kabiliyetine yüksek oranda güvenmesidir. UHS yöntemi tamamen hareketsiz spermi olan hastalar için uygun değildir. Timotaksis, sperm ayrılmasında çok önemli bir rol oynar. U şeklindeki yörünge, yüksek kaliteli spermlerin serbest dolaşımını kolaylaştıran, hareketsiz spermlerden, safsızlıklardan ve diğer bileşenlerden tamamen ayrılmalarını sağlayan daha uzun bir sınıra sahiptir. DGC tekniği ile karşılaştırıldığında, UHS şerit yöntemi, laboratuvar personeli için daha az manuel işlem adımı içerir ve UHS şerit yöntemiyle elde edilen yüksek kaliteli sperm, tekrarlanan santrifüjleme prosedürlerine tabi tutulmaz, bu da daha düşük bir DFI ile sonuçlanır. Başlamak için, U şeklinde izler oluşturmak için çalışma kabına 20 mikrolitre gübreleme ortamı ekleyin. U şeklindeki yolun sol başlangıç noktasında dairesel bir damlacık oluşturmak için bir pipetle 10 mikrolitre gübreleme ortamı emdirin. Gübreleme ortamını kullanarak, U şeklindeki yolun sol orta kısmı boyunca aralıklarla her biri 10 mikrolitrelik iki tampon damlacık oluşturun. Sürekli bir yol oluşturmak için tüm damlacıkları gübreleme ortamına bağlayın. U şeklindeki yolun sağ tarafında uzun bir sıvı damlası şeridi oluşturmak için 2,5 mikrolitre polivinil pirolidon veya PVP kullanın. PVP şeridinin sağ tarafındaki oosit işleme ortamını kullanarak altı mikro damlacık yapın. Yemeğe yedi mililitre kültür yağı ekleyin ve yağın damlacıkların en yüksek noktasını tamamen kapladığından emin olun. Çanağı dengelemek için gece boyunca 37 santigrat derece, %6 karbondioksit inkübatörüne koyun. Spermi topladıktan sonra, tartı yöntemini kullanarak hacmini ölçün ve 0,01 mililitreye kadar doğruluk sağlayın. Semen örneğini 15 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir ortama yerleştirin ve geniş delikli plastik tek kullanımlık bir pipete aspire edin. Meni 60 dakika içinde sıvılaşmazsa, eşit miktarda gübreleme ortamı ekleyin. Tamamen sıvılaşana kadar tek kullanımlık bir plastik transfer pipeti kullanarak karışımı tekrar tekrar soluyun ve nefes verin. Altı ila 10 aralığında hassas pH test kağıdı kullanarak spermin pH değerini ölçün. 10 mikrolitre tamamen sıvılaştırılmış meni alın ve bir makula sayma odasına damlatın. Optik mikroskop kullanarak 200X alan altında sperm hareketliliğini değerlendirin. ICSI çalışma kabındaki U şeklindeki yolun sol başlangıç noktasındaki döllenme ortamı mikro damlacığına beş mikrolitre sperma ekleyin. 4X objektif merceğinin altında oosit tutan iğnenin ve enjeksiyon iğnesinin açısını ve konumunu ayarlayın. Kurulumu doğruladıktan sonra, seçilen oositi ICSI çalışma kabındaki oosit işleme ortamı mikro damlacığına aktarın. Oositleri içeren ameliyat kabını hazırlanan mikroskop operatörünün sıcak tablasına yerleştirin. Odağı ayarladıktan sonra, enjeksiyon iğnesini ICSI çalıştırma kabının PVP şeridine indirin. Enjeksiyon iğnesini U şeklindeki yolun sağ tarafındaki uzun şeride yerleştirin ve yüksek kaliteli spermatozoaları çıkarın. Spermi sağ taraftaki PVP şeridine aktarın ve spermi ameliyat kabının dibine yerleştirin. Enjeksiyon iğnesini sperm kuyruğunun orta veya alt kısmına hafifçe bastırın. Enjeksiyon iğnesini hızla geri çekin ve spermi hareketsiz hale getirmek için çizin. Şimdi, spermi kuyruktan başa doğru enjeksiyon iğnesine soluyun. Spermi oositin sitoplazmasına yavaşça enjekte edin ve enjekte edilen oositi inkübe edin. 1.5 mililitrelik steril konik tabanlı test tüpüne 15 mililitre %45 yoğunluk gradyan santrifüj çözeltisi ekleyin. Ve yavaşça %45 gradyan çözeltisinin dibine 1,5 mililitre %90 yoğunluk gradyan santrifüj solüsyonu ekleyin. Şimdi, sıvılaştırılmış spermi gradyan santrifüj çözeltisine ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 300 G'de döndürün. Süpernatanı çıkardıktan sonra, kalan sperm tortusunun yaklaşık 0,5 mililitresini toplayın ve üç mililitre döllenme ortamı ile karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Yaklaşık 0,2 mililitre tortu bırakarak süpernatanı dikkatlice pipetleyin, ardından tortuyu yeniden süspanse etmek için çalkalayın ve karıştırın. Son olarak, numuneyi daha sonra kullanmak üzere 37 santigrat derece,% 6 karbondioksit inkübatörde saklamadan önce sperm konsantrasyonunu ve hareketliliğini sayın. 25 mikrolitre düşük erime noktalı agaroz çözeltisi içeren bir tüpü 90 ila 100 santigrat derece su banyosuna bir ila iki dakika yerleştirin. Ardından, sıcaklık stabilize olana kadar tüpü beş dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna aktarın. Düşük erime noktalı agaroz tüplerine üç ila 10 mikrolitre meni ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımın 30 mikrolitresini yatay konumda önceden işlenmiş bir cam slayt üzerine bırakın. Kapladıktan sonra, ön işleme tabi tutulmuş cam sürgüyü dört dakika boyunca iki ila sekiz santigrat derecede bir buzdolabına koyun ve yatay konumda kalmasını sağlayın. Sürgüyü buzdolabından çıkarın ve kapak camını yavaşça kaydırarak çıkarın. Ön işlem görmüş cam slaytı yedi dakika boyunca denatüre edici solüsyona hızlı bir şekilde daldırın. Sürgüyü çıkarın ve dik durmasını sağlayın. Ardından, numune alanına dokunmadan fazla su damlacıklarını emmek için filtre kağıdı kullanın. Slaytı beş saniye boyunca damıtılmış suda yıkayın. Cam sürgüyü belirli bir süre için uygun solüsyonlara seri olarak daldırın. Daha sonra, ön işlem görmüş cam slaytı yatay tutarak, lam üzerine yaklaşık bir mililitre karışık boya çözeltisi ekleyin. Beş dakika boyunca lekeledikten sonra, vitray slaytı 10 ila 15 kez damıtılmış suyla nazikçe durulayın. İyi ilerleyici motiliteye sahip yüksek kaliteli sperm, U şeklindeki yolun kenarı boyunca düzgün bir şekilde yüzdü ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyon iğnesinin bunları ayrı ayrı kavramasını kolaylaştırdı. Her iki yöntem kullanılarak da iyi spermler elde edilirken, yoğunluk gradyanlı santrifüj yöntemi kullanılarak ayrıştırılan yüksek kaliteli spermlerin DNA Fragmantasyon İndeksi U şeklindeki yatay yüzme yöntemine göre anlamlı derecede yüksek bulunmuştur.