Name: Selenoprotein Oya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 9 s
Description: Öğrenin, termal kaydırma testi ile Selenoprotein O'ya substrat bağlanmasını nasıl araştırılacağını. Bu yöntem, protein-ligand etkileşimlerini yüksek verimlilikle analiz eder ve kristalografi için stabilizasyon koşullarını belirlemenize yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Protein-ligand etkileşimleri için yüksek verimli termal kayma testleri

<ol><li>Dunham, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genes%3A+Time+to+follow+the+roads+less+traveled%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Human genes: Time to follow the roads less traveled.</a> PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).</li>
<li>Kustatscher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+invitation+to+the+understudied+proteins+initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An open invitation to the understudied proteins initiative.</a> Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).</li>
<li>Jones, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+genomics+consortium%3A+A+knowledge+platform+for+drug+discovery%3A+A+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Rand+Health+Q%22%5BJournal%5D)">The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary.</a> Rand Health Q. 4 (3), 19(2014).</li>
<li>Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efi-est%2C+efi-gnt%2C+and+efi-cgfp%3A+Enzyme+function+initiative+%28efi%29+web+resource+for+genomic+enzymology+tools%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools.</a> J Mol Biol. 435 (14), 168018(2023).</li>
<li>Pace, C. N., Mcgrath, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stabilization+of+lysozyme+to+thermal+and+guanidine+hydrochloride+denaturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation.</a> J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Huynh, K., Partch, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+stability+and+ligand+interactions+by+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay.</a> Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformationally+responsive+dyes+enable+protein-adaptive+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.01.23.525251 (2023).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+performing+and+optimizing+differential+scanning+fluorimetry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102688(2023).</li>
<li>Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+applications+of+differential+scanning+fluorimetry+in+early-stage+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery.</a> Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).</li>
<li>Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+fluorescent+dyes+as+tools+for+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization.</a> Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).</li>
<li>Lucet, I. S., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ligand+binding+to+pseudokinases+using+a+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay.</a> Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).</li>
<li>Murphy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+methodology+to+subclassify+pseudokinases+based+on+their+nucleotide-binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties.</a> Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).</li>
<li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).</li>
<li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).</li>
<li>Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+analysis+of+thermofluor+data+can+readily+provide+quantitative+binding+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities.</a> Sci Rep. 9 (1), 2650(2019).</li>
<li>Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-ligand+interactions+using+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry.</a> J Vis Exp. (91), e51809(2014).</li>
<li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability%2C+protein+crystallization%2C+and+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).</li>
<li>Taujale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informatic+challenges+and+advances+in+illuminating+the+druggable+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome.</a> Drug Discov Today. 29 (3), 103894(2024).</li>
<li>Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+for+broke%3A+Targeting+the+human+cancer+pseudokinome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome.</a> Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).</li>
<li>Kung, J. E., Jura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+pharmacological+targeting+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).</li>
<li>Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+kinase-like+domain+in+a+selenoprotein%2C+widespread+in+the+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life.</a> PLoS One. 7 (2), e32138(2012).</li>
<li>Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mammalian+selenoprotein+o%3A+A+redox-active+mitochondrial+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein.</a> PLoS One. 9 (4), e95518(2014).</li>
<li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+ampylation+by+an+evolutionarily+conserved+pseudokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase.</a> Cell. 175 (3), 809-821 (2018).</li>
<li>Frese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alarmone+diadenosine+tetraphosphate+as+a+cosubstrate+for+protein+ampylation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279(2023).</li>
<li>Mostert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronucleotide+probes+reveal+a+diverging+specificity+for+ampylation+vs+umpylation+of+human+and+bacterial+nucleotide+transferases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases.</a> Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ydiu+domain+modulates+bacterial+stress+signaling+through+Mn2%2B-dependent+umpylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation.</a> Cell Rep. 32 (12), 108161(2020).</li>
<li>Mukherjee, M., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selenoprotein+o+substrates+using+a+biotinylated+atp+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog.</a> Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).</li>
<li>Kroeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edta+aggregates+induce+sypro+orange-based+fluorescence+in+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay.</a> PLoS One. 12 (5), e0177024(2017).</li>
<li>Kotov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+interrogation+of+protein+thermal+unfolding+data+with+moltenprot%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot.</a> Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).</li>
<li>Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dsfworld%3A+A+flexible+and+precise+tool+to+analyze+differential+scanning+fluorimetry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data.</a> Protein Sci. 33 (6), e5022(2024).</li>
<li>Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+buffer+cocktails+using+thermofluor%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, Pt 2 209-214 (2013).</li>
<li>Ribeiro, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+pseudoenzyme+classification%2C+evolution%2C+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling.</a> Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).</li>
<li>Goldberg, T., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+pseudoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of pseudoenzymes.</a> Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).</li>
<li>Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+pseudokinases%3A+A+look+at+the+untapped+enzymatic+potential+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases.</a> IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).</li>
<li>Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+and+let+die%3A+Insights+into+pseudoenzyme+mechanisms+from+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adenozin 5 & prime; - trifosfat disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383-10G</td>, <td>temsili sonuçlar için kullanılır, ancak mikroplaka</td></tr><tr><td>taşıyıcı tertibatlı TSA Avanti J-15R'yi</td> gerçekleştirmek için gerekli değildir <td>Beckman Coulter</td><td>C19416</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 384 Gerçek zamanlı PCR sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>12011452</td><td></td></tr><tr><td>Sert Kabuklu 384 Kuyulu PCR Plakaları, ince duvarlı, etekli, şeffaf/beyaz</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP3805</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>temsili sonuçlar için kullanılır ancak TSA</td></tr><tr><td>Manganez (II) klorür tetrahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3634-500G</td><td>temsili sonuçlar için kullanılır ancak performans için gerekli değildir TSA</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Plaka Sızdırmazlık Filmi, yapıştırıcı, optik</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Turuncu Protein Jel lekesi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5692-500UL</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5 birinci sınıf; -trifosfat trisodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6625-100MG</td><td>temsili sonuçlar için kullanılır ancak TSA'yı ölçmek için gerekli değildir</td></tr></tbody></table>

selenoprotein o'ya substrat bağlanmasını araştırmak için termal kaydırma testinin kullanılması

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Ökaryotik SelO, bir N-terminal mitokondriyal hedefleme dizisi, kinaz benzeri bir alan ve protein23'ün C-terminalinde yüksek oranda korunmuş bir selenosisteinden oluşur. Bu mitokondriyal yerleşik enzim, bakterilerden insanlara kadar korunan bir psödokinaz alanını kodlar23. Pseudomonas syringae'den elde edilen SelO homologunun yapısal analizi, kanonik kinazlara kıyasla ATP'nin ters bir oryantasyonda bağlanmasını kolaylaştıran aktif bölgede amino asit değişikliklerini ortaya çıkardı25. Buna göre, SelO, hücreleri oksidatif hasardan ve hücre ölümünden korumak için antioksidan sinyallemede yer alan çoklu proteinlerin fosforilasyonu yerine AMilasyonunu katalizeeder 25. AMPilasyona ek olarak, bazı prokaryotik ve ökaryotik AMTILAZLARIN UMPilasyonukatalize ettiği gösterilmiştir 27,28.
İki değerlikli katyonların varlığında ATP ve UTP nükleotidlerinin SelO'ya bağlanmasını incelemek için TSA'da saflaştırılmış rekombinant E. coli SelO kullandık. Kanonik kinazlara benzer şekilde SelO, aspartatın aktif bölgedeki nükleotidi koordine etmek için metal iyonunu bağladığı DFG motifini barındırır. İlk olarak, TSA'da sağlam floresan ölçümleri için protein ve boya konsantrasyonunu optimize ettik ve 5 μM ila 10 μM E. coli SelO'nun 5x SYPRO Orange ile optimal olduğunu belirledik (Şekil 2). Ayrıca, protein içermeyenin yanı sıra boya içermeyen kontrollerin, sıcaklık artışına yanıt vermeyen düşük floresan sinyaline sahip olduğunu gösterdik. ATP-Mg2+ ve ATP-Mn2+ varlığında E. coli SelO'nun termal stabilitesinde sırasıyla +4 °C ve +12 °C artışlar tespit ettik (Şekil 3). Bununla birlikte, UTP ile inkübasyon sırasında termal stabilitede bir kayma gözlemlemedik, bu da E. coli SelO'nun UTP'ye saptanabilir bağlanma göstermeyebileceğini gösteriyor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig01.jpg"> Şekil 1: Termodöngüleyici kurulumu. FRET kanalını kullanarak SYPRO Orange floresansını ölçerken numune sıcaklığını +0,5 °C/dk artırmak için kullanılan termodöngüleyici programına bir örnek. Öneri ayrıca protokolün başında ve sonunda bir ortam sıcaklığı inkübasyonunu da içerir. Kısaltma: FRET = Förster rezonans enerji transferi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig02.jpg"> Şekil 2: Protein ve boya konsantrasyonlarının optimizasyonu. (A) 5 μM Escherichia coli SelO kullanılarak SYPRO Turuncu boya konsantrasyonunun optimize edilmesinin temsili sonuçları. (B) 5x SYPRO Turuncu boya kullanılarak E. coli SelO konsantrasyonunun optimize edilmesinin temsili sonuçları. Termal denatürasyon eğrisi, sıcaklığa (x ekseni) göre bağıl floresan birimlerini (y ekseni) gösterir. Sonuçlar, üçlü kuyucuklardan elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig03.jpg"> Şekil 3: Nükleotid ve iki değerlikli katyonların varlığında SelO'nun termal denatürasyon eğrileri ve ΔTm analizleri.(A) RT-PCR makinesinden dışa aktarılan numunelerin (200 μM ATP veya UTP varlığında 5 μM Escherichia coli SelO ve 2 mM iki değerlikli katyon, 5x SYPRO Orange) termal denatürasyon eğrilerinin ham verileri ve çizildi. SelO ATP-Mg, SelO, ATP ve MgCl2 içeren numuneleri temsil eder, SelO ATP-Mn, SelO, ATP ve MnCl2 içeren numuneleri temsil eder, SelO UTP-Mg, SelO, UTP ve MgCl2 içeren numuneleri temsil eder, SelO UTP-Mn, SelO, UTP ve MnCl2 içeren numuneleri temsil eder. Boya ve protein içermeyen kontrollerin düşük floresan sergilediğini unutmayın. Sonuçlar, üçlü kuyucuklardan elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder (n = 3). (B) En yüksek yoğunluğa çizilen ve Boltzmann sigmoidal denklemine uyan termal denatürasyon eğrileri. SelO'nun termal denatürasyonu UTP'den etkilenmese de, ATP (mor eğriler) varlığında termal denatürasyonda belirgin bir kayma gözlemledik. Sonuçlar, üçlü kuyucuklardan elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder (n = 3). (C) Şekil 3B'de temsil edilen verilerin Boltzmann sigmoidal uyumundan türetilen Tm değerlerini gösteren histogram. Sonuçlar, üçlü kuyucuklardan elde edilen ortalama ± SD'yi temsil eder (n = 3). SelO 39.2 °C ± 0.085, SelO ATP-Mg 43.3 °C ± 0.133, SelO ATP-Mn 50.9 °C ± 0.085, SelO UTP-MG 39.1 °C ± 0.056, SelO UTP-Mn 39.9 °C ± 0.087. (D) Erime sıcaklığındaki değişimi gösteren histogram ΔTm (Tm katkı maddesi - Tm tamponu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo S1: Metallerin ve nükleotidlerin varlığında SelO'nun TSA'sı için örnek veriler. RT-PCR makinesinden dışa aktarılan ham verilerin elektronik tablosu ve protokol adımları 5.1 ve 5.2'de açıklandığı gibi maksimum RFU yoğunluğundan sonraki değerleri silmek için işlenen veriler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

utilizing-thermal-shift-assay-to-probe-substrate-binding-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Bu el yazması, mutasyonlar termo için ekran insan serotonin taşıyıcı arındırmak, yüksek afiniteli antikorların üretilmesi ve antidepresan ilaç S -citalopramın bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksi kristalize açıklamaktadır. Bu protokol için diğer zor membran ileticileri, reseptör ve kanal çalışması için adapte edilebilir.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Burada sunulan, protein-nüklik asit etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak uygulanabilir olan biotin etiketlerini kullanarak in vitro biyokimyasal kurallara yönelik protokollerdir.

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Sağlam hücrelerde aday inhibitörleri tarafından hedef nişan değerlendirmek için yeteneği ilaç keşfi için çok önemlidir. Bu protokol, vahşi tip SHP2 veya onkojenik varyantlarını hedefleyen inhibitörlerin hücresel hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan 384 iyi biçimli hücresel termal değişim testini tanımlar.

Hücresel Hedef Etkileşiminin SHP2 (PTPN11) Fosfataz Inhibitörleri ile Değerlendirilmesi

Bu protokol, GST ile kaynaşmış TPR motifli yardımcı refakatçiler ve Hsp90 türevli peptit ile birleştirilmiş alıcı boncuklar ile glutatyon bağlantılı donör boncuklar kullanarak protein-protein etkileşimlerini yoklama tekniği sunar. Bu tekniği, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.

Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları

Burada kullanılan deney, küçük moleküller ve protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için hücresel termal kayma testi ile birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.

Küçük moleküllü bileşiğin protein hedef tahmini ve validasyonu

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Burada, enzimatik modifikasyon deneyleri için maya yüzeyinde görüntülenen substratların kullanılması için bir protokol sunuyoruz. Platform, temsili bir enzimatik modifikasyon deneyi olarak tirozin fosfataz SHP-2'nin substratlarından birine karşı defosforilasyon aktivitesinin analizi kullanılarak gösterildi.

Maya Yüzeyinde Görüntülenen Proteinlerin Enzimatik Modifikasyonu ve Akış Sitometrisi Değerlendirmesi

Öğrenin, termal kaydırma testi ile Selenoprotein O'ya substrat bağlanmasını nasıl araştırılacağını. Bu yöntem, protein-ligand etkileşimlerini yüksek verimlilikle analiz eder ve kristalografi için stabilizasyon koşullarını belirlemenize yardımcı olur.

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Daha fazla video keşfet