Name: C. elegansta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Keşfedin, CaFE raportörü kullanarak C. elegans'ta döllenme ve erken embriyogenez sırasında kalsiyum dinamiklerini görselleştirme yöntemini. Gecikmiş kalsiyum dalgalarını ve tek hücreli geçişleri inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>C. elegans'ın Erken Gelişim Evrelerinde Kalsiyumun İzlenmesi

<ol><li>Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+calcium+signalling+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulators of calcium signalling at fertilization.</a> Open Biol. 10 (7), 200118(2020).</li>
<li>McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcium+signaling+and+the+actin+cytoskeleton+in+the+membrane+block+to+polyspermy+in+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biolo+Reprod%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs.</a> Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).</li>
<li>Takayama, J., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+TRP-3+channel+mediates+the+onset+of+a+Ca+2%2B+wave+in+the+fertilized+C.+elegans+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte.</a> Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).</li>
<li>Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Start+me+up%3A+Cell+signaling+and+the+journey+from+oocyte+to+embryo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans.</a> Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).</li>
<li>Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+A+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).</li>
<li>Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soma-germline+interactions+that+influence+germline+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).</li>
<li>Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+biphasic+calcium+wave+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+genetically+encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator.</a> Biol Open. 12 (9), 059832(2023).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methods+for+measuring+induction+of+the+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (161), e61030(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kamath, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-45+is+required+for+NMY-2+contractile+function+in+early+embryonic+polarity+establishment+and+germline+cellularization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans.</a> Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).</li>
<li>Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+live+imaging+of+calcium+waves+and+other+cellular+processes+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Reboul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+ORFeome+version+1.1%3A+experimental+verification+of+the+genome+annotation+and+resource+for+proteome-scale+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression.</a> Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).</li>
<li>Bui, Y. K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+inositol+5-phosphatase+homolog+negatively+regulates+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+signaling+in+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation.</a> Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).</li>
<li>Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+along+the+cleavage+furrows+in+cleavage-stage+Xenopus+embryos+and+its+inhibition+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin.</a> J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).</li>
<li>Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+vertebrate+development+and+its+role+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease.</a> Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).</li>
<li>Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+calcium+code%3A+A+review+of+calcium+activity+analysis+methods+employed+to+identify+meaningful+activity+in+early+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development.</a> Biomolecules. 14 (1), 138(2024).</li>
<li>Goldstein, B., Hird, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+anteroposterior+axis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).</li>
<li>Johnston, W. L., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+in+the+C.+elegans+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition.</a> Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).</li>
<li>Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+self-selecting+and+clone-free+integration+of+transgenes+into+engineered+CRISPR+safe+harbor+locations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).</li>
<li>Zacharias, A. L., Walton, T., Preston, E., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+nuclear+%CE%B2-catenin+and+TCF+pattern+embryonic+cells+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in nuclear β-catenin and TCF pattern embryonic cells in C. elegans.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005585(2015).</li>
<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during zebrafish embryonic development.</a> BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).</li>
<li>Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteration+in+an+inquiry-based+undergraduate+laboratory+strengthens+student+engagement+and+incorporation+of+scientific+skills%5BTitle%5D)+AND+%22J+Scholarsh+Teach+Learn%22%5BJournal%5D)">Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills.</a> J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-07-4</td><td>2 kg; Toz, pullardan daha kolay çözünür</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>MidSci</td><td>BE-A125</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Alkol lambası</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13475</td><td>%95 etanol ile kullanın</td></tr><tr><td>Amonyum klorür (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1500030</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>5 g</td></tr><tr><td>AMSCO 400 Serisi Küçük Buharlı Sterilizatör</td><td>Steris Sağlık Hizmetleri</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Bacto-tripton</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11470.18</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Dragonfly 200 eğirme diski konfokal</td><td>Oxford Instruments Andor</td><td>N/A</td><td>Leica mikroskobu ile kullanılır</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Sitojenik Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-035-900</td><td>Paket başına 144 slayt</td></tr><tr><td>Düz Burunlu Pense, Pürüzsüz Çene</td><td>Home Depot</td><td>305530604</td><td>Pensenin düz çeneli olduğundan emin olun</td></tr><tr><td>İzopropil &beta;- d-1-tiyokalaktopiranosit&nbsp;( IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td>10 g; dioksan içermeyen</td></tr><tr><td>Laboratuvar bandı</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td>Mikroskop slaytlarını bantlamak için 0,5 inç bant kullanılır</td></tr><tr><td>Levamizol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC187870100</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat (MgSO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541016</td><td>1 oz paket</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti2 lazer tarama konfokal</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements yazılımı</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Konfokal</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Platin Tel</td><td>TriTech</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA1159436</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik heptahidrat (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S471-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Leica</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Steril Petri çanak (35 mm x 10 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229638</td><td>Kutu başına 960 Petri kabı</td></tr><tr><td>Steril Petri kabı (60 mm x 15 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229665</td><td>Kutu başına 500 Petri kabı</td></tr><tr><td>Suş EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td>EAG16</td><td>Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Suş EAG25 spn-4p::jGCaMP7s:: PASTA-1U; ujIs113 II.</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td>EAG25</td><td>Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Suşu EAG28 tarafından oluşturuldu spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td>EAG28</td><td>Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Suşu tarafından oluşturuldu JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mKiraz::let-858 3'UTR + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td>JIM113</td><td>Oluşturan E. Preston - Murray Lab</td></tr><tr><td>Suşu OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td>OD70</td><td>Oluşturan Audhya/Oegema - Greenstein Lab</td></tr><tr><td>Tritech Solucan Çekme Kolu</td><td>TriTech</td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49160</td><td>500 g</td></tr></tbody></table>

c. elegans'ta döllenme ve erken gelişim sırasında kalsiyum geçişlerinin İn vivo olarak görüntülenmesi

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Bu yazıda özetlenen protokoller kullanılarak, döllenme ve embriyogenezde kalsiyum sinyalizasyonunun dinamik paternleri C. elegans'ta gözlenmiştir.
CaFE raportörünü içeren solucanlarda tipik bir döllenme dizisi Şekil 2'de gösterilmektedir. Analizi kolaylaştırmak için, CaFE raportörünü bir pleckstrin homoloji alanı (PH-mCherry) transgeni13 ile birleştiren EAG28 suşu kullanıldı. PH-mCherry markörü plazma zarına lokalize olur ve özellikle gonad kolundaki hücre sınırlarının daha kolay görselleştirilmesini sağlar. EAG28 suşu, CaFE raportörünü içeren EAG16 suşunun, OD70 PH-mCherry raportör suşu13 ile çaprazlanmasıyla oluşturuldu. C. elegans'ta yumurtlama ve döllenme aynı anda gerçekleşir. Döllenme zamanı 0, yumurtlayan oositte bir floresan sinyalinin tespit edildiği ilk çerçeve olarak kabul edilir (Şekil 2). Oositin ön kenarı, sperm7 için depolama organı olan spermatheca'ya girer girmez sperm füzyon bölgesinde parlak bir floresan patlaması meydana gelir. Sinyal, yumurtlama tamamlanmadan önce görünür. Kalsiyum dalgası iki fazlıdır, hızlı bir başlangıç patlaması ve ardından giriş noktasından karşı kutba doğru bir floresan dalgası gelir. Oositin tamamı &lt;30 s'de floresan hale gelir.
CaFE raportörünün tek bir kopya halinde olduğunu ve bu nedenle sinyalin diğer transgenler kadar parlak olmadığını unutmayın. Yumurtlama sırasında Z-stack hızlandırılmış çekim, dönen bir disk konfokal mevcut ve optimize edilmiş olmadıkça önerilmez. Z yığını görüntüleri, gonad morfolojisindeki 3B değişiklikleri yakalamak için bir filmden önce veya sonra elde edilebilir. Buradaki görüntüler konfokal bir mikroskopla çekilmiş olsa da, geçici olaylar, konfokalden daha yaygın ve uygun fiyatlı olan geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak da gözlemlenmiştir. Lazer taramalı bir konfokal kullanarak, kare hızı yaklaşık 1 fps'dir. Dönen bir disk konfokal kullanarak, kare hızı 10 fps veya daha hızlıdır. CaFE raportörünün arka plan sinyali, gonad kolundaki olgunlaşan oositleri aydınlatmak için yeterlidir. Döllenme üzerine, GFP sinyal yoğunluğunda tipik olarak 1,5-2 kat artış gözlenir.
Kantitasyon için çeşitli alternatif yöntemler mevcuttur. Örneğin, Oxford Instruments (Andor Dragonfly eğirme diski konfokal mikroskobu ile aynı ana şirket) tarafından oluşturulan Imaris görüntü analiz yazılımı, daha büyük bir yatırım getirisi yerine her karedeki sinyali yalnızca geçiş yapan oositten ölçme yeteneğine sahiptir. Ancak, Imaris yazılımı ücretsiz değildir. Ek olarak, oositteki kalsiyum dalgalarını ölçmek için ayrıntılı bir görüntü analizi stratejisi Takayama, Fujita ve Onami tarafından mükemmel bir şekilde ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve ücretsiz olarak kullanılabilen ImageJ'yi kullanır14. Alternatif olarak, tek bir oosit boyunca floresan sinyal dalgasını göstermek için kullanılan kimografiler, burada açıklanandan daha kapsamlı görüntü manipülasyonu gerektirir, ancak Takayama ve Onami3'te açıklanmıştır.
C. elegans'ın belirgin bir avantajı, endojen RNAi'yi tetiklemek için dsRNA eksprese eden solucan bakterilerini besleyerek hemen hemen her genin ekspresyonunu yıkma yeteneğidir15,16. Optimal dsRNA ekspresyonu için, hem RNAi plakaları hem de doymuş RNAi kültürü IPTG içerir. DsRNA, ilgilenilen genin yan promotörlerle ifade edilmesiyle üretilir. Burada, 16.256 bakteri suşu kullanarak solucan genomunun çoğunu hedefleyen Ahringer kütüphanesini kullandık17. Alternatif olarak, Vidal laboratuvarı tarafından Gateway sistemi kullanılarak ~11.000 RNAi klonundan oluşan bir ORFeome oluşturuldu ve Horizon Discovery18 aracılığıyla satın alınabilir.
CaFE raportörünün RNAi ile kombinasyon halinde faydasını göstermek için erken yumurtlamayı inceledik. İpp-5'teki kısmi bir delesyon, hem -1 oosit hem de -2 oositin aynı yumurtlama19 sırasında spermatekaya girdiği bir çift yumurtlama olayına neden olur. IPP-5, IP3'e etki eden ve IP3 ikinci haberci seviyelerini etkili bir şekilde azaltan bir fosfatazdır. IPP-5'in RNAi yıkımının, mutanta benzer bir çift yumurtlama fenotipini ortaya çıkardığını bulduk.
IPP-5 RNAi yıkımının neden olduğu çift yumurtlama sırasında CaFE raportörünün analizi, OET'in yeni yönlerini ortaya çıkardı. İlk olarak, spermatekaya girişte hemen önce -1 oositte bir kalsiyum sinyali gözlendi, ancak sondaki -2 oositte gözlenmedi (Şekil 3). 2 oosit yumurtlanmasına rağmen, -1 oosit hala uygun olgunlaşma belirtileri, özellikle de nükleer zarfın parçalanması (NEBD) gösteren tek oosittir. Bu veriler, -2 oositin sperm varlığında olmasına rağmen, henüz düzgün bir şekilde olgunlaşmadığı için döllenmeye yetkin olmadığını göstermektedir. İkincisi, -2 oosit, tipik olarak oosit uterus için spermatekadan çıktığında gecikmiş bir kalsiyum dalgası sergiler. Oosit olgunlaşması normalde yumurtlama için bir ön koşul olmasına rağmen, bu veriler oositin olgunlaşmasının ve döllenme yetkinliğinin yumurtlamadan sonra da gerçekleşebileceğini düşündürmektedir. IPP-5 yıkımı sırasında gecikmiş kalsiyum dalgasının görselleştirilmesi, CaFE raportörünün gübreleme yeterliliğini ve zamanlamasını sorgulamak için avantajlarını vurgular.
Ayrıca, CaFE raportörünün yumurtlayan yumurtalarda tespit edilebilir olduğunu ve C. elegans'ta erken embriyogenez sırasında tek hücreli kalsiyum geçişlerini ortaya çıkardığını keşfettik. Senkronize Gün 1 yetişkin EAG28'den (CaFE; PH-mCherry) solucanları, Zyla kamerası kullanılarak Andor Dragonfly eğirme diski konfokal olarak bölüm 1-5'teki protokoller kullanılarak görüntülendi (Şekil 4). Kalsiyum geçişleri tek hücrelerle sınırlıdır ve tamamlanması döllenme kalsiyum dalgasından daha az zaman alır (~ 9 s, n = 11). Bununla birlikte, embriyogenez sırasındaki kalsiyum dalgası bifazik görünmemektedir. 8 hücreli aşamadan önce kalsiyum geçişleri gözlenmedi. Özellikle, kalsiyum, insanlar ve Xenopus20,21,22 dahil olmak üzere diğer birçok organizmada görüldüğü gibi, C. elegans'ta bölünme karıklığına lokalize olmaz. Tek hücreli kalsiyum geçişleri, gastrulasyondan iyi bir şekilde sonra (döllenmeden ~ 200 dakika sonra) ve bırakılan yumurtalarda gözlendi. Tek bir embriyo, zaman içinde, ancak farklı hücrelerde ve tipik olarak bir seferde bir hücrede birden fazla kalsiyum geçişi gösterir. Lazer stimülasyonuna sürekli maruz kalmanın embriyolara zarar vereceğini unutmayın. Daha düşük LED/lazer gücü veya süreksiz maruz kalma önerilir. Bununla birlikte, kalsiyum dalgaları ~ 9 s'de nispeten kısa olduğundan, LED / lazer stimülasyon olayları arasında 2 s'den daha yavaş olmasını önermiyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig01.jpg"> 
Resim 1: C. elegans gonad kolu. EAG25 solucan suşundan bir gonad kolunun görüntüsü, CaFE raportörü GFP'yi (yeşil) ve germ hattındaki çekirdekleri vurgulayan histon 2B-mCherry işaretleyicisini (kırmızı) gösteriyor. Proksimal oosit, spermin depolandığı spermatekadan hemen önce -1 ile gösterilir (ok). Spermatekaya en yakın ancak rahim içinde yer alan embriyo en yeni çıkan embriyodur. Görüntü, Nikon ECLIPSE Ti2 lazer taramalı konfokal kullanılarak çekilmiştir. Ölçek çubuğu = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig02.jpg"> 
Şekil 2: Döllenme sırasında kalsiyum dalgasının görselleştirilmesi. EAG28 solucan suşunda döllenme sırasında hücre içi kalsiyumu yansıtan floresan zaman serisi görüntüleri. EAG28 suşu, hem CaFE raportörünü (yeşil) hem de plazma zarlarını vurgulayan bir pleckstrin-homoloji alanı-mCherry füzyonunu (sarı) içerir. 0 zamanı, oositteki floresan sinyalinde net bir artışı gösteren ilk kareyi gösterir. Zaman 24.4 s, tüm oosit floresansını gösteren ilk kareyi yansıtır. Zaman serisi görüntüleri, bir Zyla kamera ile Andor Dragonfly eğirme diski konfokal kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig03.jpg"> 
Şekil 3: Bir ipp-5 RNAi ile indüklenen çift yumurtlama olayı sırasında kalsiyum dalgaları. ipp-5 RNAi'ye maruz kalan bir EAG16 suşunda (GFP yeşilinde CaFE) -1 oosit ve -2 oositin sıralı kalsiyum dalgalarının hızlandırılmış görüntüleri. -40.0 s çerçevesi, -1 oosit (-1), -2 oosit (-2), spermateka (*) ve +1 embriyo (+1) için etiketler içerir. Zaman 0 s, -1 oositin kalsiyum dalgasının floresansındaki ilk artışı gösterir. Zaman 4.5 s, -1 oositte karşı kutba doğru yayılan kalsiyum dalgasını gösterir. Zaman 70.5 s, başlangıç GFP sinyalinde -2 oosit ile birlikte -1 oositte tüm hücre floresansını gösterir; Her iki oosit de spermatheca'da bulunur. Döllenmiş -1 oosit ve döllenmemiş -2 oosit 158.3 s'de uterusa girer. 219.3 s'de, -2 oosit geç bir floresan kalsiyum dalgası gösterir. Görüntüler, bir Zyla kamera ile Andor Dragonfly eğirme diski konfokal kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu = 30 μM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig04.jpg"> 
Şekil 4: Erken embriyogenezde tek hücreli kalsiyum geçişleri. (A) Embriyolar utero ve (B) ex utero (yumurtlayan yumurta) embriyogenez sırasında tek bir hücrede floresan sinyali gösterdi. Görüntüler, bir Zyla kamera ile Andor Dragonfly eğirme diski konfokal kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

in-vivo-visualization-calcium-transients-during-fertilization-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir...

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Bu video, kalsiyum görüntülemenin arkasındaki kavramları tanıtır ve kalıplanmış agaroz kuyularında bulunan solucanların hızlandırılmış görüntülemesi için örnek bir protokol içerir.

Kalsiyum Görüntüleme: Canlı C. elegans'ta Nöral Aktiviteyi Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Bu video, genetik olarak kodlanmış floresan raportör proteinleri kullanarak Caenorhabditis elegans gibi davranan bireysel nöronlarda kalsiyum görüntüleme tekniğini göstermektedir. Hücre içi kalsiyum seviyelerini nöronal aktivite ve yumurtlama sırasındaki davranış değişiklikleri ile ilişkilendirmek için solucan hareketinin görüntülenmesinde ve nöronlardan gelen raportör floresan oranlarının ölçülmesinde yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir.

Caenorhabditis elegans'ta Yumurtlama Davranışını Düzenleyen Bireysel Nöronlarda Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Bancroft, E. A., {{}} ve diğerleri. Spontan Ca2+{{}} Akıları ve Aşağı Akış Etkilerinin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm.  (2020) {{TAG_ 46}}Bu video, fare embriyolarından türetilen ventral orta beyin nöronlarındaki kalsiyum akışının gerçek zamanlı görselleştirmesini göstermektedir. Bir kalsiyum indikatörünü ifade etmek için viral bir vektör kullanılarak, nöronlar, spontan ve nörotransmitter kaynaklı kalsiyum aktivitesi sırasında floresan yoğunluğundaki değişiklikleri izlemek için konfokal bir...

Fare Embriyolarından Türetilen Ventral Orta Beyin Nöronlarında Kalsiyum Akışının Görselleştirilmesi

Kaynak: Doser, R., et al. Nöronal Kalsiyum İşleminin In Vivo Hücre Altı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, transgenik Caenorhabditis elegans suşlarının ventral sinir kordonu nöronlarındaki hücre altı kalsiyum akışının in vivo görüntülemesini göstermektedir. İki farklı kalsiyum indikatörü kullanılır: bir suşta bir sitoplazmik indikatör ve diğerinde bir mitokondriyal indikatör kullanılır. Nöronlar, nöronal sitoplazma ve mitokondri içindeki floresan yoğunluğundaki gerçek zamanlı...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında Hücre Altı Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Xenopus embriyolarında, blastocoel'in çatısından alınan hücreler pluripotenttir ve çeşitli dokular oluşturmak üzere programlanabilir. Burada, erken nöral gelişimin temel in vivo ve in vitro özelliklerini araştırmak için bir test sistemi olarak amfibi blastocoel çatı eksplantlarını kullanma protokollerini açıklıyoruz.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Keşfedin, CaFE raportörü kullanarak C. elegans'ta döllenme ve erken embriyogenez sırasında kalsiyum dinamiklerini görselleştirme yöntemini. Gecikmiş kalsiyum dalgalarını ve tek hücreli geçişleri inceleyin.

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet