C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Canlı embriyoların üretimi karmaşık bir süreçtir. Genel hedefimiz, bir oositten bir embriyoya geçişi koordine eden hücresel sinyalleri tanımlamaktır. CaFE raporlayıcısı, döllenme sırasında ve erken embriyogenez sırasında meydana gelen kalsiyum sinyallerini görselleştirmek için geliştirilmiş yeni bir araçtır.

CaFE raportörünü kullanarak, erken yumurtlayan oositlerde gecikmiş bir kalsiyum dalgası keşfettik. Ayrıca erken embriyogenez sırasında tek hücreli kalsiyum geçişlerinin varlığını da keşfettik. Her iki bulgu da erken gelişim sırasında genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum indikatörünün faydasını göstermektedir.

Kalsiyum oositlerini görselleştirmek için önceki teknikler, gonad içine boya enjeksiyonuna dayanıyordu. Bu teknik emek yoğundur ve özel mikro enjeksiyon ekipmanı gerektirir. CaFE raporlayıcı, yaygın olarak bulunan ekipmanlarla oositlerde ve embriyolarda kalsiyum dalgasının kolayca görselleştirilmesini sağlar.

CaFE Reporter, oositlerde ve embriyolarda kalsiyum sinyalizasyonunun zamanlaması ve düzenlenmesi ile ilgili araştırmaları kolaylaştırır. Bu raportör, kalsiyumun miyotik olgunlaşma gibi erken embriyogenez sırasındaki diğer dönüm noktası olaylarına göre davranışını ortaya çıkarmak için mevcut mutantlar, belirteçler ve RNAi knockdown'ları ile kolayca birleştirilebilir. Başlamak için, solucan toplama sapını tutun ve gümüş bileziği kafasına doğru gevşetin, böylece dört bölüm birbirinden ayrılır.

Dört bölümün ortasına 1,5 inçlik bir platin tel yerleştirin. Dört bölümü bir araya getirmek için bileziği sıkarken teli merkezde tutun. Bir çift düz burunlu pense kullanarak, teli dikkatlice şekillendirin ve yaklaşık iki ila üç milimetrelik bir ayak oluşturmak için telin ucunu tekrar tekrar sıkıştırın.

Solucanları toplamak için bu ayağı kullanın. Suda% 3'lük bir agaroz çözeltisi hazırlayın ve agaroz tamamen eriyene kadar mikrodalgada ısıtın. Uzun eksen boyunca tek bir laboratuvar bandı tabakasına sahip diğer iki mikroskop lamı arasına boş bir mikroskop lamı yerleştirin.

Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, ısıtılmış %3 agaroz solüsyonunu boş sürgünün ortasına bırakın. Damlacık bitişik bantlanmış slaytlar üzerinde duracak şekilde, boş slayta dik olarak agaroz damlacığının üzerine hızlı bir şekilde yeni bir mikroskop lamı yerleştirin, ardından pedi sağlam tutarak slaytları nazikçe ayırın. 20 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, solucanları felç etmek için agaroz pedin ortasına M9 tamponunda küçük bir damla bir milimolar levamisol ekleyin.

En az beş senkronize solucan seçin ve solucanları aktarmak için solucan toplama sapının ayağını levamisol damlacığına hafifçe dokundurun. Agaroz pedini bir kapak fişi ile dikkatlice örtün. Solucanların yerini kontrol edin, çünkü kapak kayması solucanların dağılmasına neden olabilir.

Mikroskop slaytını, solucan suşunun adı gibi uygun ayrıntılarla etiketleyin. Parlak alan aydınlatması kullanarak mikroskopta düşük güçlü bir objektif kullanarak solucanları bulun. Oositlerdeki kalsiyum dalgasını net bir şekilde görselleştirmek için en az 20x hava hedefi veya 40x'lik bir daldırma hedefi kullanın.

Floresan raportörlerin en iyi şekilde görselleştirilmesi için, GFP ve RFP kanallarının kazanç veya pozlama süresini ayarlayın. Bir döllenme olayının yakın olup olmadığını belirlemek için solucanın gonad kollarındaki her eksi bir oositi inceleyin. Nükleer zarf parçalanmasından sonra, en proksimal eksi bir oositin hücre iskeleti yeniden düzenlenecek, yuvarlak bir görünüm alacak ve eksi iki oositten ayrılacaktır.

Yumurtlama yakın zamanda gerçekleştiğinde, videoyu hemen geniş alan ayarında kaydetmeye başlayın. Proksimal oosit, spermin depolandığı spermatheca'dan hemen önce eksi bir ile gösterilir. En son embriyo spermatheca'ya en yakın yerde, ancak uterusun içinde bulunur.

Kalsiyum dalgası, hızlı bir patlama ile başlayan ve ardından giriş noktasından karşı kutba doğru hareket eden bir floresan dalgası ile başlayan iki fazlı bir model sergiledi. Spermatekaya girişten hemen sonra önde gelen eksi bir oositte bir kalsiyum sinyali gözlendi, ancak sondaki eksi iki oositte gözlenmedi. Rahim içi ve rahim dışı embriyolar, embriyogenez sırasında tek bir hücrede bir floresan sinyali gösterdi.