Name: Rapamisin ile Düzenlenmiş Tirozin Fosfatazların Geliştirilmesi ve Uygulanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Keşfedin, rapamisin düzenlemeli sistemle canlı hücrelerde tirozin fosfataz aktivitesini nasıl kontrol edebilirsiniz. HEK-293T hücrelerinde SHIP-2 fosfatazının hücre yayılması ve göçü üzerindeki etkilerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Rapamisin Tarafından Düzenlenen Sistem ile Fosfataz Aktivitesinin Zamansal Düzenlenmesi

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

Protein tirozin fosfatazlar, çok sayıda hücre sinyalleme olayında yer alan kritik bir protein ailesidir. Hücre proliferasyonunun, göçünün ve apoptozun düzenlenmesinde kilit bir rol oynadıkları gösterilmiştir 1,2,3. Sonuç olarak, protein tirozin fosfatazların düzensizliği çeşitli zayıflatıcı hastalıklara ve bozukluklara yol açar 4,5,6,7. Tirozin fosfatazların fizyolojik fonksiyonunu ve bu patolojilerin gelişimindeki rollerini incelemek, fosfataz sinyallemesininkarmaşıklıklarını araştırmak için gerekli araçların eksikliği nedeniyle tarihsel olarak engellenmiştir 8.
Geleneksel olarak fosfatazlar, istenen özgüllüğe sahip olmayan ve/veya aktivitelerinin zamansal kontrolünü sağlamayan yöntemler kullanılarak incelenir. Mevcut araçların bu kritik sınırlamaları, sinyal yollarındaki fosfatazların belirli rollerini incelemeyi zorlaştırmaktadır. Yapısal olarak aktif ve baskın negatif mutantların aşırı ekspresyonu veya fosfatazın ekspresyonunun aşağı regülasyonu özgüllük sağlar, ancak zamansal kontrolden yoksundur ve sıklıkla enzimin gerçek işlevini maskeleyecek telafi edici mekanizmaları tetikleyebilir.
Farmakolojik inhibitörler, fosfatazların zamansal regülasyonuna izin verir. Bununla birlikte, birçok fosfataz inhibitörü, tirozin fosfatazlar9'daki aktif bölgenin iyi korunmuş bileşimi nedeniyle herkesin bildiği gibi spesifik değildir. Ek olarak, tasarım kısıtlamaları nedeniyle, katalitik bölgeyi hedefleyen inhibitörler zayıf hücre zarı geçirgenliğisergiler 10. İnhibitörlerin bir başka sınırlaması, sadece fosfataz inaktivasyonunun11 etkilerinin incelenmesine izin vermeleridir. Bu nedenle, fosfatazların spesifik, zamansal olarak düzenlenebilir aktivasyonunu sağlayan araçlara ihtiyaç vardır. Bu araçlar, araştırmacıların fosfataz aktivasyonunun doğrudan etkilerini tanımlamalarına ve bunları genellikle biyolojik uyaranlarla aktive edilen çoklu paralel sinyal kaskadlarından ayırmalarına olanak tanıyacaktır. Daha da önemlisi, aktivitenin sıkı zamansal kontrolü, bir fosfataz tarafından indüklenen geçici olayların tanımlanmasını sağlar ve akut ve uzun süreli fosfataz aktivitesinin etkilerini ayırır. Zamansal düzenlemenin mutasyon analizi ile birleştirilmesi, fosfatazın bireysel alanlarının belirli rollerinin ayrıntılı bir diseksiyonuna ve aşağı akış sinyalizasyonununsorgulanmasına izin verecektir 12.
Mevcut araçlarda istenen yeteneklerin eksikliğini gidermek için Karginov grubu, Rapamisin Düzenlenmiş (RapR) sisteminigeliştirdi 13,14,15. RapR sistemi, ilgilenilen proteinin (POI) allosterik regülasyonuna izin veren tasarlanmış bir anahtar alanı olan iFKBP'yi kullanır. iFKBP alanının, POI'nin katalitik bölgesine allosterik olarak bağlanmış bir konuma yerleştirilmesi, onu rapamisin tarafından regülasyona duyarlı hale getirir. Rapamisin yokluğunda, iFKBP, iFKBP'nin doğası gereği yüksek yapısal dinamikleri nedeniyle katalitik bölgeyi bozar ve böylece POI'yi etkisiz hale getirir. Rapamisin ilavesi, iFKBP'nin birlikte eksprese edilen protein FRB ile etkileşimini indükler (Şekil 1). Bu, anahtar alanının stabilizasyonuna neden olur ve bu da sonuç olarak POI'nin katalitik alanının yapısını ve işlevini geri yükler. Bu nedenle araç, POI'nin spesifik ve geçici olarak düzenlenebilir aktivasyonuna izin verir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg"> Şekil 1: RapR-Shp2 rapamisin tarafından düzenlenen sistemin şeması. RapR, rapamisin ilavesiyle ilgilenilen proteinin allosterik aktivasyonuna izin verir. Bu rakam Fauser ve ark.12'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: iFKBP = takılabilir FKBP12; FRB = FKBP-rapamisin bağlama alanı; R = rapamisin; Shp2 = Src homolojisi-2 alanı içeren protein tirozin fosfataz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
RapR aracı farklı protein ailelerine uygulanabilir. Protein kinazların yanı sıra fosfatazları(fosfatazlar) düzenlemek için kullanılabilir 12,14. Bu protokol, Shp2 fosfatazı kontrol etmek için RapR aracının uygulanmasına odaklanacaktır. Shp2, proliferasyon, migrasyon, immünomodülasyon ve farklılaşmagibi sinyalleme süreçlerinde yer alan, her yerde eksprese edilen bir protein tirozin fosfatazdır 1,16,17,18. Shp2'nin düzensizliği bir dizi katı kanser, miyeloid lösemi ve gelişimsel bozukluklarla ilişkilendirilmiştir 5,7. Bununla birlikte, Shp2, yukarıda açıklandığı gibi aynı araç eksikliklerinin kurbanı olmuştur. Bu sınırlamalarla mücadele etmek için, özel ve zamansal olarak düzenlenebilir bir Shp2 yapısı olan RapR-Shp2 geliştirildi ve karakterize edildi12.
RapR-Shp2'nin geliştirilmesinden önce, Shp2'nin hücre göçünde rol oynadığı biliniyordu 19,20,21. Bununla birlikte, bu süreçte yer alan sinyalizasyondaki özel rolü bilinmiyordu. Shp2'nin hangi zaman ölçeğinde hücrelerin göçünü düzenlediği ve aktivasyonunun farklı zaman noktalarında hangi spesifik morfodinamik değişiklikleri indüklediği de bilinmiyordu. Ayrıca, Shp2'nin akut ve uzun süreli aktivasyonunun farklı etkilere neden olup olmayacağı belirsizdi. RapR-Shp2 kullanılarak, Shp2'nin akut aktivasyonunun geçici hücre yayılmasına, çıkıntılarda artışa, hücre polarizasyonuna ve göçe neden olduğu bulundu. Farklı morfodinamik değişiklikleri düzenleyen Shp2'nin akış aşağısındaki spesifik yollar da tanımlanmıştır12. Bu protokol, diğer RapR fosfatazlarının geliştirilmesine ve uygulanmasına rehberlik etmek için kullanılabilecek RapR-Shp2'nin tasarımı ve karakterizasyonu için ayrıntılar sağlar.

<table><tbody><tr><td># 1.5 Cam Lameller 25 mm Yuvarlak</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Tüpler</td><td>USA Scientific</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr>500 mL için<td>2x Laemmli Tampon</td><td></td><td></td>: <td>5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL gliserol, 52.5 mL %20 SDS, 0.5 g bromofenol mavisi, son pH 6.8</td></tr><tr><td>%4-20 Mini-PROTEAN TGX Prekast Jel</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Tampon</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 Hücreler</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Agarsose</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor Hücre Odası</td><td>invitrojen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>İkizler Biyo-ürünler</td><td>100-106</td><td>Isı İnaktive Üçlü 0.1 ve mikro; m steril filtreli</td></tr><tr><td>Brig 35,30 w/v %</td><td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Published in 10.1083/jcb.201306067</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red plazma membran boyası</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Koloni Ekranı MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a yetkin hücreler</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-515</td><td></td></tr><tr><td>DNA Merdiveni</td><td>GoldBio</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzim</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, Cleland Reaktifleri</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Sığır plazmasından Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Jel ekstraksiyon Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0692</td><td>GeneJET Jel Ekstraksiyon Kiti</td></tr><tr><td>Jel Yeşil Nükleik Asit Lekesi</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Jel Yükleme Boyası Mor 6x</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL</td></tr><tr><td>HEK 293T Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ İşleme Yazılımı</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td> <td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol Tamponu</td><td></td><td></td><td>25 mM İmidazol pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Lizis Tamponu</td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, %1 NP40 CellGeo</td></tr><tr>işlevlerini çalıştırmak için<td>MATLAB</td><td></td><td>MathWorks N/A</td><td>R 2022b güncellemesi kullanıldı</td></tr><tr><td>Metamorf Mikroskobu Otomasyonu ve Görüntü Analiz Yazılımı</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Yağ</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Kit</td><td>Geni Seçim</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Prekast Jeller 12 kuyulu</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Biyoloji Sınıfı Su</td><td>Corning</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>Çok Bantlı Polikroik Ayna</td><td>Chroma Teknolojisi</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Olympus UPlanSAPO 40x objektif</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS, Ca ve Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tüpleri</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8 Şeritli Tüpler ve Kapaklar, Sert Şerit Ayrı Ayrı Takılan Kubbe Kapakları</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA Polimeraz</td><td>Thermo Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>Primerler</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-G Sefaroz</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membranlar</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF / Filtre Kağıdı Sandviçler</td></tr><tr><td>Rapamisin</td><td>Fisher</td><td>AAJ62473MF</td><td></td></tr><tr><td>% 0.25 Tripsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodyum</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Asetat-EDTA (TAE) 50x</td><td>Fischer</td><td>BP1332-1</td><td>elektroforez için</td></tr><tr><td>Yıkama Tamponu</td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA,% 1 NP40</td></tr> <tr><td>ve beta;-Merkaptoetanol</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anti-EGFR Antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2232</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ERK 1/2 Antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bayrak Antikoru</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Antikor</td><td>invitrojen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP Antikoru</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry Antikoru</td><td>invitrojen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-paxillin Antikoru Thermo</td><td>Fischer</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-EGFR Y992 Antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-ERK 1/2 T202 / Y204 Antikor</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-paksilin Y31 Antikoru</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-PLC ve gama; Y783 Antikor</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>14008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLC ve gama; Antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

rapamisin ile düzenlenmiş tirozin fosfatazların geliştirilmesi ve uygulanması

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

Şekil 4, paxillin bazlı fosfataz aktivite testinden beklenebilecek sonuçları göstermektedir. Bu deneyde, yapısal olarak aktif ve baskın negatif Shp2 fosfataz aktivitesi, okuma olarak fosfo-paxillin kullanılarak aktif ve inaktif RapR-Shp2 aktivitesi ile karşılaştırıldı. Shp2 yapıları immünopresipite edildi ve protokolde tarif edildiği gibi aktivite testine tabi tutuldu. Yapısal olarak aktif Shp2 ve aktif RapR-Shp2 için fosfo-paxillin okumaları benzerdi, bu da aktif RapR-Shp2'nin RapR alanının tanıtılmasından olumsuz etkilenmediğini ve aktive edildiğinde tam aktiviteyi koruduğunu gösterdi. Baskın negatif Shp2 ve aktif olmayan RapR-Shp2 de benzerdi, bu da RapR-Shp2 yapısının aktif olmadığında aktiviteye sahip olmadığını gösteriyor. Bu, bir RapR-fosfatazın başarılı tasarımını gösterir. Bu test için kullanılan fosfo-substrat, ilgilenilen fosfataza bağlı olarak farklılık gösterebilir.
Şekil 5, Şekil 4'e benzer şekilde, yapısal olarak aktif, baskın negatif ve aktif ve aktif olmayan RapR-Shp2'yi karşılaştırır. Bu deney, yapıların immünopresipitasyonu olmadan gerçekleştirildi. Bunun yerine, hücreler içindeki RapR-Shp2 yapısının aşağı akış sinyalleme etkilerini karakterize etmek için tasarlanmıştır. Burada, Shp2 yapıları HEK293T hücrelerde ifade edildi. Aşağı akış efektörü ERK1/2'nin, yapısal olarak aktif numunede olduğu gibi, RapR-Shp2 aktivasyonuna yanıt olarak fosforilasyonda arttığı gösterilmiştir. Etkin olmayan RapR-Shp2 bu değişikliğe neden olmadı. Bu, Shp2'nin aşağı akış sinyalizasyonunun, RapR alanının dahil edilmesiyle korunduğunu gösterir. Benzer şekilde, bilinen fosfo-substratlar EGFR ve PLCγ, A431 hücrelerinde RapR-Shp2 aktivasyonuna yanıt olarak defosforile edildi.
Son olarak, Şekil 6 , HeLa hücrelerinin morfodinamiği üzerindeki RapR-Shp2 aktivasyonunun sonuçlarını sunmaktadır. RapR-Shp2 aktive edildikten sonra, hücreler hücre alanının yanı sıra çıkıntılı aktivitede de bir artış gösterdi. Bu, RapR-Shp2 aktivasyonunun HeLa hücrelerinde morfodinamik değişiklikleri indüklemek için yeterli olduğunu ve araştırmacıların bu etkiden sorumlu spesifik aşağı akış sinyal yollarını araştırmasına izin verebileceğini gösterir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg"> Şekil 4: Paxillin bazlı aktivite testinden elde edilen sonuçlar: Yapısal olarak aktif, baskın negatif ve RapR-Shp2 immünopresipite edildi ve belirtilen protokol kullanılarak aktivite testine tabi tutuldu. Hem CA hem de RapR-Shp2'deki pY31 paxillin seviyeleri benzerdi, bu da RapR-Shp2 yapısının bir kez aktive edildiğinde CA Shp2'ye kıyasla benzer aktiviteye sahip olduğunu gösterdi. Aktive edilmemiş RapR-Shp2 numunesi, DN numunesine benzer bir aktiviteye sahip değildi, bu da "sızdıran" olmadığını gösteriyordu. Bu rakam Fauser ve ark.12'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RapR = Rapamisin tarafından düzenlenmiş; Shp2 = Src homoloji-2 alanı içeren protein tirozin fosfataz; DN = baskın negatif; CA = yapısal olarak aktif; FRB = FKBP-rapamisin bağlayıcı alan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg"> Şekil 5: Tam hücre lizat testinden elde edilen sonuçlar: Yapısal olarak aktif, baskın negatif ve RapR-Shp2 HEK293T hücrelerde eksprese edildi ve tüm hücre lizat protokolü tamamlandı. Aktif olmadığında, RapR-Shp2, DN Shp2 örneğine benzer şekilde fosforilasyon yoluyla ERK1/2'yi aktive etmedi. Bu, RapR-Shp2'nin etkin olmadığında etkinliği olmadığını gösterir. Aktive edildikten sonra, ERK1/2 fosforilasyon seviyesi, CA Shp2 numunesininkine benzerdi, bu da Shp2'nin başarılı aktivasyonunu ve aşağı akış sinyalizasyonunu gösterir. Benzer şekilde, RapR-Shp2'yi eksprese eden A431 hücreleri, her ikisi de Shp2'nin bilinen substratları olan hem EGFR hem de PLCy'nin fosforilasyonunda azalma gösterdi. Bu rakam Fauser ve ark.12'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RapR = Rapamisin tarafından düzenlenmiş; Shp2 = Src homoloji-2 alanı içeren protein tirozin fosfataz; DN = baskın negatif; CA = yapısal olarak aktif; ERK = hücre dışı sinyal regüle kinaz; GAPDH = gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz; EGFR = epidermal büyüme faktörü reseptörü; PLCγ = fosfolipaz C gama; FRB = FKBP-rapamisin bağlayıcı alan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg"> Şekil 6: Canlı görüntülemeye dayalı hücre alanı ve çıkıntılı aktivite veri analizi: HeLa hücreleri RapR-Shp2 ile transfekte edildi ve belirtilen canlı görüntüleme protokolüne tabi tutuldu. Veriler, veri analiz protokolünde belirtildiği şekilde analiz edilmiştir. Aktive edildikten sonra (dikey gri çizgi ile gösterilir), HeLa hücreleri hem hücre çıkıntılı aktivitesinde hem de hücre alanında artışlar gösterdi. Sadece FRB'yi ifade eden negatif örneklerde bu aktivite mevcut değildi. Bu, RapR-Shp2 aktivasyonunun HeLa hücreleri içinde hızlı morfodinamik değişikliklere neden olduğunu ve hücre yayılmasını ve çıkıntısını teşvik ettiğini gösterir. Bu rakam Fauser ve ark.12'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Rapamisin ile Düzenlenmiş Tirozin Fosfatazların Geliştirilmesi ve Uygulanması

Tyrosine phosphatases are an important family of enzymes that regulate critical physiological functions. They are often dysregulated in human diseases, ...

development-application-rapamycin-regulated-tyrosine

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Işık tarafından küçük GTPaz aktivitesinin yerleşim-zaman kontrolü için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, rapamisin indüklenen FKBP-FRB heterodimerization ve foto-kafes sistemleri dayanmaktadır. Işık ışınlama Optimizasyonu Subselüler düzeyindeki küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon sağlar.

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Burada, sağlıklı ve fonksiyonel birincil fare tetkikine yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Hepatik doğmakta olan protein sentezi tarafından radyoaktif olmayan etiketleme substrat algılamak için yönergeler protein sentezi karaciğer homeostazı enerji metabolizması bağlamında temel mekanizmaları anlamanıza yardımcı olmak için sağlanmıştır.

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Burada, co-immunoprecipitation ve plazma membran reseptörleri enzim işe alım ve enzim aktivitesi belirli protein etki katkısını aynı anda çalışmaya bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil

Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini geliştirdik. Etkileşimler iki eğriye çizilebilir: proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi. MTOR-rapamisin etkileşimini örnek bir vaka olarak kullandık.

Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)

Bu çalışmada, Crohn fibrozisi ile karşılaştırılabilir patofizyoloji sergileyen TNBS aracılı intestinal fibrozisin ayrıntılı bir prosedürünü açıklıyoruz. Biz de rapamisin bağırsak fibrozis üzerinde inhibitör etkileri kolaylaştırılan ışığında bu yaklaşımı tartışmak.

TNBS Aracılı Intestinal Fibrozis Gelişimi ve Rapamisin Inhibitör Etkilerinin Değerlendirilmesi Üzerine Mekanistik Bakış

Sağlam hücrelerde aday inhibitörleri tarafından hedef nişan değerlendirmek için yeteneği ilaç keşfi için çok önemlidir. Bu protokol, vahşi tip SHP2 veya onkojenik varyantlarını hedefleyen inhibitörlerin hücresel hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan 384 iyi biçimli hücresel termal değişim testini tanımlar.

Hücresel Hedef Etkileşiminin SHP2 (PTPN11) Fosfataz Inhibitörleri ile Değerlendirilmesi

Jeffrey D. Rothstein, patoloji ve Amyotrofik lateral skleroz veya ALS, ALS araştırma gelişmeler ve tedavilerin geliştirilmesine yönelik mevcut stratejilerin altında yatan mekanizmalar hakkında konuşuyor.

ALS Motor Nöron Hastalığı: Yeni Tedaviler ve Kalkınma Mekanizması

Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Lusiferaz ifade Meme tümör hücrelerini farelerde subkütan implant ve uzunlamasına bir çalışmada non-invaziv tümör büyümesini ve gelişimini izlemek için optik görüntüleme ile görüntülendi.

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

Bu protokol, sağlıklı, farklılaşmamış insan embriyonik kök (ES) hücreleri korumak için nasıl kullanılacağını gösterir.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Keşfedin, rapamisin düzenlemeli sistemle canlı hücrelerde tirozin fosfataz aktivitesini nasıl kontrol edebilirsiniz. HEK-293T hücrelerinde SHIP-2 fosfatazının hücre yayılması ve göçü üzerindeki etkilerini inceleyin.

Rapamisin ile Düzenlenmiş Tirozin Fosfatazların Geliştirilmesi ve Uygulanması

Daha fazla video keşfet