Fibronektin Adezyonu ve Migrasyon Testi Kullanılarak Kondrosit ve Kondroprojenitörlerin İzolasyonu

Kıkırdak doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında, devam eden tedavinin iyileştirilmesi ve yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi açısından biyolojik ve fonksiyonel sonuçların iyileştirilmesi gerekliliği devam etmektedir. Mevcut klinik öncesi araştırmalar, kıkırdak iyileşmesi için uygun bir seçenek olarak kıkırdak kaynaklı kondroprojenitörlerin potansiyel kullanımına işaret etmektedir. Mevcut araştırmalar, ek büyüme faktörleri ve gen rekombinant tekniklerin kullanılması yoluyla daha düşük hipertrofik gücü korurken kondrojenik potansiyeli daha da artırmaya yönelik stratejileri içermektedir.

Kondroprojenitörler, isimlendirme konusunda fikir birliği eksikliği, çeşitli izolasyon teknikleri, karakterizasyon zorlukları, kültür koşullarında değişkenlik ve altta yatan mekanizmaların sınırlı anlaşılması gibi deneysel zorluklarla karşı karşıyadır. Klinik olarak kondroprojenitörlerin yaygın olarak kullanılan hücrelere kıyasla olumlu sonuçlar verdiğini göstermek, kıkırdak ile ilişkili patolojilerle ilişkili küresel yükü önemli ölçüde azaltabilir. Progenitörlerden türetilen hücre dışı veziküller gibi hücresiz alternatifler kullanılarak ve gerçek hiyalin benzeri kıkırdağın rejenerasyonu için rekombinant stratejiler kullanılarak geliştirilmiş terapötiklerin evrimi.

Başlamak için, steril koşullar altında 1X PBS'de insan donörlerden tibiofemoral veya diz eklemleri alın, ardından hasat edilen eklemleri başlıktaki steril alt pedin üzerine aktarın. Eklemleri stabilize etmek için, subkondral kemiği kıkırdak yukarı bakacak şekilde tutun. 22 numara neşter bıçağı kullanarak, ağırlık taşımayan bölgelerden dikdörtgen şekilli kıkırdak talaşı toplayın.

Kıkırdağı yüzeysel tabakadan daha derin tabakaya kadar sekiz milimetreye 10 milimetre ölçülerinde bölümler halinde kesin. Dilimleri PBS ile yıkadıktan sonra, bir ila iki mililitre sade Dulbecco modifiye Eagle's medium veya DMEM içeren bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, 22 numaralı bir neşter bıçağı kullanarak, kıkırdak dilimlerini bir milimetre küpten daha küçük bir boyuta kadar kıyın.

Başlamak için, çıkarılan insan diz eklemlerinden kıyılmış kıkırdak elde edin. Kıyılmış kıkırdağı, enzimatik sindirim için% 0.15 kollajenaz tip II ile 10 mililitre serumsuz DMEM / F-12 içeren dik bir T25 şişesine yerleştirin. Şişeyi 12 ila 14 saat boyunca bir karbondioksit inkübatörde rahatsız edilmeden bırakın.

Gece boyunca sindirimi takiben, salınan kondrositleri içeren ortamı taze bir steril santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri döküntülerden ayırmak için bir hücre süzgeci kullanın. % 10 fetal sığır serumu veya FBS ile eşit hacimde DMEM / F-12 ekleyin.

Filtrelenmiş hücreleri 1.200 G'de 37 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti bir mililitre ortamda sulandırın. Bir tripan mavisi dışlama testi kullanarak canlı hücreleri sayın.

Daha sonra, kondrositleri santimetre kare başına 10.000 hücre konsantrasyonunda bir T25 şişesine yükleyin. %10 FBS içeren DMEM/F-12 kullanarak hücreleri gerekli geçiş numarasına genişletin. EDTA içeren% 0.125 tripsin kullanarak% 0.125 tripsin kullanarak hücreleri alt birleşimde hasat etmeden önce ortamı her üç günde bir yenileyin.

Kondrositler yüklemeden hemen sonra yapışır ve genişledikçe yuvarlak parke taşı şeklinden fibroblastik görünüme geçer. Başlamak için, çıkarılmış insan tibiofemoral veya diz eklemlerinden kıkırdak talaşı elde edin. Kıkırdak talaşlarını, önce üç saat boyunca% 0.2 pronaz kullanarak, ardından 37 santigrat derecede tutulan çalkalama su banyosunda 12 saat boyunca% 0.04 kollajenaz tip II kullanarak, gece boyunca sıralı enzimatik sindirime tabi tutun.

Daha sonra, altı oyuklu bir plakanın gerekli sayıda kuyusunu 1.5 mililitre PBS fibronektin çözeltisi ile kaplayın. Plakayı sıkıca kapatın ve gece boyunca dört santigrat derecede soğutun. Ertesi gün, fibronektin kaplı altı oyuklu plakayı buzdolabından çıkarın.

Fazla fibronektini çıkardıktan sonra, kaplanmış kuyucuklara iki ila üç mililitre düz DMEM / F-12 ortamı ekleyin. Serbest bırakılan kondrositleri, oyuk başına 4.000 hücre yoğunluğunda kaplanmış kuyucuklara tohumlayın ve plakayı 20 dakika boyunca rahatsız etmeden bırakın. İnkübasyondan sonra, fazla ortamı ve yapışmayan hücreleri aspire edin.

Kuyucuklara% 10 fetal sığır serumu ile iki ila üç mililitre DMEM / F-12 ekleyin. Kondrojenik progenitör hücre veya CPC klonları elde etmek için yapışık hücreleri standart kültür koşulları altında 10 ila 12 gün boyunca koruyun, daha sonra CPC klonlarını 180 saniye boyunca% 0.125 tripsin EDTA kullanarak izole edin, daha sonra beş santimetre kare başına bir klon oranında tekrar oynatın. Zenginleştirilmiş poliklonal TBM'leri gerekli birleşim noktasına kadar genişletin.

Fibronektin adezyon testine tabi tutulan kondrositler, klonal büyüme gösterir ve 10. günde beş katına çıkan bir popülasyona ulaşır. Başlamak için, hasat edilen eklemden traşlanmış kıkırdak eksplantlarını takviye edilmiş DMEM / F-12 ortamında elde edin. Eksplantlı plakayı 48 saat boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir karbondioksit inkübatörünün içine yerleştirin.

İki gün sonra, eksplantları enzimatik sindirim için 10 mililitre% 0.1 kollajenaz çözeltisi içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Sindirim sonrası, eksplantları 1X PBS ile durulayın ve taze takviye edilmiş DMEM / F-12 ortamı içeren plakadaki aynı kuyucuklara geri koyun.

Plakayı standart kültür koşulları altında inkübatörde tutun ve sonraki günlerde kondroprojenitörlerin göçünü izleyin. Eksplantlar alt birleşime ulaştığında,% 0.125 tripsin EDTA çözeltisi kullanarak mezenkimal kondroprojenitör hücrelerini veya MCP'leri hasat edin. Takviye edilmiş DMEM / F-12 ortamını kullanarak MCP'leri genişletin.

Kondroprojenitörler, kültürün 10. gününde eksplantın kenarından göç etmeye başlar ve daha fazla genişleme ile iğ şeklinde bir büyüme modeli sergiler.