Kantitatif Tersinmez Tethering Testi Kullanılarak Kovalent Fragman Taraması

Kimya ve yaşam bilimleri bölümleri arasında çalışarak, bir dizi anti-kanser ilaç hedefi için yeni yardımcı reaktif kovalent ligandlar geliştiriyoruz. Bu moleküllerin gelecekte terapötik olarak veya muhtemelen kimyasal problar olarak kullanılacağı umulmaktadır. Bu nedenle, kovalent ligandları taramak için çeşitli teknolojiler mevcuttur.

Bunlar genel olarak, bileşiklerin kültürlenmiş hücrelerle inkübe edildiği proteomik tekniklere ve moleküllerin hangi proteinleri etiketlediğini belirlemek için kullanılan kütle spektrometresine ve elektrofil kütüphanelerinin tek tek proteinlerle inkübe edildiği hedef tabanlı yöntemlere ayrılabilir. Önemli bir deneysel zorluk, kovalent ligandların reaktivitesi ile ilgilidir. Aşırı reaktif moleküller genellikle tarama tahlilleri sırasında isabet olarak görünecektir, ancak hücredeki birçok farklı proteini seçici olmayan bir şekilde etiketleyecekleri için uygun değildirler.

Bu nedenle, aktivite bileşiği, kovalent ilaç keşfinin her adımında dikkate alınması çok önemlidir. Bu yüzden Imperial'deki Mann ve Armstrong grupları, kantitatif geri dönüşümsüz bağlanma veya qIT tahlili adı verilen bir protein hedefine karşı elektrofilleri taramak için yeni bir yöntem geliştirdiler. Protokolümüz, ölçeklenebilir, kütle spektrometresi gerektirmeyen ve bileşik içsel reaktiviteyi kontrol eden bir protein hedefine karşı elektrofilleri taramak için çok ihtiyaç duyulan, yeni bir yöntem sağlar.

Başlamak için, gerekli tüm stok çözeltilerini hazırlayın ve deneyden önce iki saat oda sıcaklığında bırakın. Yaklaşık 30 dakika boyunca argon gazı ile kantitatif, geri dönüşümsüz bağlama veya qIT tahlil tamponunun gazını alın. Gerçekleştiren bir tampon değişimi için, protein çözeltisini bir spin filtre ünitesinde gazı alınmış qIT tahlil tamponundan fazla seyreltin ve proteini konsantre etmek için dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 4.000 G'de döndürün.

Daha sonra, dokuz mililitre çözelti hazırlamak için hedef protein çözeltisini gazı alınmış qIT tahlil tamponunda 15 mikro azı dişi konsantrasyonuna seyreltin. TCEP-agraoz çözeltisi, qIT tamponu ve glutatyon stoğunu 384 oyuklu plakaların uygun kuyularına dağıtın. Her bir bileşiği qIT tahlil tamponunda 1.5 milimolar artı %3 DMSO'ya seyrelten bir bileşik seyreltme plakası oluşturmak için parça kitaplık plakasının karşılık gelen her bir oyuğundan 1.8 mikrolitre aktarın.

Bileşik seyreltme plakasının her bir oyuğundan 20 mikrolitre bileşik çözeltiyi her iki reaksiyon plakasına aktarmak için bir 384 pipetleme istasyonu kullanın. Başlamak için, istenen protein ve glutatyon ile kantitatif geri dönüşümsüz bağlama veya qIT testini ayarlayın. 500 Mikromolar CPM stoğunu mikrosantrifüj tüplerinde 111.2 mikrolitrelik alikotlara dağıtın ve 20 santigrat derecede saklayın.

CPM stoğunu çözdükten sonra, 1.4 mikromolar çözelti hazırlamak için 40 mililitre qIT tahlil söndürme tamponuna ekleyin İki taze 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 27 mikrolitre CPM Söndürme solüsyonu dağıtın. TCEP-agarozu peletlemek için protein reaksiyon plakasını 200 G'de üç dakika santrifüjleyin. Önceden belirlenmiş zaman noktalarında, protein reaksiyon plakasının her bir kuyucuğundan üç mikrolitre numuneyi CPM söndürme plakasına aktarmak için bir 384 pipetleme istasyonu kullanın.

Altta TCEP-agarozu aspire etmekten kaçınarak numuneyi kuyunun üstünden çıkarın. CPM söndürme plakalarını oda sıcaklığında bir saat inkübe edin ve 384 nanometrede bir uyarma ve 470 nanometrede emisyon ile floresan yoğunluğunu ölçün. Başlamak için, istenen protein ile kantitatif-geri dönüşümsüz bağlama veya qIT testi yapın ve numuneleri CPM plakasında söndürün.

Her söndürme için, tahlil kalitesinin bir ölçüsü olarak Z prime'ı hesaplayın. Ardından, birinci ve ikinci sütunlardaki negatif kontrol kuyuları ve 23 ve 24 numaralı sütunlardaki pozitif kontrol kuyuları için ortalama floresan değerlerini hesaplayın. Her reaksiyonu pozitif ve negatif kontrollerin ortalama floresan değerlerine iyi bir şekilde normalleştirin ve glutatyon ve hedef protein ile reaksiyona giren her bileşik için zamana karşı değiştirilen yüzdeyi ayrı ayrı çizin.

GraphPad'i kullanarak, denklemi kullanan her iki reaksiyon için de tek fazlı üstel bozunma modeline karşı normalleştirilmiş yüzde değiştirme verisini, AE'yi KT C'nin gücüne uygun hale getirin. Son olarak, İsabet parçalarını seçmek için bir REF eşiği, rastgele bir İsabet oranı ayarlayın veya geometrik ortalamadan üç standart sapma daha büyük REF değerine sahip parçaları seçin. Birinci bileşik, hedef protein üzerindeki sistein kalıntısı ile glutatyondan altı kat daha fazla oranda reaksiyona girdi ve üçten büyük REF Hit kriterini karşıladı.

Bileşik iki, glutatyona kıyasla hedef sistein kalıntısı ile hızlandırılmış bir reaksiyon hızı göstermedi, bu da üretken kovalent olmayan etkileşimlerin eksikliğini gösterdi ve bu nedenle bir isabet olarak seçilmedi.