Name: Kantitatif Tersinmez Tethering Testi Kullanılarak Kovalent Fragman Taraması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Öğrenin kovalent ilaç keşfinde qIT testi ile hedef proteinlere seçici bağlanan elektrofilik fragmanları taramayı. Bu floresans tabanlı yöntem, kitlesel spektrometri gerektirmeden seçiciliği artırır ve sağlam bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Parça kütüphane yapımı
<ol>
	<li>Elektrofilik parçalardan oluşan bir kütüphane tasarlayın ve bunları sentezleyin veya satın alın. Elektrofilik parça kitaplıkları tipik olarak, çeşitli kimyasal iskelelere eklenen hafif reaktif elektrofillerden (akrilamidler, kloroasetamidler ve vinil sülfonamidler gibi) oluşur. Elektrofilik parça kütüphaneleri ticari tedarikçilerden yaygın olarak temin edilebilir ve tasarımları ve yapıları hakkında daha fazla ayrıntı başka bir yerde gözden geçirilmiştir 5,11.</li>
	<li>Her bir bileşiği DMSO'da 50 mM'lik bir konsantrasyona çözün, daha sonra Parça Kitaplık Plakası olarak adlandırılan 384 oyuklu bir rezervuar plakasının 3 ila 22 numaralı sütunlarının her bir oyuğuna farklı bir bileşik dağıtın.<ol>
		<li>Pozitif ve negatif kontroller için DMSO'yu 1, 2, 23 ve 24 numaralı sütunların her birine dağıtın. Plaka yerleşimi, taranan bileşiklerin sayısına bağlı olarak değiştirilebilir (Şekil 2). Kütüphane plakasına eklenen hacim, qIT ekranı başına her bir kuyucuktan yaklaşık 1,8 μL gerektiği göz önüne alındığında, gerçekleştirilecek ekran sayısına bağlı olacaktır. Bu Parça Kitaplık Plakasını önceden hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig02.jpg"> 
Şekil 2: Plaka düzeni. qIT tahlili 384 kuyulu plaka düzenine genel bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Tahlil kurulumu (Şekil 3)
<ol>
	<li>Aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: rekombinant protein çözeltisi (herhangi bir tamponda hedef protein), qIT tahlil tamponu (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 8)), qIT tahlil söndürme tamponu (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 7.5)) ve bileşik stok çözeltileri (DMSO'da elektrofilik fragman (50 mM)). NOT: Hedef sistein kalıntısı ve fragmanlar arasındaki reaksiyonu hızlandırmak için reaksiyon tamponunda pH 8 kullanılır, bu da son derece hafif reaktif fragmanlar için bile reaksiyon hızının ölçülmesine izin verir. CPM'nin maleimidi ile sistein tiyol arasında oluşan tiyoeter bağı daha bazik pH'larda hidrolize eğilimli olduğundan, söndürme tamponunda 7.5'lik biraz daha düşük bir pH kullanılır (örneğin, önceki çalışma, sistein-maleimid konjugatlarının pH 7.3'te pH 8'den çok daha kararlı olduğunu buldu12).</li>
	<li>DMSO parça stok çözeltilerini depodan çıkarın ve bileşik stokların çözülmesini sağlamak için en az 2 saat oda sıcaklığında bırakın.</li>
	<li>Yaklaşık 30 dakika boyunca argon gazı ile köpürtülerek qIT test tamponunu degas.</li>
	<li>Hedef protein çözeltisini gazı alınmış qIT tahlil tamponuna iyice değiştirin. En önemlisi, DTT ve TCEP gibi indirgeyici ajanlar, tiyol miktar tayinine müdahale edeceği için 100 nM&lt; konsantrasyonlara kadar tamamen uzaklaştırılmalıdır. Bu adım, aşağıda açıklandığı gibi tekrarlayan bir dizi arabellek değişimi yoluyla gerçekleştirilebilir.<ol>
		<li>Bir spin filtre ünitesinde gazı alınmış qIT tahlil tamponundan fazla protein çözeltisini seyreltin, santrifüjleme (4000 x g, 4 ° C, 15 dakika) kullanarak konsantre edin ve tekrarlayın. Tipik olarak, 1 mL rekombinant protein stok çözeltisinden DTT'yi (1 mM) yeterince çıkarmak için 15'te 1'lik 4 tur seyreltme gereklidir, ancak bu adım, orijinal rekombinant protein çözeltisindeki indirgeyici ajan konsantrasyonuna bağlı olarak ayarlanabilir. NOT: Alternatif olarak, hedef protein çözeltisinin büyük miktarda gazı alınmış qIT tahlil tamponuna karşı diyalize edilmesi de aynı sonucu elde edebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hedef protein çözeltisini (adım 2.1'de üretilen) gazı alınmış qIT tahlil tamponunda 15 μM'lik bir protein konsantrasyonuna seyreltin. 384 oyuklu bir plakayı yeterli ölü hacimle doldurmak için yaklaşık 9 mL hedef protein çözeltisi gereklidir.</li>
	<li>Gazdan arındırılmış qIT tahlil tamponunda %1,5 (h/h) TCEP-agaroz süspansiyonu hazırlayın. Eleme plakası başına yaklaşık 9 mL TCEP-agaroz süspansiyonu gereklidir.</li>
	<li>İki adet 384 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 20 μL TCEP-agaroz çözeltisi dağıtın.</li>
	<li>Gazdan arındırılmış qIT tahlil tamponunda 15 μM'lik bir glutatyon stoğu hazırlayın. Bu, kaplamadan hemen önce hazırlanmalıdır, çünkü glutatyon indirgeyici ajan olmadan çözelti içinde hızla oksitlenir.</li>
	<li>20 μL qIT tahlil tamponunu her iki 384 oyuklu plakanın 1. ve 2. sütunlarına dağıtın.</li>
	<li>20 μL 15 μM protein veya glutatyon çözeltisini (amaçlanan plakaya uygun olarak) 384 oyuklu plakanın 3-24 sütunlarına dağıtın. Bunlar Protein Reaksiyon Plakası ve Glutatyon Reaksiyon Plakası olarak adlandırılır. RT'de 1 saat azalmaya bırakın.</li>
	<li>384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 58,2 μL gazı alınmış qIT tahlil tamponu dağıtın, ardından her bileşiğin qIT tahlil tamponunda 1,5 mM'lik bir konsantrasyona seyreltildiği bir Bileşik Seyreltme Plakası oluşturmak için Parça Kitaplık Plakasının karşılık gelen her bir kuyucuğundan 1,8 μL aktarın artı %3 DMSO. NOT: Bu adım, her kuyucuk için bileşik stokların tek bir işlemde aktarılmasına olanak tanıyan 384 pipetleme istasyonu ile daha kolay hale getirilmiştir.</li>
	<li>Protein ve glutatyonun TCEP-agaroz ile 1 saat inkübasyonunu takiben, tahlili başlatmak için Bileşik Seyreltme Plakasının her bir oyuğundan 20 μL bileşik çözeltiyi hem protein hem de glutatyon reaksiyon plakalarına aktarın. Bu adım, 384 pipetleme istasyonu ile de daha kolay hale getirilmiştir. Test adımları Şekil 3'te özetlenmiştir. NOT: Fragman konsantrasyonu gerektiği gibi değiştirilebilir ve istenirse, protein afinitesinin yüksek fragman konsantrasyonunun bir artefaktı olmadığını doğrulamak için daha düşük konsantrasyonlardaki isabetler için qIT tahlilleri tekrarlanabilir. Nispeten yüksek fragman konsantrasyonu, hafif reaktif bileşikler için doğru oranların belirlenebilir olmasını sağlamak için kpro ve kGSH'yi yükseltmek için kullanılır (bu, tahlil koşulları altında t1/2 (GSH) &gt; 24 saat gösterebilir). Ayrıca, 500 μM'lik bir fragman konsantrasyonu yüksek olmasına rağmen, fragman taramasında yüksek μM ila düşük mM konsantrasyonları kullanılmıştır, örneğin13.</li>
	<li>Bir zamanlayıcı başlatın - tahlil başladı ve söndürmeler aşağıdaki bölüme göre düzenli zaman noktalarında yapılmalıdır.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig03v2.jpg"> 
Şekil 3: qIT test özeti. qIT tahlil reaksiyon kuyusu kurulumunun temel adımlarını gösteren bir özet. (BioRender kullanılarak oluşturulmuştur). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig03largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
3. BGBM söndürür
NOT: CPM söndürmeleri, protein ve glutatyon reaksiyon plakalarında kalan reaksiyona girmemiş tiyol miktarını ölçmek için gerçekleştirilir. Bunlar, reaksiyon kinetiğinin izlenmesine izin vermek için ayrı zaman noktalarında (örneğin, aşağıdaki zaman noktaları tipik olarak kullanılır: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 ve 1440 dakika) gerçekleştirilmelidir.
<ol>
	<li>DMSO'da CPM stok çözeltileri (500 μM) hazırlayın, bunları mikrosantrifüj tüplerinde 111.2 μL'lik alikotlara dağıtın ve -20 °C'de saklayın. Bu CPM stokları önceden hazırlanabilir ve söndürme zaman noktası başına 1 alikot gerekecektir.</li>
	<li>Donmuş bir CPM stok çözeltisini (500 μM) çözdürerek ve 40 mL qIT tahlil söndürme tamponuna ekleyerek CPM söndürme solüsyonunu (1,4 μM) hazırlayın.</li>
	<li>İki 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 27 μL CPM söndürme çözeltisi dağıtın - hem protein hem de glutatyon reaksiyon plakalarını söndürmek için iki tane gereklidir. Bunlara CPM-Söndürme Plakaları denir, kullanmadan önce en fazla 30 dakika hazırlayın.</li>
	<li>TCEP-agarozun peletlendiğinden emin olmak için protein reaksiyon plakasını 200 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Önceden belirlenmiş zaman noktalarında, Protein Reaksiyon Plakasının her oyuğundan 3 μL'lik bir numuneyi önceden doldurulmuş bir CPM Söndürme Plakasına aktarın. Bu adım, 384 pipetleme istasyonu kullanılarak da basitleştirilmiştir.</li>
	<li>CPM Söndürme Plakasını 3 x 25 μL'yi aspire ederek ve dağıtarak karıştırın. CPM söndürmeye müdahale edecek olan TCEP-agarozun altta aspire edilmesini önlemek için numuneyi kuyunun üstünden çıkarmak önemlidir.</li>
	<li>Glutatyon Reaksiyon Plakası ile 3.4-3.6 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>CPM Söndürme Plakalarını (3.4-3.6'da hazırlanmış) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>CPM söndürme plakasının floresan yoğunluğunu ölçün (384 nm'de uyarma ve 470 nm'de emisyon).</li>
</ol>
4. Veri analizi ve isabet seçimi
<ol>
	<li>Her söndürme için, test kalitesinin bir ölçüsü olarak Z'yi hesaplayın. Z' &lt; 0,5 olan herhangi bir BGBM söndürmesi göz ardı edilmelidir. Z' = 1 - ((3σpozitif kontrol + 3σnegatif kontrol) / (μpozitif kontrol - μnegatif kontrol)) Burada σ = floresan yoğunluğu standart sapması ve μ = floresan yoğunluğu ortalaması</li>
	<li>Negatif ve pozitif kontrol kuyuları için ortalama floresan değerlerini hesaplayın (sırasıyla sütun 1 ve 2 ve 23 ve 24).</li>
	<li>Her reaksiyonu, pozitif ve negatif kontrollerin ortalama floresan değerlerine iyi bir şekilde normalleştirin: % modifiye = 100 x (bileşik kuyu floresansı - negatif kontrol floresansı) / (pozitif kontrol floresansı - negatif kontrol floresansı)</li>
	<li>Glutatyon ve hedef protein ile reaksiyona giren her bileşik için zamana karşı değiştirilen % 'yi ayrı ayrı çizin.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak hem protein hem de glutatyon ile reaksiyon için tek fazlı üstel bozunma modeline göre normalleştirilmiş % değiştirilmiş zaman verilerini uygun hale getirin: % Değiştirilmiş = ae - kt + c Burada a = % değiştirilmiş değerler aralığı, k = reaksiyon hızı, t = zaman, c = sonsuz zamanda % değiştirilmiş değer. Eğri uydurma ve parametre belirleme, ticari yazılımlar (Graphpad gibi) kullanılarak gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Her parça için Hız Geliştirme Faktörü (REF) değerini hesaplamak için parçaların protein (kpro) ve glutatyon (kGSH) ile reaksiyona girme hızını kullanın: REF = kyanlısı / kGSH</li>
	<li>İsabet parçalarını seçmek için REF değerlerini kullanın. Bu, bir REF eşiği (örneğin, REF &gt; 3), keyfi bir isabet oranı (örneğin, en yüksek %2) ayarlayarak veya geometrik ortalamadan daha büyük REF 3 standart sapmalarına sahip parçalar seçilerek gerçekleştirilebilir.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Kantitatif-Tersinmez Bağlama: Elektrofilik Ligandların Verimli Bir Şekilde Taranması

<ol><li>Boike, L., Henning, N. J., Nomura, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+covalent+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in covalent drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 21, 881-898 (2022).</li>
<li>Gehringer, M., Laufer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+and+re-emerging+warheads+for+targeted+covalent+inhibitors%3A+Application+in+medicinal+chemistry+and+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Emerging and re-emerging warheads for targeted covalent inhibitors: Application in medicinal chemistry and chemical biology.</a> J Med Chem. 62, 5673-5724 (2019).</li>
<li>Strelow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+the+kinetics+of+covalent+and+irreversible+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A perspective on the kinetics of covalent and irreversible inhibition.</a> SLAS Discov. 22 (1), 3-20 (2016).</li>
<li>Burger, J. A., Buggy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton+tyrosine+kinase+inhibitor+Ibrutinib+%28PCI-32765%29%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Bruton tyrosine kinase inhibitor Ibrutinib (PCI-32765).</a> Leukemia Lymphoma. 54 (11), 2385-2391 (2013).</li>
<li>Hocking, B., Armstrong, A., Mann, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery+-+Design%2C+synthesis+and+screening+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery - Design, synthesis and screening methods.</a> Prog Med Chem. 62, 105-146 (2023).</li>
<li>Lucas, S. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+hits+and+where+to+find+them%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Covalent hits and where to find them.</a> SLAS Discov. 29 (3), 100142(2024).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+analysis+for+target-directed+covalent+ligand+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic analysis for target-directed covalent ligand discovery.</a> Angewandte Chemie. 130, 5355-5359 (2018).</li>
<li>Kathman, S. G., Xu, Z., Statsyuk, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fragment-based+method+to+discover+irreversible+covalent+inhibitors+of+cysteine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">A Fragment-based method to discover irreversible covalent inhibitors of cysteine proteases.</a> J Med Chem. 57 (11), 4969-4974 (2014).</li>
<li>Hallenbeck, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+method+for+screening+disulfide+tethering+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography/mass spectrometry method for screening disulfide tethering fragments.</a> SLAS Discov. 23 (2), 183-192 (2019).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparamter+kinetic+analysis+for+covalent+fragment+optimization+by+using+quantitative+irreversible+tethering+%28qIT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparamter kinetic analysis for covalent fragment optimization by using quantitative irreversible tethering (qIT).</a> Chem Bio Chem. 21, 3417-3422 (2020).</li>
<li>Keeley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 25 (6), 983-996 (2020).</li>
<li>Gober, I. N., Sharan, R., Villain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+stability+of+thiol-maleimide+bioconjugates+via+the+formation+of+a+thiazine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving the stability of thiol-maleimide bioconjugates via the formation of a thiazine structure.</a> J Pept Sci. 29 (10), e3495(2023).</li>
<li>Olp, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent-fragment+screening+of+BRD4+identifies+a+ligandable+site+orthogonal+to+the+acetyl-lysine+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Covalent-fragment screening of BRD4 identifies a ligandable site orthogonal to the acetyl-lysine binding sites.</a> ACS Chem Biol. 15 (4), 1036-1049 (2020).</li>
<li>Qin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+fragment+inhibitors+that+induce+unprecedented+conformational+distorions+in+Entereovirus+71+3C+and+SARS-CoV-2+main+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmaceutica+Sinica+B%22%5BJournal%5D)">Acrylamide fragment inhibitors that induce unprecedented conformational distorions in Entereovirus 71 3C and SARS-CoV-2 main protease.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 12 (10), 3924-3999 (2022).</li>
<li>Jamshidiha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+first+structurally+validated+covalent+ligands+of+the+small+GTPase+RAP27A%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the first structurally validated covalent ligands of the small GTPase RAP27A.</a> RSC Med Chem. 13 (2), 150-155 (2022).</li>
<li>Flanagan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+computational+methods+for+the+characterization+of+covalent+reactive+groups+for+the+prospective+design+of+irreversible+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical and computational methods for the characterization of covalent reactive groups for the prospective design of irreversible inhibitors.</a> J Med Chem. 57, 10072-10079 (2014).</li>
</ol>

Sistein reaktif hedefli kovalent ligandlar (belirli bir protein üzerinde seçilmiş bir sistein kalıntısı ile reaksiyona girerek biyolojik bir etki gösteren moleküller) son yıllarda kimyasal araçlar ve terapötikler olarak giderek daha popüler hale gelmiştir1. Bunlar tipik olarak, bir protein hedefi2 için yüksek afiniteye sahip bir ligand parçasına eklenen hafif reaktif bir elektrofilden (bir akrilamid, kloroasetamid veya vinil sülfon gibi) oluşur. İdeal olarak, ligand-protein etkileşimi, ilk kovalent olmayan ligand bağlanmasını ve ardından hedef sistein ve elektrofil3 arasında geri dönüşümsüz kovalent bağ oluşumunu içeren iki aşamalı bir mekanizma yoluyla ilerler.
Bruton'un Tirozin Kinaz inhibitörü Ibrutinib de dahil olmak üzere birkaç erken hedeflenen kovalent ligand, önceden tanımlanmış bir geri dönüşümlü ligandın bir elektrofilik sap4 ile donatılmasıyla geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım her zaman başarılı değildir ve diğer girişimlerde elektrofil kurulumunun önemli bir optimizasyon gerektirdiği bulunmuştur5. Bunun yerine, özellikle elektrofilik parçalar kullanan elektrofil öncelikli yaklaşımlar son yıllarda daha popüler hale geldi. Bunlar tipik olarak, bir elektrofil kütüphanesinin bir protein ile inkübe edilmesini ve daha sonra, ligand ve bağlanma cebi6 arasındaki üretken kovalent olmayan etkileşimler tarafından indüklendiği varsayılan bir sisteine karşı gelişmiş bir reaksiyon hızına sahip bileşiklerin seçilmesini içerir. Özellikle, bu yöntemler KRAS (G12C) inhibitörü Sotorasib1'in geliştirilmesi sırasında başarıyla uygulanmıştır.
Elektrofil öncelikli tarama, geleneksel kovalent olmayan ligand taraması ile karşılaştırıldığında, esas olarak savaş başlığı sınıfları7 içinde ve arasındaki reaktivitedeki yüksek değişkenlik nedeniyle birkaç benzersiz zorluk ortaya çıkarmaktadır. Çoğu sistein-reaktif elektrofil, zamanla, hedef protein için herhangi bir seçici etkileşimden bağımsız olarak, solvente maruz kalan tüm sistein kalıntıları ile reaksiyona girecektir. Bu nedenle, ligand doluluğu hemen hemen tüm elektrofiller için zamanla artacaktır ve reaktiviteyi kontrol etmeden, vuruş seçimi genellikle bir hedefe daha hızlı giren daha reaktif parçalara doğru önyargılı olacaktır8.
Ayrıca, elektrofil öncelikli tarama yöntemleri, verim9'da sınırlı olan protein-ligand eklenti oluşumunu tespit etmek için genellikle kütle spektrometresi kullanır. Çeşitli elektrofilikliğe10 sahip bileşiklerden oluşan bir kütüphane için reaksiyon kinetiğini uygun şekilde karakterize etmek için uzun bir süre boyunca (saatler ila günler) düzenli reaksiyon örneklemesi gereklidir. Bu nedenle, 10 zaman noktasında örneklenen 300 parçadan oluşan bir ekran, çoğu protein kütle spektrometresi sisteminin verimini aşan 3000 kütle spektrumunun gerçekleştirilmesini gerektirecektir. Bu nedenle, protein-ligand eklenti oluşumunu izlemek için daha yüksek verimli yöntemler arzu edilir.
Burada özetlenen yaklaşım, kantitatif geri dönüşümsüz bağlama (qIT) testi, içsel reaktiviteyi kontrol eden ve basit bir floresan okuması7 kullanan elektrofil öncelikli bir tarama yöntemidir. Protein veya glutatyon (içsel reaktivite için bir kontrol olarak kullanılan yapılandırılmamış, tiyol içeren bir tripeptit), bir elektrofilik fragman kütüphanesi ile inkübe edilir ve bir CPM çözeltisine (7-Dietilamino-3- (4'-Maleimidylphenyl)-4-Metilkumarin, bir florojenik tiyol-miktar tayini ajanı) içine söndürülmek üzere düzenli numuneler alınır. Sistein ve elektrofilik fragman arasındaki eklenti oluşumu, CPM ile reaksiyon için mevcut olan tiyol miktarını azaltır ve su verme sırasında ortaya çıkan floresansı azaltır. CPM floresansı bu nedenle reaksiyona girmemiş tiyol için bir vekil görevi görür ve her bir elektrofilik parça ile tiyol reaksiyonunun kinetiğinin belirlenmesine izin verir. Glutatyon üzerinde önemli ölçüde geliştirilmiş protein reaktivitesine sahip elektrofilik fragmanlar, isabet olarak seçilir ve daha fazla geliştirme için önceliklendirilir (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig01.jpg"> 
Şekil 1: qIT şeması. qIT testine şematik bir genel bakış. (BioRender kullanılarak oluşturulmuştur). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
REF değerlerini kullanarak isabet seçimi, içsel reaktiviteyi kontrol eder ve fragmanların yalnızca bir protein hedefiyle üretken kovalent olmayan etkileşimler oluşturmaları durumunda isabet olarak seçilmesini sağlar. Basit floresan okuması aynı zamanda qIT testinin yüksek düzeyde ölçeklenebilir olduğu ve kütle spektrometresi tabanlı reaksiyon izleme yöntemleri gerektirmediği anlamına gelir.
Burada, qIT testi için kapsamlı bir prosedür ana hatlarıyla belirtilmiştir ve test performansını ve isabet seçimini göstermek için örnek sonuçlar dahil edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Argon Gazı</td><td>BOC</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384 kuyulu, düşük flanşlı, düz tabanlı tahlil plakaları</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Invitrogen</td><td>D346</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>İmmobilize TCEP-agaroz</td><td>Pierce</td><td>77712</td><td></td></tr><tr><td>Mikro plaka okuyucu</td><td>CLARIOstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Plaka Contaları</td><td>BioRad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>Azaltılmış L-glutatyon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES6007H-A7</td><td></td></tr></tbody></table>

kantitatif tersinmez tethering testi kullanılarak kovalent fragman taraması

Covalent Fragment Screening Using the Quantitative Irreversible Tethering Assay

qIT testi burada isimsiz, tek bir sistein proteini için kovalent fragman isabetlerini tanımlamak için kullanılır. Hedef proteininMg 2+ iyonlarına bağlandığı bilindiği için reaksiyon tamponlarına MgCl2 (10 mM) eklendi. Tarama üç kopya halinde gerçekleştirildi ve her bir parçanın hem hedef protein (kpro) hem de glutatyon (kGSH) ile reaksiyona girme hızı belirlendi. Z' değerleri, tüm söndürme plakaları için 0.5'ten büyüktü ve protein söndürmeleri için ortalama 0.75 ve glutatyon söndürmeleri için 0.79 idi, bu da mükemmel test performansını gösteriyordu. Daha sonra her parça için REF değerleri hesaplandı ve REF'in 3 olduğu yerde isabetler &gt; seçildi.
Temsili sonuçlar (Şekil 4), qIT tahlili kullanılarak isabet seçimine bir örnek sağlar. Bileşik 1 , hedef protein üzerindeki sistein kalıntısı ile glutatyona göre 6.0 kat daha fazla oranda reaksiyona girdi ve REF &gt; 3 kriteri kullanılarak bir isabet olarak seçildi (Şekil 4B). Bu hız ivmesi, bir şablonlama etkisinin varlığını gösterir, bu sayede kovalent olmayan etkileşimler, hedef protein üzerindeki sisteinin kloroasetamid savaş başlığı ile reaksiyona girmesi için doğru oryantasyonda 1'i konumlandırır. Buna karşılık, 2 ile hedef sistein kalıntısı arasındaki reaksiyon, 2 ile glutatyon arasındaki reaksiyona göre hızlandırılmadığından, 2 isabetsiz bir fragman örneğidir. Hız ivmesinin olmaması, 2'yi hedef sistein kalıntısı ile reaksiyona girmek için doğru yönde konumlandıran üretken kovalent olmayan etkileşimlerin olmadığını gösterir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig04v2.jpg"> 
Şekil 4: Temsili sonuçlar. Sonuçlar, (A) yüksek bir içsel reaktivite, olası bir yanlış pozitif isabet fragmanı ve (B) bir isabet fragmanı için qIT ile protein ve glutatyon reaksiyonunun izlenmesini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig04largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Kantitatif Tersinmez Tethering Testi Kullanılarak Kovalent Fragman Taraması

Compounds that form covalent bonds with specific target proteins offer a variety of advantages&#160;as chemical probes and therapeutic agents. Most ...

covalent-fragment-screening-using-quantitative-irreversible-tethering

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

HCN kanalları ve bunların yardımcı alt birimi arasındaki etkileşim Majör Depresif Bozukluk bir tedavi hedefi olarak tespit edilmiştir. Burada, bu protein-protein etkileşimi, küçük molekül inhibitörleri belirlemek için bir floresan polarizasyon tabanlı bir yöntem sunulmuştur.

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Bu makalede, telomer uzunluğunun hızlı ve etkin bir şekilde doğrudan ölçülmesini sağlayan, modifiye edilmiş bir terminal kısıtlama fragmanı analizi kullanarak telomer uzunluğunun nicelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol tartışılmıştır. Bu teknik telomer uzunluğunu ölçmek için çeşitli DNA hücreleri kaynaklarına uygulanabilir.

Jel Hibridizasyonunu Kullanarak Telomer Uzunluğunu Nicellemek İçin Modifiye Terminal Restriction Fragment Analysis

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

TEK molekül düzeyinde DNA'nın bölgeye özgü dekoltesini ölçmek için son derece paralel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, kısıtlama enonuclease NdeI kullanarak tekniği göstermektedir. Yöntem kolayca siteye özgü DNA bölünmesi ile sonuçlanan herhangi bir süreci incelemek için değiştirilebilir.

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, etiketlenmemiş protein kullanırken kısıtlama endonükleazlarının reaksiyon mekanizmasını araştırabiliriz. Bu tek moleküllü teknik, bireysel protein-DNA etkileşimlerinin büyük ölçüde çoğullanmış gözlemine izin verir ve veriler, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir araya getirilebilir.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Helmholtz-Zentrum Berlin'deki kristalografik parça taraması, özel bileşik kütüphaneler, kristal işleme araçları, hızlı veri toplama tesisleri ve büyük ölçüde otomatik veri analizi içeren bir iş akışı kullanılarak gerçekleştirilir. Sunulan protokol, aşağı akış yapısına dayalı ligand tasarımı için umut verici başlangıç noktaları sağlamak için bu tür deneylerin çıktısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır.

Helmholtz-Zentrum Berlin'de Kristalografik Parça Taraması için İş Akışı ve Araçlar

NMR ile fragman tabanlı tarama, küçük molekül bağlayıcılarını biyomakromoleküllere (DNA, RNA veya proteinler) hızlı bir şekilde tanımlamak için sağlam bir yöntemdir. Otomasyon tabanlı numune hazırlama, NMR deneyleri ve elde etme koşulları ve analiz iş akışlarını açıklayan protokoller sunulmaktadır. Bu teknik, tespit için hem 1H hem de 19F NMR-aktif çekirdeklerin optimum şekilde kullanılmasına izin verir.

Minimum numune ancak maksimum otomasyon modunda NMR tabanlı parça taraması

Bu belge, erişim başvurusundan ve veri dağıtımına kadar sonraki tüm adımlardan başlayarak kristal tabanlı parça taraması için tüm XChem sürecini açıklamaktadır.

Diamond Light Source'taki XChem Tesisinde Verimli Parça Taramasının Gerçekleştirilmesi

Hedef proteinin erime sıcaklığındaki değişiklikleri izlemek(yani,termal kayma tahlili, TSA), birkaç yüz bileşik parça kütüphanelerini taramak için etkili bir yöntemdir. İç triptofan floresanını ve parça taraması için hafif geri saçılmaları izlemek için robotik destekli nano-Diferansiyel Tarama Florüreti (nano-DSF) uygulayan bir TSA protokolü sunuyoruz.

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Burada, bir dizi uyumlu vektör kullanarak diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntem açıklıyoruz, ardından in vitro olarak bir araya gelemeyen protein komplekslerini incelemek için geleneksel pulldown teknikleri izleniyor.

Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz.  Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.

Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)

Öğrenin kovalent ilaç keşfinde qIT testi ile hedef proteinlere seçici bağlanan elektrofilik fragmanları taramayı. Bu floresans tabanlı yöntem, kitlesel spektrometri gerektirmeden seçiciliği artırır ve sağlam bir protokol sunar.

Kantitatif Tersinmez Tethering Testi Kullanılarak Kovalent Fragman Taraması

Daha fazla video keşfet