Kantitatif Tersinmez Tethering Testi Kullanılarak Kovalent Fragman Taraması
February 28th, 2025
Kantitatif geri dönüşümsüz bağlama (qIT) testi, bir hedef proteinle seçici olarak etkileşime giren kovalent fragmanları tanımlamak için floresan tabanlı bir yöntemdir. Burada, qIT testini tanımlamak için örnek sonuçlar dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir.
Kimya ve yaşam bilimleri bölümleri arasında çalışarak, bir dizi anti-kanser ilaç hedefi için yeni yardımcı reaktif kovalent ligandlar geliştiriyoruz. Bu moleküllerin gelecekte terapötik olarak veya muhtemelen kimyasal problar olarak kullanılacağı umulmaktadır. Bu nedenle, kovalent ligandları taramak için çeşitli teknolojiler mevcuttur.
Bunlar genel olarak, bileşiklerin kültürlenmiş hücrelerle inkübe edildiği proteomik tekniklere ve moleküllerin hangi proteinleri etiketlediğini belirlemek için kullanılan kütle spektrometresine ve elektrofil kütüphanelerinin tek tek proteinlerle inkübe edildiği hedef tabanlı yöntemlere ayrılabilir. Önemli bir deneysel zorluk, kovalent ligandların reaktivitesi ile ilgilidir. Aşırı reaktif moleküller genellikle tarama tahlilleri sırasında isabet olarak görünecektir, ancak hücredeki birçok farklı proteini seçici olmayan bir şekilde etiketleyecekleri için uygun değildirler.
Bu nedenle, aktivite bileşiği, kovalent ilaç keşfinin her adımında dikkate alınması çok önemlidir. Bu yüzden Imperial'deki Mann ve Armstrong grupları, kantitatif geri dönüşümsüz bağlanma veya qIT tahlili adı verilen bir protein hedefine karşı elektrofilleri taramak için yeni bir yöntem geliştirdiler. Protokolümüz, ölçeklenebilir, kütle spektrometresi gerektirmeyen ve bileşik içsel reaktiviteyi kontrol eden bir protein hedefine karşı elektrofilleri taramak için çok ihtiyaç duyulan, yeni bir yöntem sağlar.
Başlamak için, gerekli tüm stok çözeltilerini hazırlayın ve deneyden önce iki saat oda sıcaklığında bırakın. Yaklaşık 30 dakika boyunca argon gazı ile kantitatif, geri dönüşümsüz bağlama veya qIT tahlil tamponunun gazını alın. Gerçekleştiren bir tampon değişimi için, protein çözeltisini bir spin filtre ünitesinde gazı alınmış qIT tahlil tamponundan fazla seyreltin ve proteini konsantre etmek için dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 4.000 G'de döndürün.
Daha sonra, dokuz mililitre çözelti hazırlamak için hedef protein çözeltisini gazı alınmış qIT tahlil tamponunda 15 mikro azı dişi konsantrasyonuna seyreltin. TCEP-agraoz çözeltisi, qIT tamponu ve glutatyon stoğunu 384 oyuklu plakaların uygun kuyularına dağıtın. Her bir bileşiği qIT tahlil tamponunda 1.5 milimolar artı %3 DMSO'ya seyrelten bir bileşik seyreltme plakası oluşturmak için parça kitaplık plakasının karşılık gelen her bir oyuğundan 1.8 mikrolitre aktarın.
Bileşik seyreltme plakasının her bir oyuğundan 20 mikrolitre bileşik çözeltiyi her iki reaksiyon plakasına aktarmak için bir 384 pipetleme istasyonu kullanın. Başlamak için, istenen protein ve glutatyon ile kantitatif geri dönüşümsüz bağlama veya qIT testini ayarlayın. 500 Mikromolar CPM stoğunu mikrosantrifüj tüplerinde 111.2 mikrolitrelik alikotlara dağıtın ve 20 santigrat derecede saklayın.
CPM stoğunu çözdükten sonra, 1.4 mikromolar çözelti hazırlamak için 40 mililitre qIT tahlil söndürme tamponuna ekleyin İki taze 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 27 mikrolitre CPM Söndürme solüsyonu dağıtın. TCEP-agarozu peletlemek için protein reaksiyon plakasını 200 G'de üç dakika santrifüjleyin. Önceden belirlenmiş zaman noktalarında, protein reaksiyon plakasının her bir kuyucuğundan üç mikrolitre numuneyi CPM söndürme plakasına aktarmak için bir 384 pipetleme istasyonu kullanın.
Altta TCEP-agarozu aspire etmekten kaçınarak numuneyi kuyunun üstünden çıkarın. CPM söndürme plakalarını oda sıcaklığında bir saat inkübe edin ve 384 nanometrede bir uyarma ve 470 nanometrede emisyon ile floresan yoğunluğunu ölçün. Başlamak için, istenen protein ile kantitatif-geri dönüşümsüz bağlama veya qIT testi yapın ve numuneleri CPM plakasında söndürün.
Her söndürme için, tahlil kalitesinin bir ölçüsü olarak Z prime'ı hesaplayın. Ardından, birinci ve ikinci sütunlardaki negatif kontrol kuyuları ve 23 ve 24 numaralı sütunlardaki pozitif kontrol kuyuları için ortalama floresan değerlerini hesaplayın. Her reaksiyonu pozitif ve negatif kontrollerin ortalama floresan değerlerine iyi bir şekilde normalleştirin ve glutatyon ve hedef protein ile reaksiyona giren her bileşik için zamana karşı değiştirilen yüzdeyi ayrı ayrı çizin.
GraphPad'i kullanarak, denklemi kullanan her iki reaksiyon için de tek fazlı üstel bozunma modeline karşı normalleştirilmiş yüzde değiştirme verisini, AE'yi KT C'nin gücüne uygun hale getirin. Son olarak, İsabet parçalarını seçmek için bir REF eşiği, rastgele bir İsabet oranı ayarlayın veya geometrik ortalamadan üç standart sapma daha büyük REF değerine sahip parçaları seçin. Birinci bileşik, hedef protein üzerindeki sistein kalıntısı ile glutatyondan altı kat daha fazla oranda reaksiyona girdi ve üçten büyük REF Hit kriterini karşıladı.
Bileşik iki, glutatyona kıyasla hedef sistein kalıntısı ile hızlandırılmış bir reaksiyon hızı göstermedi, bu da üretken kovalent olmayan etkileşimlerin eksikliğini gösterdi ve bu nedenle bir isabet olarak seçilmedi.
Genel Bakış
Kantitatif geri dönüşsüz bağlanma (qIT) analizi, hedef proteinlerle seçici olarak etkileşen kovalent fragmanları tanımlamak için tasarlanmış, floresan tabanlı bir yöntemdir. Bu makale, qIT analizini, uygulamasını göstermek için örnek sonuçlarla birlikte ayrıntılı bir protokol sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kovalent ilaç keşfi
- Floresan tabanlı analizleri
- Protein-ligand etkileşimleri
Arka Plan
- Anti-kanser hedefleri için reaktif kovalent ligandların geliştirilmesi.
- Reaktivite nedeniyle kovalent ligandların taranmasındaki zorluklar.
- Mevcut yöntemler arasında proteomik teknikler ve hedef tabanlı yöntemler bulunmaktadır.
- Kompozit reaktivitesini kontrol eden ölçeklenebilir bir yöntem ihtiyacı.
Çalışmanın Amacı
- qIT analizini protein hedeflerine karşı elektrofilleri taramak için yeni bir yöntem olarak tanıtmak.
- Kitle spektrometrisi gerektirmeyen bir protokol sağlamak.
- İlaç keşfinde kovalent ligandların seçiciliklerini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- qIT analiz tamponunun stokunun hazırlanması ve gaz çıkarma işlemi.
- qIT analiz tamponunda protein konsantrasyonu ve seyreltme.
- Kompozit seyreltme ve reaksiyon kurulumu için 384 kuyuluk plakalar kullanımı.
- Kompozit reaktivitesini değerlendirmek için floresan yoğunluğunun ölçülmesi.
Ana Sonuçlar
- Hedef proteinlerle reaksiyon hızlarına göre hit fragmanlarının tanımlanması.
- Seçicilik belirlemek için hız artış faktörlerinin (REF) hesaplanması.
- qIT analizini etkinliğini gösteren örnek sonuçlar.
- Glutathion ve hedef proteinlerle kompozit reaktivitesinin karşılaştırılması.
Sonuçlar
- qIT analizi, elektrofilleri taramak için sağlam bir yöntem sunar.
- Seçici kovalent ligandların tanımlanmasına olanak tanır.
- Bu yöntem, kovalent ilaç keşfi alanını ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Covalent fragment screening using the quantitative irreversible tethering (qIT) assay addresses a critical challenge in early drug discovery: distinguishing selective covalent binders from broadly reactive compounds. By normalizing for intrinsic compound reactivity and providing quantitative selectivity metrics, qIT enhances predictive confidence at the hit identification and triage stage. This capability supports risk-adjusted portfolio advancement and reduces downstream attrition due to non-selective reactivity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of covalent ligand selectivity for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying target-specific reactivity versus off-target background.
- Facilitates prioritization of fragments with favorable selectivity profiles for further development.
Screening & Assay Development
- Delivers a scalable, fluorescence-based assay platform for high-throughput screening of electrophilic libraries.
- Standardizes quantitative measurement of reaction rates with both target proteins and glutathione controls.
- Enables reproducible identification of selective hits based on rate enhancement factor (REF) thresholds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early hit selection with translational requirements by excluding broadly reactive or promiscuous compounds.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by generating robust, quantitative selectivity data.
- Reduces risk of late-stage failure due to non-specific covalent modification in complex biological systems.
Pipeline & Workflow Integration
The qIT assay integrates at the hit identification and validation stage, bridging early discovery and lead optimization for covalent ligand programs.
- Discovery Biology: Quantifies selective covalent engagement, supporting hypothesis-driven target validation.
- Screening: Provides high-throughput, reproducible, and quantitative outputs for compound triage.
- Analytics: Generates REF values and normalized kinetic data to compare compound selectivity.
- Translational Research: Informs preclinical candidate selection by excluding non-selective electrophiles.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse protein targets and electrophilic libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hit selectivity and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes and scales covalent screening workflows without mass spectrometry.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by prioritizing selective hits.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage attrition from non-selective reactivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence-based assay setup and kinetic data analysis.
- Needs access to 384-well plate handling and compatible fluorescence plate readers.
- Demands rigorous cross-team standardization of controls and normalization procedures.
- Adaptable to various protein targets and electrophilic fragment libraries.
- Dependent on robust statistical analysis for hit threshold determination and data quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:16
Quantitative-Irreversible Tethering Assay for Electrophilic Ligand Screening
2:48
CPM-Quenching to Quantify the Amount of Unreacted Thiol Remaining in the Protein and Glutathione Reaction Plates of Quantitative-Irreversible Tethering Assay
4:18
Data Analysis and Hit Selection After the Quantitative-Irreversible Tethering Assay for Electrophilic Ligand Screening
