Maya Bütün Hücrelerinde Mitokondriyal Solunum Miktar Tayini

Mitokondriyal solunum, çoğu durumda hücresel enerjinin temel bir jeneratörüdür ve hücresel metabolizma ve zindeliğin önemli bir göstergesidir. Böylece, mitokondriyal fonksiyonlar biyoenerjetik hücresel durumu tanımlar. Bu protokol, biyoenerjetik bir parametre olarak G canlı hücrelerinde mitokondriyal solunumu ölçmek için bir tekniği tanımlar.

Bu protokolde açıklanan teknik, resveratrol ve koirsiten gibi bazı polifenollerin biyoenerjetik mekanizmasını tanımlamamıza yardımcı olur. Aynı zamanda, PTSPT'lerin de pentoz metabolizmasını ölçmek için bir araç görevi görür ve kabin ağacının arkasındaki biyoenerjetik değişimi ve zemin çalışması etkilerini açıklar. Hücrelerin, hücresel biyoenerjetik değerlerindeki önemli değişikliklerle birlikte, kabin ağacı ve zemin çalışması etkileri gibi bazı fenotipleri nasıl kazandığını deşifre etmekle ilgileniyoruz.

Mitokondriyal solunum, bu metabolik fenomenin arkasındaki moleküler mekanizmaları aydınlatmak için önemli bir araçtır. Başlamak için, üç mililitre YPD ortamı içeren 10 mililitrelik bir cam test tüpünü 250 mikrolitre gliserol korunmuş maya hücresi ile aşılayın. Test tüpünü gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve dakikada 200 devirde sürekli çalkalayın.

Daha sonra, steril bir halka kullanarak, 10 mililitrelik cam test tüpünde büyütülen maya hücreleri ile bir YPD burgu plakası çizin. İzole koloniler ortaya çıkana kadar Petri kabını 30 santigrat derecede inkübe edin. Bir ön aşılama hazırlamak için, üç mililitre YPD ortamını% 2 glikozda iki veya üç izole maya kolonisi ile aşılayın ve inkübe edin.

Daha sonra 500 mililitrelik bir Erlenmeyer şişesinde 100 mililitre steril sentetik tam ortam elde edin. Ortamı, 600 nanometrede 0.1'lik bir başlangıç optik yoğunluğunda gece boyunca aşılama öncesi maya kültürü ile aşılayın. Mitokondriyal solunumu test etmek için 100 mikromolar resveratrol gibi kimyasal zorluğu ekleyin.

Daha sonra, orta log faz hücrelerini boş, önceden tartılmış 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün ve hücreleri beş dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti 25 mililitre deiyonize su ile üç kez yıkayın. Boş tüpün ağırlığını çıkararak ıslak ağırlığı elde etmek için yıkanmış peleti içeren konik tüpü tartın.

Daha sonra yıkanmış peleti iki mililitre deiyonize suda tekrar süspanse edin. Başlamak için, resveratrol gibi uygun ilaçlarla tedavi edilen maya hücrelerini elde edin. Polar greft odasına beş mililitre 10 milimolar MES-TEA tamponu ve 50 miligram ıslak hücre yerleştirin.

Clark tipi oksijen elektrodunu nazikçe konumlandırın ve kabarcık oluşmadığından emin olun. YSI 5300A monitörünü ve veri toplama bilgisayarını açın. Birinci kanal ayar kadranını havaya ayarlayın ve birinci kanal kalibrasyon kadranı ile birinci kanalı %100'e ayarlayın.

Verileri kaydetmeye başlayın ve bir kronometre kullanarak zamanı ölçmeye başlayın. Bir kromatografi şırıngası kullanarak, oksitlenebilir substratı 10 milimolar nihai konsantrasyona ekleyin ve odayı sürekli çalkalama ile kapalı tutun. Daha sonra, bir kromatografi şırıngası kullanarak, oksimetre odasında 0.01 milimolar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için oligo misin ekleyin ve hava yüzdesi tüketimini kaydedin.

Benzer şekilde, maksimum solunum kapasitesini belirlemek için oksimetre odasında 0.015 milimolar'lık bir nihai konsantrasyona CCCP ekleyin. Daha sonra, bir milimolar renkte elektron taşıma zinciri inhibitörleri, diş ve yağ triflurositon veya TTFA ekleyin, ardından mililitre başına bir miligramda antimisin A ekleyin. Bir sonraki karbon kaynağına geçmeden önce hazneyi her biri %70 etanol ve ardından deiyonize su ile üç kez yıkayın.

Başlamak için, çeşitli karbon kaynakları ve kontrolleri kullanarak maya hücreleri ile bir oksijen tüketimi testi yapın. İstatistik yazılımında yeni bir proje dosyası oluşturun ve oluştur kısmında XY'yi seçiniz. Ardından enter tuşuna basın veya veri tablosu bölümünde verileri yeni bir tabloya aktarın.

Seçenekler bölümünde, X alt bölümündeki ve Y alt bölümündeki sayıları seçin. Yan yana alt sütunlara üç çoğaltma değeri girin'e tıklayın. X sütunlarına zaman verilerini girin ve Y sütunlarına hava yüzdesi verilerini girin.

Doğrusal regresyon analizi gerçekleştirmek için menü çubuğunda Çözümle'ye tıklayın ve analiz'in altında XY analizinde basit doğrusal regresyon'u seçin ve ardından Tamam'a tıklayın. Veri tablolarındaki sonuçlar bölümünden eğim değerini elde edin. Hesaplanan eğim değerlerini bir veri sayfasına kopyalayın.

Diğer oksijen tüketim kaynaklarını atmak için solunum inhibitörleri karışımından elde edilen eğim değerini oksitlenebilir substrat, oligomisin ve CCCP'den karıştırın. Şimdi, eğim değerlerini, bu durumda oksijenin çözünürlüğünü temsil eden 237 mikromolar oksijen ile çarpın ve tamponlayın. Değerleri, çizilen süre başına nasıl olduğuna göre ayarlayarak dakikadaki oksijenin mikromolarına dönüştürün.

Sonuçları, deneyde kullanılan hücrelerin miligramlarını temsil eden 50'ye bölün. Son olarak, oksijen tüketimi, dakikada miligram hücre başına mikromolar oksijen olarak ifade edilir. % 0.5 glikozda büyütülen hücreler, bazal solunumda, ATP'ye bağlı solunumda ve maksimum solunum kapasitesinde,% 5 glikozda yetiştirilenlere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek oksijen tüketimi gösterdi.

Quercetin, %0.5 glikoz ile büyütülen hücrelerde mitokondriyal solunumu önemli ölçüde azalttı, bazal, ATP'ye bağlı ve maksimum solunumu etkiledi. Öte yandan, quercetin,% 5 glikozda büyüyen hücrelerde mitokondriyal solunumu önemli ölçüde etkilemedi.