Name: Hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin üretimi ve kültürü için optimize edilmiş ve basitleştirilmiş teknik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Öğrenin fare karaciğerinden hassas kesilmiş karaciğer dilimleri üretmeyi ve en az dört gün kültürlemeyi. Bu yöntem metabolik araştırmalar için canlı doku mimarisini koruyan güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Temel laboratuvar ortamlarında karaciğer dilimlerinin kültürlenmesi için standartlaştırılmış protokol

<table><tbody><tr><td>3 cm petri kabı</td><td>Hücre kültürü için uygun herhangi biri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6, 12, 24 kuyulu kültür plakası</td><td>Hücre kültürü için uygun herhangi</td><td>biri</td><td></td></tr><tr><td>Siyanoakrilat süper yapıştırıcı</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Merck</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Etanol Herhangi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır serumu</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>, 12 oyuklu plakalar için 8um ekler</td><td>Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>uçlar 8um, 24 oyuklu plakalar için</td><td>Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>uçlar 8um, 6 oyuklu plakalar için</td><td>Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Laminer Akış Başlığı</td><td></td><td></td><td>Hepa hava filtrasyonu</td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>MTS tetrazolyum reaktifi&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab197010</td><td></td></tr><tr><td>çok kuyulu plaka okuyucu&nbsp;</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS tableti</td><td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçağı</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi forseps</td><td>Düz</td><td></td><td>kare uçlu&nbsp;</td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>William' GlutaMAX (WME) ile s Orta E</td> <td>ThermoFisher</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin üretimi ve kültürü için optimize edilmiş ve basitleştirilmiş teknik

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

Hasatta, organın hızlı bir şekilde işlenmesini sağlamak ve organ hasarını önlemek için hayvanın perfüzyonu kasıtlı olarak ihmal edilir. Karaciğer, insizyonun ardından hızlı bir şekilde çıkarılır ve hemen buz gibi soğuk bir organ koruyucu tampona, örneğin Krebs tamponu 24,29'a yerleştirilir. Taze karaciğer dokusunun gömülmeden dilimlenmesi daha önce tarif edilmiş olmasına rağmen1, karaciğerin düşük erime noktalı agaroz30 (Şekil 1) içine gömülmesi, organ koruyucu bir tampon ile birlikte vibratom üzerinde optimum kesme koşullarını mümkün kılarak doku hasarını azaltacak ve kesit kalınlığında tekrarlanabilirliği artıracaktır. İnce kesitler daha fazla hücre katmanının besinlere ve oksijene31 erişmesine izin verdiği ve hücre ölümünü azalttığı için doku kalınlığı kritiktir. Ancak çok ince olan kesitlerin homojen bir şekilde kesilmesi zorlaşır. Tersine, 400 μm'den daha kalın dilimler, daha düşük bir besin penetrasyon oranı gösterecektir. Bölümler, bir insert (Şekil 1) kullanılarak bir sıvı-hava arayüzünde inkübe edildi ve bir çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de% 5 CO2 ve% 21 O2 ile inkübe edildi. Bölümler, hasadı takip eden 3 saat içinde bir kültür ortamında inkübe edilmelidir, bundan sonra hücre ölümü hızla gerçekleşir32.
PCLS'nin canlılığını belirlemek için, hücre canlılığı 4,5-dimetiltiyazol-2-il)-5- (3-karboksimetoksifenil) -2- (4-sülfofenil) -2H-tetrazolyum (MTS) testi ile değerlendirildi, bu da NAD (P) H'ye bağımlı dehidrojenazlar, yani metabolik olarak aktif hücreler, MTS'yi azaltmak için. MTS değerleri, ilgili dilim ağırlığına göre normalize edilmiştir. PCLS canlılığını optimize etmek için, 24 saatlik inkübasyondan sonra canlılığı sürdürmek için minimum hacimde bir kültür ortamı gerekliydi. 24 oyuklu plakada 0.7 mL'lik bir hacim, 12 oyuklu plakada 1.5 mL ve 6 oyuklu plakada 2.6 mL'ye kıyasla TMS tahlili ile canlılıkta önemli bir azalma gösterdi (p = 0.02) (Şekil 2A). Bu hacimler, bölümlerin hafifçe kaplanmasına izin verecek şekilde seçilmiştir, ancak kullanılan eklerin ve plakaların türüne bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Diğerleri gibi33, 12 oyuklu plakalar, daha küçük bir kültür ortamı hacminde optimal sağkalım için en iyi uzlaşma olarak kullanılır.
Çalkalamak önemlidir ve inkübasyondan 24 saat sonra statik bir kültüre kıyasla PCLS canlılığını %50 artırır (Şekil 2B). Çalkalama, transwell'lerin kullanımıyla optimize edilmiş kritik bir hava-sıvı arayüzü oluşturur ve bölümün her iki yüzüne de besin maddelerine ve oksijene erişim sağlar. Oksijen ve besin maddelerinin alımı, aynı zamanda transwell zarından geçen çalkalama hareketinin yarattığı sürekli akış ile de artar.
MTS testi, 1 saatlik inkübasyondan inkübasyonun 6. gününe kadar değerlendirildi. Hücre canlılığı, 6. günde önemli bir azalma (p = 0.05) gözlemlemeden önce inkübasyon sonrası 0. günden 4. güne kadar sabit kaldı (Şekil 2C). Hematoksilen ve eozin (H&amp;E) boyaması ile değerlendirilen PCLS morfolojisi, inkübasyondan 5 gün sonrasına kadar safra kanallarında ve mimarisinde herhangi bir değişiklik göstermedi (Şekil 3A-D). 0. gün (Şekil 3A) ile karşılaştırıldığında, PCLS inkübasyon sonrası 1. gün (Şekil 3B) ve 2. gün (Şekil 3C) histolojik fark göstermedi, nükleer hiperkromazi, hafif inflamatuar infiltrat, inkübasyon sonrası 5. günde orta derecede hücre ölümü süreci lehine vakuolizasyon gösterdi (Şekil 3D). Birlikte ele alındığında, bu PCLS kültür protokolü, benzer koşullarda dilimler kullanan çalışmalarla tutarlı olarak en az 4 gün boyunca canlılık sağlar31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg"> 
Şekil 1: PCLS oluşturmak için protokolün şematik özeti. Bu rakam34'ten değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg"> 
Şekil 2: PCLS kültürünün optimize edilmiş protokolü, 5 gün boyunca tatmin edici canlılık göstermektedir. (A) Kuyu boyutunun hücre proliferasyonu üzerindeki etkisi (n = 3). (B) Çalkalamanın hücre proliferasyonu üzerindeki etkisi (koşul başına n = 6). (C) Karaciğer bölümlerinden d0 ila d6 inkübasyon günlerinden MTS Hücre proliferasyon testi (zaman noktası başına n = 5). OD keyfi birim, taze ağırlığı dilimlemek için normalleştirilmiş. Grafikte ortalama ± SS görülmektedir. Eşleşmemiş 2 kuyruklu Student t-testi, ns=anlamlı değil, *p&lt;0.05, **p&lt;0.01. Bu rakam34'ten değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg"> 
Şekil 3: Histoloji sonuçları. (M.S.) H&amp;E boyamasını takiben karaciğer PCLS histolojisinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μM. Bu rakam34'ten değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin üretimi ve kültürü için optimize edilmiş ve basitleştirilmiş teknik

This protocol presents a simple system for the creation and culture of Precision-cut Liver Slices (PCLS). PCLS contains all cells in an intact environment ...

optimized-simplified-technique-for-production-culture-precision-cut

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hassas kesilmiş dilimler içeren organotipik primer doku eksplant kültürleri, üç boyutlu (3 boyutlu) doku mimarisinin yanı sıra doğal dokunun çok hücreli etkileşimlerini temsil eder. Bu video, dokuların oksijen ve besin maddelerine aralıklı olarak maruz kalmasını sağlayan bir sistem olan dönen bir inkübasyon ünitesi kullanılarak murin akciğer tümöründen türetilmiş doku dilimlerinin kültürlenmesini açıklamaktadır. Protokol, ilaç yanıt çalışmaları için hassas kesilmiş akciğer tümörü dilimleri...

Akciğer Tümörü Dokusu Eksplant Kültürü: Hassas Kesilmiş Akciğer Tümörü Dilimleri Oluşturma ve Kültür Prosedürü

Bu videoda, izole edilmiş insan akciğerlerini agaroz ile şişirmek ve insan hassas kesimli akciğer dilimleri hazırlamak için bir prosedürü açıklıyoruz. Hazırlanan ex vivo akciğer dilimleri daha ileri immünolojik deneyler için kullanılabilir.

İnsan Hassas Kesimli Akciğer Dilimlerinin Agaroz Bazlı Hazırlanması

İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir.

İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

Bu protokol farelerden canlı hassas kesilmiş karaciğer dilimleri üretimi için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Ex vivo doku örnekleri laboratuvar doku kültürü koşullarında birden fazla gün boyunca muhafaza edilebilir, karaciğer patobiyolojisi incelemek için esnek bir model sağlayan.

Karaciğer Biyolojisi Ex Vivo Modeli olarak Murine Precision-Cut Karaciğer Dilimleri

Burada sunulan PCLS murine akciğer dokusunun damar kontrititesini korumak için bir protokoldür, bu da pulmoner vaskülat ve hava yolunun sofistike bir üç boyutlu görüntüsü ile sonuçlanır, bu da çok sayıda prosedüre duyarlı 10 güne kadar korunabilir.

Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri

Bu protokol, bir sıçan modelinde optimize edilmiş iki aşamalı kollajenaz karaciğer perfüzyon tekniği sunar ve in vitro uzun süreli 3D organoid kültürü için izole hepatositlerin kullanımını gösterir.

Sıçan Karaciğer Perfüzyonu ve Primer Hepatosit İzolasyonu: Son Teknoloji 3D Organoid Kültürü İçin Çok Önemli Eski Bir Prosedür

Bu video in vitro anjiyogenez tayininde bir protokol anjiyogenez özetlediği çeşitli aşamaları olduğunu göstermektedir. Zaman atlamalı çimlenme görüntüleri, lümen oluşumu, dallanma ve anastomoz - anjiyogenez temel özellikleri gösterilmektedir.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Bu protokol KLRG1 ligandların analizi için güçlü bir araçtır KLRG1 tetramer, üretim açıklamaktadır.

KLRG1 tetramer Üretim için Protokol

Tüm embriyo kültürü tekniği kültür fare ve sıçan embriyolar için bize izin...

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Öğrenin fare karaciğerinden hassas kesilmiş karaciğer dilimleri üretmeyi ve en az dört gün kültürlemeyi. Bu yöntem metabolik araştırmalar için canlı doku mimarisini koruyan güvenilir bir model sunar.

Hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin üretimi ve kültürü için optimize edilmiş ve basitleştirilmiş teknik

Daha fazla video keşfet