Hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin üretimi ve kültürü için optimize edilmiş ve basitleştirilmiş teknik

Hassas kesilmiş karaciğer dilimleri veya PCLS'yi üretmek ve kültürlemek için protokoller büyük ölçüde değişebilir. PCLS'nin ana dezavantajı kısa yarı ömürleridir, ancak burada, PCLS'nin üretilmesi ve kültürlenmesinin, en az dört günlük bir yarı ömür sağlarken Vibratom'a erişim ile standart laboratuvar koşullarında elde edilebileceğini gösteriyoruz. PCLS, in vitro ve in vivo modeller arasındaki boşlukları dolduran çekici bir modeldir, ancak nispeten kısa yarı ömürleri nedeniyle genellikle ihmal edilirler. Bununla birlikte, metabolik toplama için gerekli olan tüm hücre tiplerini ve korunmuş bir mimariyi içerirler ve bu nedenle tüm organın mini bir modeline benzerler, bu da karmaşık fenotiplerini çoğaltırken canlı dokuların incelenmesini ve tedavi edilmesini sağlar. Sürekli dilimler çok basit bir işlemdir ancak teknik olarak zordur. Bunu kolaylaştırmak için protokolümüz, kesmenin oryantasyonu ve dokunun gömülmesi gibi temel adımlara odaklanır, aynı zamanda kültür için mini bir model hacminin ve yarı ömürlerini artırmak için dinamik bir sistemin uygunluğuna odaklanır.

[Ekran Okuyucusu] Hasattan önce bir litre Krebs-Henseleit tamponu, dezenfekte edilmiş ve soğutulmuş bir Vibratom tepsisi, otoklavlanmış Vibratom bıçakları ve %4 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Hasat gününde, erimiş agarozu kullanana kadar 37 santigrat derecede bir su banyosunda tutun. Daha sonra, sırasıyla altı, 12 ve 24 oyuklu plakalara oyuk başına 2.6, 1.5 ve 0.7 mililitre tam ortam ekleyerek kültür plakalarını hazırlayın. Her kuyucuğa sekiz mikrometre gözenekli ekler yerleştirin. Plakaları% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen ile 37 santigrat dereceye ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Hasat için gerekli tüm aletleri uygun sterilizasyon yöntemlerini kullanarak sterilize edin. Alanı dezenfekte etmek için ötenazi yapılmış farenin karnına% 70 etanol püskürtün. Steril forseps ve makas kullanarak, karın boşluğunu açmak için cildi ve peritonu karnın ortasından kesin. Loblara zarar vermekten kaçınırken karaciğeri çevredeki organlardan veya damarlardan nazikçe inceleyin. Ardından, tüm karaciğeri hemen buz gibi soğuk Krebs tamponunda saklayın. Künt forseps ve keskin, steril bir bıçak veya makas kullanarak, ayırma sırasında loblara zarar vermemek için her lobu ayrı ayrı ayırın. Keskin, steril bir bıçak kullanarak, gömme için düz, yönetilebilir kenarlar oluşturmak için seçilen lobun tüm kenarlarını kesin. Daha sonra, %4 düşük erime noktalı agarozu, eşit şekilde soğuması ve lobun batmasını önlemek için ıslak buz üzerine yerleştirilmiş üç santimetrelik bir Petri kabına dökün. Agarozu 30 saniye daha soğumaya bırakın ve kesilmiş lobu agarozun ortasına yerleştirin ve bloğun ortasına yerleşmesine izin verin. Ardından, agaroz bloğunun dış kenarlarını kesin ve agaroz bloğunu tabaktan çıkarın. Üst tarafın ve Vibratom platformuna yapıştırılan tarafın lobun üst kenarına paralel olduğundan emin olun. Vibratomu 250 mikrometre kalınlığında, beş hızında ve yedi hertz frekansında kesecek şekilde ayarlayarak başlayın. Vibratomu sterilize ettikten ve tepsiyi Vibratomun üzerine yerleştirdikten sonra, ortamı soğuk tutmak için etrafını buzla sarın. Bıçakları yatay düzlemden aşağı doğru 10 derecelik bir açıyla ayarlayın. Ardından, Vibratom tankını buz gibi Krebs tamponu ile doldurun. Agaroz bloğunu monte etmeye hazırlamak için platforma ince bir tabaka siyanoakrilat yapıştırıcısı sürün. Daha sonra, steril emici doku kullanarak platforma yapıştırılacak agaroz bloğunun kenarını kurulayın. Şimdi, agaroz bloğunu Vibratom'un çıkarılabilir platformuna yerleştirin. Enine kesimlere izin vermek için karaciğer lobunu dik olarak konumlandırın, bu da lob üzerindeki baskıyı azaltır ve daha düzgün kesmeyi kolaylaştırır. Yapıştırıcının sertleşmesi için bir dakika bekleyin ve platformu Vibratom tankına daldırın, böylece agaroz bloğunun tamamen Krebs tamponu ile kaplandığından emin olun. Vibratomu kesim için programlamak için başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlayın. Ardından, karaciğer lobuna ulaşılana kadar dilimleri kesmeye başlayın. Karaciğer dilimlerini toplamak için bir spatula kullanın, çünkü bu, forseps veya fırçaların aksine hasarı önler. Dilimleri kültüre hazır olana kadar buz gibi Krebs tamponunda toplayın. Bir spatula kullanarak, karaciğer dilimlerini ortam ve ekler içeren hazırlanmış kuyucuklara aktarın. Ardından, plakaları 130 rpm'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve bunları %5 karbondioksit ve %21 oksijen ile 37 santigrat derecede geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.