Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Laboratuvarımızda, gıda endüstrilerinde kritik öneme sahip fermentatif bir bakteri olan lactiplantibacillus plantarum gibi bakterilerde hücre dışı elektron transferini veya EET'yi araştırıyoruz. EET'de hücre, elektronları biyoelektrik kimyasal sistemdeki bir elektrot gibi hücre dışı bir elektronik asaya aktarır. Biyoalgılama, biyokataliz ve gıda fermantasyonu uygulamaları için EET'yi anlamak ve tasarlamak istiyoruz.

Alp tünelinin, DHNA gibi kinon varlığında EET üzerinden akım satın alabileceğini keşfettik. Bu işlem NAD plus'ı yeniler, birincil fermantasyon yollarının genel kaybını hızlandırır ve hücre büyümesini hızlandırır. Ayrıca, DHNA dışındaki çeşitli kinon türevlerinin de L plantarum'da EET'ye aracılık edebileceğini bulduk.

Aracılı EET'nin araştırılması özel, biyokimyasal kurulumlar gerektirir. Spesifik olarak, anodik ve katodik reaksiyonlar arasında çapraz konuşmayı önlemek için üç elektrotlu, iki odacıklı bir biyoelektrokimyasal sistem kullanıyoruz. Ayrıca, elektron aracılarından elektron transferini geliştirmek için geniş bir yüzey alanına sahip bir karbon alanı, çalışma elektrodu kullanıyoruz.

L plantarum'daki EET yollarını ve bu yolların fermentatif metabolizma ile nasıl etkileşime girdiğini araştıran çalışmamız, gıda endüstrilerinde yararlı uygulamalara sahip olabilir. EET ve L plantarum'un fermantasyon yoluyla metabolik akıyı değiştirdiğini ve bunun yararlı uygulamalar için manipüle edilebileceğini ve gıda tatlarını değiştirebileceğini ve elektro fermantasyonda değerli kimyasallar üretebileceğini biliyoruz. Gelecekte, EET hakkındaki temel bilgilerimizi artırmaya ve L plantarum gibi organizmalarda yeni EET uygulamalarını takip etmeye devam edeceğiz.

EET yolundaki proteinleri tasarlamayı planlıyoruz, bu da elektro fermantasyon ve biyoalgılama uygulamaları için EET'yi daha fazla kontrol etmemizi sağlayacak. Başlamak için, karşı elektrotlarda çalışmak için bir milimetre çapında titanyum telleri alüminyum oksit zımpara kağıdı ile eşit şekilde parlak olana kadar önceden kesin. Pense kullanarak, her bir çalışma elektrot telinin bir ucunu küçük bir kancaya bükün.

Her bir çalışan elektrot telinin üzerine 16 santimetre karelik bir karbon keçe yuvarlağı kaydırın, teli karbon keçenin içine ve dışına bir kez dokunun ve kancaya sabitlenene kadar yuvarlağı telden aşağı çekin. Kauçuk septumu tel ile delerek ve birkaç santimetre çekerek çalışma karşılaşma elektrotlarını GL 45 kapaklarına sabitleyin. Eşleştirilmiş reaktörler oluşturmak için, O-ringi monte edin ve monte edilmiş O-ringe önceden suya batırılmış önceden kesilmiş bir katyon değişim membranı yerleştirin.

O-ringi, membranla birlikte iki eşleştirilmiş reaktör şişesinin geniş alt açıklıkları arasına yerleştirin. Reaktör çiftini, şişeleri ve zarla birlikte bir halkayı bir mafsal ile sabitleyin.amp. Kauçuk septa ile donatılmış GL14 kapaklı her şişenin üstündeki tüm küçük açıklıkları kapatmadan önce her bir anodik odaya manyetik bir karıştırma çubuğu bırakın.

Her reaktör şişesini 110 mililitre deiyonize su ile doldurun. Karbon keçe yuvarlak çalışma elektrotu ile donatılmış kapakları takın ve kancaya sabitlenmiş halde tutmak için keçe yuvarlağının üstüne hafifçe bastırın. Şişeleri uygun, elektrot takılı GL45 kapakla kapatın.

Otoklav su dolu reaktörler ve GL14 elektrot kapakları. Steril koşullar altında, bir gliserol stoğunun üstünden laktoplant abasilisk plantarum kültürünü kazıyın ve üç mililitre ticari talep rugosa keskin veya MRS ortamında aşılayın. Kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalamadan inkübe edin.

Başlamak için, steril bir biyogüvenlik kabininde, otoklavlanmış suyu biyo elektrokimyasal sistem reaktörlerinden atın. Katodik odaları 110 mililitre otoklavlanmış M9 ortamı ve anodik odaları 110 mililitre taze hazırlanmış MCDM ile doldurun. Anodik odadan bir GL14 kapağını, silikon tavan halkalı bir otoklav GL14 kapağıyla değiştirin.

Hazırlanan referans elektrotlarına, elektrot kapağından her bir anodik odaya yerleştirmeden önce %70 etanol püskürtün. Sızıntıyı önlemek için tüm kapakları ve kelepçeleri sıkın. Reaktörleri su pompası sistemine bağlamak için önce her bir reaktörü uygun karıştırma çubuğu platformuna yerleştirin.

Ardından, her bir reaktörün su ceketi musluklarını kauçuk boru ile bir sonrakine bağlayın ve uç reaktörleri su pompasının giriş ve çıkış borularına bağlayın. Pompayı suyla doldurun ve dört ila altı damla su düzenleyici ekleyin. Pompa sistemini açın ve sıcaklığı 30 santigrat dereceye ayarlayın.

Pompayı çalıştırın ve tüm reaktör su ceketlerinden geçen su akışını gözlemleyerek sızıntı olmadığını onaylayın. Karıştırma platformlarını açın ve 220 RPM'de sürekli karıştırmaya ayarlayın. Reaktörleri nitrojen koruyucu gaz hatlarına bağlamak için, önce 22 gauge iğneye bir hava filtresi takın ve iğneyi bir reaktör anodik odasının üst septumundan ortama sokun.

Bir reaktör anodik odasının üst septumuna 18 gauge bir iğne yerleştirin, ardından bir nitrojen kaynağından gelen gaz hattını hava filtresine bağlayın ve gazın reaktörden nazikçe kabarmasına izin vermek için valfi açın. Biyoreaktörleri potansiyostat uçlarına bağlamak için, potansiyostattan gelen çalışma sayacını ve referans elektrot timsah klipsi uçlarını karşılık gelen elektrotlarına bağlayın. Tüm parametreleri girdikten sonra, çalıştırmaya başlamak için yeşil başlangıç üçgenine basın.

Tüm reaktörlerin pozitif okuduğundan emin olmak için açık devre voltaj izlerini birkaç dakika gözlemleyin. ve sabit bir sinyalle birbirine yakın. Steril koşullar altında, daha önce yetiştirilen L plantarum kültürünü 50 mililitre MMRS'de bir ila 200 arasında alt kültürleyin.

Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede sallamadan büyütün. Başlamak için, MMRS'de yetiştirilen L plantarum kültürünü inkübatörden çıkarın. Kültürü steril koşullar altında 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.

Kültürü 4.000 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Peleti 50 mililitre PBS'de yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı çıkarın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri soğuk PBS'de 600 nanometre 11'de optik yoğunluğa yeniden süspanse edin.

İki mililitre yeniden askıya alınmış hücreyi, bir iğne ile donatılmış üç mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Reaktör istasyonunda, bir hücre şırıngasının kapağını açın ve iğneyi bir reaktör anodik odasının üstüne yerleştirin. Tüm şırıngalar yerleştirildikten sonra, hücreleri enjekte etmek için pistonlara bastırın.

Kronoamperometri izinden enjeksiyon zamanını kaydedin. Akımın iz üzerinde iki ila dört saat stabilize olmasına izin verin. Biyoelektrokimyasal sistemde, deney reaktörlerini artı DHNA ve çözücü kontrol reaktörlerini eksi DHNA olarak etiketleyin.

Mililitre DHNA'da 110 mikrolitre 20 miligram yüklü bir şırıngayı açın ve artı DHNA olarak adlandırılan anodik odanın üstüne yerleştirin. 110 mikrolitre DMSO yüklü bir şırıngayı eksi DHNA olarak belirtilen anodik odaya yerleştirin. 21 gauge iğne ile donatılmış üç mililitrelik bir şırınga kullanarak, kullanılmayan küçük kapaklı septumdan her bir anodik odadan iki mililitre ortamı çıkarın.

Sıfırıncı saat zaman noktası için pH'ı ölçmek için numuneleri 24 derin kuyulu bir plakaya aktarın. Reaktörlere enjekte etmek için DHNA ve DMSO şırıngalarının pistonlarına bastırın. Kronoamperometri izinden enjeksiyon zamanını kaydedin.

Tüm şırıngaları ve iğneleri atın. 24 saat sonra, daha önce tarif edildiği gibi her bir anodik odadan iki mililitre ortam çıkarın ve 24 saatlik pH ölçümleri için 24 derin kuyulu bir plakaya aktarın. 24 saatlik zaman noktası için döngüsel voltametriyi çalıştırın.

Her reaktörden alınan 24 saatlik numuneler için pH'ı ölçün ve kaydedin. Hücre dışı elektron transferinden kaynaklanan akım yoğunluğu, DHNA enjeksiyonundan sekiz saat sonra santimetre kare başına yaklaşık 132 mikroamperlik bir zirveye ulaştı. Buna karşılık, DMSO enjeksiyonu ihmal edilebilir bir akım yoğunluğu ile sonuçlandı.

Döngüsel voltametri verileri, DHNA ile L plantarum varlığında 50 milivoltta oksidatif akımda belirgin bir artış gösterdi, DMSO'lu L plantarum'a kıyasla ve abiyotik DHNA izine kıyasla 300 milivoltta akım yoğunluğunda% 256'lık bir artış gösterdi. Hücre dışı elektron transferi, L plantarum ve DHNA'lı numunelerde pH'da 24 saat içinde ortalama 3.33'e kayda değer bir düşüşe neden olurken, L plantarum ve DMSO'lu numunelerin ortalama pH'ı 6.50'dir.