Name: İnsan Adenozin Deaminaz 1 Enziminin Serum Stabilitesinin Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Keşfedin insan serumunda enzim stabilitesini değerlendirme yöntemlerini, kanser tedavisinde protein biyolojiklerinin farmakokinetik profillerini ve terapötik etkinliğini artırmak için.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Serum inkübasyonu
<ol><li>10 μM'lik bir nihai konsantrasyonda 1x PBS pH 7.4'te (1x PBS) 10x HsADA1 stoğu hazırlayın. 15 mL'lik bir havuzlanmış insan serumu alikotunu çözün ve 37 ° C'ye ısıtın. 50 mL'lik 1x PBS'lik bir alikotu 37 °C'ye önceden ısıtın.</li>
	<li>Enzim + serum karışımı olarak adlandırılan düşük bağlı bir mikrosantrifüj tüpünde 900 μL havuzlanmış insan serumuna 10 μL 10x HsADA1 stoğu ekleyerek enzim-serum inkübasyon karışımlarını hazırlayın. Ayrı bir düşük bağlı mikrosantrifüj tüpünde, enzim + 1x PBS karışımı olarak adlandırılan serum olmayan bir kontrolle karşılaştırmak için 10 μL 10x HsADA1 stokunu 900 μL 1x PBS'ye ekleyin. Her karışımdaki nihai HsADA1 konsantrasyonu 1 μM olacaktır.</li>
	<li>900 μL havuzlanmış insan serumu ile karıştırılmış 100 μL 1x PBS'den oluşan düşük bağlı bir mikrosantrifüj tüpünde ek bir kontrol hazırlayın. Bu, enzim + serum karışımı için enzim olmayan kontrol görevi görecektir. Ek olarak, 1 mL 1x PBS'den oluşan bir kontrol yapın. Bu, enzim + 1x PBS karışımı için enzim olmayan kontrol görevi görecektir.</li>
	<li>Adım 1.2'den itibaren her karışımın 100 μL'sini ayrı düşük bağlı tüplere alın ve 1x PBS'de 100 μL% 30 (h / h) gliserol ile 1: 1 seyreltin. Sıvı nitrojen ile hızlı dondurun ve -80 °C'de saklayın. Bu numuneler Gün 0 zaman noktası olacak ve içlerindeki HsADA1 konsantrasyonu 500 nM olacaktır. 1.3'ten itibaren enzim olmayan kontrol karışımları için bu adımı tekrarlayın. Tüm enzimleri ve kontrol karışımlarını şeffaf film ile kapatın ve 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>24 saat sonra, inkübe edilen her numuneden 100 μL'yi ayırın ve 1x PBS'de 100 μL% 30 (h / h) gliserol ile 1: 1 seyreltin. Sıvı nitrojen ile hızlı dondurun ve -80 °C'de saklayın. Bu örnekler 1. gün zaman noktası olacaktır. Tüm enzim ve kontrol karışımlarını 37 °C inkübatöre geri koyun. Bu adımı 72 saat ve 120 saatte tekrarlayın. NOT: Aliquoted örneklerinin mutlaka flaşla dondurulması gerekmez. Alternatif olarak, kullanıcı her bir numuneyi aldıktan hemen sonra mikroplaka bazlı testi gerçekleştirebilir, ancak her numune test edildiğinde taze standart eğriler ve adenosin substrat stokları hazırlanmalıdır.</li>
</ol>2. Mikroplaka bazlı test
<ol><li>260 dakika boyunca en kısa okuma aralığı ile 30 nm'de absorbansı ölçmek için bir kinetik okuma protokolü (Şekil 2) ayarlayarak mikroplaka okuyucuyu hazırlayın ve okuyucuyu 37 °C'lik bir ayar noktasına önceden ısıtın.</li>
	<li>Toplanan tüm örnekleri buz üzerinde çözdürün. Düşük bağlı mikrosantrifüj tüplerinde seyreltici olarak 37 ° C'ye önceden ısıtılmış 1x PBS kullanarak çözülen her numuneyi 1:10 oranında seyreltin. Bu numunelerdeki yeni HsADA1 konsantrasyonu 50 nm olacaktır.</li>
	<li>Enzim olmayan serum kontrol örneğinden de 1x PBS'ye 10x seyreltme yapın. Ek olarak, 50 mL 1x PBS'ye 66.8 mg adenosin ekleyerek 5 mM'lik bir adenosin stoğu hazırlayın. 7.600 μL 1x PBS'ye 400 μL adenosin stoğu ekleyerek 250 μM'lik bir adenozin seyreltmesi hazırlayın ve bir inkübatörde 37 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>96 oyuklu UV uyumlu bir mikroplakaya, toplam 200 μL'lik bir hacim için üç kopya halinde 160 μL 250 μM adenosin seyreltmesi ve her seyreltilmiş protein örneğinden 40 μL ekleyin. Bu, 200 μM'lik bir nihai adenozin konsantrasyonu ve 10 nM'lik bir nihai enzim konsantrasyonu verecektir.</li>
	<li>Üç kopya halinde 40 μL seyreltilmiş serum veya 1x PBS kontrolü ve 160 μL 250 μM adenosin seyreltmesi ekleyerek kontrol numuneleri için seyreltmeyi tekrarlayın. Bu aynı zamanda 200 μM'lik bir nihai adenozin konsantrasyonu verecektir, ancak enzim içermez. NOT: Toplam yükleme süresini azaltmak için önce tüm seyreltilmiş enzim ve kontrol numunelerini mikroplakaya ayrı ayrı eklemek ve ardından adenozin substratını 12 kanallı bir mikropipet ile eklemek faydalı olabilir. Ek olarak, plakanın kendisinin ölçülen absorbans sinyalini karıştırmasını önlemek için bu adımda UV şeffaf plakalar kullanılmalıdır.</li>
	<li>Her bir kuyucuğun absorpsiyonunu 260 nm'de 30 ° C'de 37 dakika boyunca ölçün. Tamamlandığında, daha fazla analiz için verileri bir elektronik tabloya aktarın.</li>
</ol>3. Mikroplaka okuyucu verilerinin analizi
<ol><li>Mikroplaka verilerinin ilk birkaç dakikası için zamanın bir fonksiyonu olarak absorbans verilerinin doğrusal bölgesinin eğimini belirleyin. Serumla seyreltilmiş numuneler için bu, ilk ~ 120 s'ye karşılık geldi. 1x PBS ile seyreltilmiş numuneler için bu, ilk ~ 270 s'ye karşılık geldi. Azalan soğurma değerlerinin bu eğimi, negatif bir sayısal değere sahip olacak ve saniyedeki soğurma birimlerinde (ΔA260/s) değişim birimlerine sahip olacaktır.</li>
	<li>Havuzlanmış insan serumundan oluşan negatif kontrolün eğimini enzim + serum verilerinin eğiminden çıkarın. Aynı işlemi 1x PBS kontrolünün eğimini çıkararak enzim + 1x PBS karışımları üzerinde de gerçekleştirin.</li>
	<li>Denklem 0'i kullanarak kalan aktivite fraksiyonunu elde etmek için ayarlanan tüm eğimleri t=1 h'deki orijinal eğime normalleştirin. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;">Denklem 1</li>
	<li>Zamana karşı kalan etkinlik oranını çizin.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>HsADA1'in Serum Stabilitesinin Değerlendirilmesi: Mikroplaka Bazlı Bir Yaklaşım

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adenozin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT Mikroplaka Okuyucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Mikrosantrifüj Tüpleri: Protein&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>13-698-795</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>G33-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td><td>Ev</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İçi İnsan Serumu, Havuzlanmış</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>92931149</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Hidroksi-kinürenin</td><td>Cayman Kimyasalları</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>İnosin&nbsp;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 g</td></tr><tr><td>PBS, 1x&nbsp; pH 7.4+/- 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Piridoksal 5-fosfat monohidrat, %99&nbsp;</td><td>Thermo Scientifc 228170010</td><td></td><td>1 g</td></tr><tr><td>UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM</td><td>Greiner Bio</td><td>&nbsp; </td><td></td>655801</tr><tr><td>Wildtype İnsan Adenozin Deaminaz 1</td><td>Kurum</td><td></td><td></td> İçi</tr></tbody></table>

İnsan adenozin deaminaz 1 enziminin serum stabilitesinin belirlenmesi

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

Şekiller, vahşi tip HsADA1 ile yapıldığında yapılan tahlil çalışmasının sonuçlarını göstermektedir. Şekil 3A,B, adenozin ilavesinden sonra vahşi tip HsADA1 için 1x PBS/serum-enzim karışımlarından kaynaklanan numunelerin 260 nm'deki absorbans düşüş eğrilerini göstermektedir. Zaman verilerinin bir fonksiyonu olarak bu azalan absorbans, kullanıcının mikroplaka bazlı testin başarılı bir şekilde tamamlanmasından sonra bekleyebileceği şeydir ve adenosine yeterli miktarda fonksiyonel HsADA1 eklendikten sonra ortaya çıkacak olan absorbans verilerine benzer. Şekil 3C,D, adenozin ilavesinden sonra enzim içermeyen test edilen negatif kontrollerin absorbans eğrilerini göstermektedir. Gerçek enzim örnekleriyle karşılaştırıldığında, bu negatif kontrollerin absorbans değişimi neredeyse yok denecek kadar azdır. Şekil 3'ten, enzim eğrilerinin eğimlerinin inkübasyon süresinin bir fonksiyonu olarak değiştiği görülebilir. Örneğin, Gün 0 zaman noktasının eğimi, Gün 5 zaman noktasından çok daha diktir.
Şekil 4, 1x PBS'de veya 37 ° C'de havuzlanmış insan serumunda inkübe edildiğinde zamanın bir fonksiyonu olarak vahşi tip HsADA1 tarafından tutulan aktivite fraksiyonunu göstermektedir. Spesifik olarak, Şekil 3A,B'deki tüm absorbans düşüş eğrilerinin eğimleri, ilgili gruplarından Gün 0 eğimlerine normalize edilmiştir. Şekil 4'te görülebileceği gibi, havuzlanmış insan serumuna karşı 1x PBS'de vahşi tip HsADA1 için tutulan aktivitede bir farklılık vardır. Spesifik olarak, enzim, havuzlanmış insan serumunda aktivitesini daha hızlı kaybeder ve enzim, 5. günde orijinal aktivitesinin yaklaşık% 10'unu korur. HsADA1, 1x PBS'de inkübe edildiğinde bir aktivite kaybı hala tespit edilebilir, ancak enzim aktivitesinin yaklaşık% 75'ini korur. Bu, Jennings ve ark.'nın sonuçlarıyla uyumludur ve ayrıca 37 ° C'de serumla inkübasyondan sonra aktivitede 48 saat sonra yaklaşık% 40 oranında bir azalma olduğunu bildirmektedir6. Lu ve ark. ayrıca ortam sıcaklığında (25 °C) plevra, periton ve beyin omurilik vücut sıvılarında HsADA1 aktivitesinin azaldığını göstermiştir8.
Bu protokolün esnekliğini göstermek için, daha önce HsKYNase66-W102H-T333N7 olarak adlandırılan tasarlanmış bir insan kinüreninaz varyantı olan insan kökenli başka bir enzimin serum stabilitesini test etmek için kullandık. HsKYNase66_W102H-T333N, OH-Kyn'nin OH-AA'ya dönüşümünü verimli bir şekilde katalize eder, vahşi tip HsKYNaz enzimine benzer şekilde, aslında değiştirilmiş substrat özgüllüğüne sahip bir mühendislik insan kinüreninaz varyantının iki amino asit geri dönüş mutantıdır, yani, kinürenini etkili bir şekilde antranilik asit7'ye indirgeyen. OH-Kyn, 379 nm'de güçlü bir şekilde absorbe ederken, OH-AA emmez, bu da tasarlanmış HsKYNase varyantımızın OH-kyn 9,10'a eklenmesiyle ölçülebilir absorbans düşüşüne neden olur. Şekil 5A, B, OH-Kyn ilavesinden sonra HsKYNase için 1x PBS/serum-enzim karışımlarından kaynaklanan numunelerin 379 nm'deki absorbans düşüş eğrilerini göstermektedir. Şekil 5C,D, enzim içermeyen test edilen kontrollerin absorbans eğrilerini göstermektedir. HsADA1'de görüldüğü gibi, numuneler arasındaki absorbans eğrilerinin eğimlerinde belirgin bir fark vardır. Bu, özellikle Şekil 5A'da belirgindir, çünkü 0 saatlik zaman noktası eğimi, 3 saatlik ve 24 saatlik zaman noktalarından çok daha diktir. Şekil 6, zamanın bir fonksiyonu olarak test edilen HsKYNase için tutulan karşılık gelen aktivite fraksiyonunu göstermektedir. HsADA1 gibi, HsKYNase66-W102H-T333N de serumda PBS'den daha hızlı aktivite kaybeder (24 saat boyunca ~% 40'a karşı ~% 85 aktivite kaybı). Bu enzim varyantının serum stabilitesi daha önce test edilmemiş olsa da, 37 ° C'de serumda 24 saat içinde aktivitelerinin çoğunu kaybeden diğer HsKYNase varyantları gibi genel eğilimi takip eder7. 
Genel olarak konuşursak, enzimler pH, tuz konsantrasyonu, sıcaklık ve daha fazlası dahil olmak üzere bir dizi faktöre bağlı olarak zamanla aktivitesini kaybedebilir11. Bu nedenle, bu eğilimi takip etmeyen bir sonuç anormal olarak kabul edilebilir. Örneğin, enzimatik aktivite zamanla büyük ölçüde artarsa, bu sonuçların geçersiz olduğunu gösterebilir. Bu, enzim koşullarının değişmediğini varsayıyor ve biz kesinlikle zaman anlamında konuşuyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg"> Şekil 1: HsADA1 protokolünün adımlarını detaylandıran akış şeması. Şekil, bu protokolde izlenen adımları göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg"> Şekil 2: Mikroplaka okuyucu kinetik okuma ayarları. Minimum aralıkla 37 ° C'de 30 dakika boyunca 260 nm'de absorbansı ölçmek için bir kinetik okuma protokolü oluşturuldu. Şekil, bu protokolü ayarlamak için seçilen ayarları göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg"> Şekil 3: 200 μM adenosin ilavesinden sonra HsADA1 için absorbansa karşı zaman eğrileri. (A) 200 μM adenosin ilavesinden sonra serum inkübe edilmiş HsADA1 için zaman eğrilerine karşı absorbans. (B) 1x PBS ile inkübe edilmiş HsADA1. (C) Serum negatif kontrolü. (D) 1x PBS negatif kontrol (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg"> Şekil 4: HsADA1 aktivitesinin korunması. Aktivite, 37 ° C'de havuzlanmış insan serumuna karşı 1x PBS'de değerlendirilir. 5 gün boyunca havuzlanmış insan serumuna karşı 1x PBS'de inkübe edilen HsADA1 için tutulan orijinal aktivitenin fraksiyonu belirlendi (çubuklar = SD'± ortalama, n = 3). İki kuyruklu eşleşmemiş t-testi *p&lt;0.05, **p &lt; 0.01 ve ***p &lt; 0.001 kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg"> Şekil 5: 400 μM OH-Kyn ilavesinden sonra HsKYNase66-W102H-T333N için absorbansa karşı zaman eğrileri. (A) 400 μM OH-Kyn ilavesinden sonra serum inkübe edilmiş HsKYNase için zaman eğrilerine karşı absorbans. (B) 1x PBS ile inkübe edilmiş HsKYNase. (C) Serum negatif kontrolü. (D) 1x PBS negatif kontrol (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg"> Şekil 6: HsKYNase66-W102H-T333N aktivite tutma. Aktivite, 37 ° C'de havuzlanmış insan serumuna karşı 1x PBS'de değerlendirilir. 24 saat boyunca havuzlanmış insan serumuna karşı 1x PBS'de inkübe edilen HsKYNase66-W102H-T333N için tutulan orijinal aktivitenin fraksiyonu belirlendi (çubuklar = ortalama ± SD, n = 3). İki kuyruklu eşleşmemiş t-testi kullanıldı; p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Adenozin ve inosinin standart eğrisi. Belirtilen konsantrasyonlarda 1x PBS'ye adenozin veya inosin ilave edildi ve daha sonra 260 nm'deki absorbans ölçüldü. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: OH-Kyn'in standart eğrisi. Çizim 0-400 μM için çizildi. OH-Kyn, belirtilen konsantrasyonlarda 1x PBS'ye eklendi ve daha sonra 379 nm'deki absorbans ölçüldü. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 3: 200 μM adenosin ilavesinden sonra artan HsADA1 konsantrasyonları ile 260 nm'de zamana karşı absorbans. (A) Değişen HsADA1 konsantrasyonları için reaksiyon eğrileri. (B) 1x PBS kontrolüne göre absorbans eğrilerinin doğrusal bölgesinin eğimindeki kat değişikliği (çubuklar = ortalama ± SD, n=3). İki kuyruklu eşleşmemiş t-testi **p &lt; 0.01 ve ****p &lt; 0.0001 kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 4: 400 μM OH-Kyn ilavesinden sonra artan mühendislik HsKYNase konsantrasyonları ile 379 nm'de zamana karşı absorbans. (A) Tasarlanmış HsKYNase'in değişen konsantrasyonları için reaksiyon eğrileri. (B) 1x PBS kontrolüne göre absorbans eğrilerinin doğrusal bölgesinin eğimindeki kat değişikliği (çubuklar = ortalama ± SD, n=3). İki kuyruklu eşleşmemiş t-testi ****p &lt; 0.0001 kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 5: 400 μM OH-Kyn'de ısıyla devre dışı bırakılmış enzim kullanılarak 379 nm'de zamana karşı absorbans. 1x PBS'de 400 μM OH-Kyn'ye ısıyla deaktive edilmiş HsKYNaz enzimi ilave edildi ve daha sonra 379 nm'deki absorbans ölçüldü. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

İnsan Adenozin Deaminaz 1 Enziminin Serum Stabilitesinin Belirlenmesi

The concept of enzyme stability is typically used to refer to an enzyme's thermostability - its ability to retain structure and activity as temperature ...

determining-the-serum-stability-of-human-adenosine-deaminase-1-enzyme

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Asetat kinaz aktivitesinin belirlenmesi için bir yöntem açıklanmıştır. Bu testte, asetat oluşturan yönde asetat kinaz enzim aktivitesi ve kinetiği farklı fosforilasyonunu alıcıları belirlemek için doğrudan bir tepki kullanır. Ayrıca, bu yöntem diğer asetil fosfat ya da asetil-CoA kullanan enzimler assaying için kullanılabilir.

Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Bu makale, hidrofobik olarak modifiye edilmiş Nafion enzim immobilizasyon membranı ve nasıl membran içindeki protein ve / veya enzim hareketsiz ve spesifik aktivite için test etmek için sentez prosedürü tarif edecektir.

Enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için hidrofobik Tuz-modifiye Nafion

Bu videoda, lösemik kanser hücrelerinin hücre dışı ortamında AMP tüketimiyle üretilen adenozin ve ilişkili pürinlerin metabolizmasını ölçmek için kantitatif bir ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) yöntemi açıklanmaktadır. Protokol, farklı kültür koşulları altında saflaştırılmış kronik lenfositik lösemi (KLL) hücreleri tarafından üretilen hücre dışı pürin nükleotidlerinin ve nükleositlerinin miktar tayini için geliştirilmiş ve doğrulanmış hassas, spesifik, güvenilir ve...

Hücre Dışı Pürin Metabolizması: Lösemik Hücrelerde Adenozin Üretimini ve Metabolizmasını Ölçmek İçin HPLC Tabanlı Bir Test

Radikal tabanlı biomimetic kimya biyolojik gelişimi için gerekli bina-up kütüphaneler uygulanmıştır.

Kimyasal Biyoloji Serbest Radikaller: Kimyasal Davranış den Biyomarker Kalkınma

PAD4, peptidil-argininin peptidil-sitrüline dönüşümünden sorumlu bir enzimdir. PAD4'ün düzensizliği bir dizi insan hastalığında rol oynamaktadır. Kolay ve yüksek verimli uyumlu bir floresan bazlı PAD4 testi açıklanmaktadır.

Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan&#39;a bağlı İzleme

Burada açıklanan protokol, farklı koşullar altında kültürlenen kronik lenfositik lösemi (KLL) hücrelerinde pürin metabolizmasını ölçmek için ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) kullanan kolay ve tekrarlanabilir bir yöntemi temsil eder.

HPLC tabanlı Testi İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Ekstraselüler Nükleotid / Nükleozid Metabolizması Monitör

Enzim aktivitesinin termal kararlılık kolayca izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) tarafından ölçülür. Çoğu protein istikrar deneyleri şu anda ölçü protein unfolding kullanılan ancak enzimatik etkinliği hakkında bilgi sağlamaz. ITC enzim değişiklikleri istikrarı üzerinde enzim aktivitesinin etkisini doğrudan tayini sağlar.

İzotermal titrasyon Kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar

Bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz tsay küçük molekül miyozin inhibitörleri yarı yüksek iş lenme taraması için adapte edilmiştir. Bu kinetik teşbit, kuyu başına sadece 20 μL toplam reaksiyon hacmine sahip 384 kuyulu bir mikroplaka formatında çalıştırılır. Platform hemen hemen tüm ADP üreten enzimler için geçerli olmalıdır.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

Proteinlerin hızlı fotokimyasal oksidasyonu proteinlerin yapısal karakterizasyonu için ortaya çıkan bir tekniktir. Farklı solvent katkı maddeleri ve ligandlar çeşitli hidroksil radikal atma özelliklerine sahiptir. Farklı koşullarda protein yapısını karşılaştırmak için reaksiyonda oluşan hidroksil radikallerinin gerçek zamanlı telafisi reaksiyon koşullarını normalleştirmek için gereklidir.

Protein Topografya Değişikliklerinin Belirlenmesinde Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonlarında Gerçek Zamanlı Telafinin Sağlanması

Bu protokol, Sandell-Kolthoff reaksiyonunu kullanarak insan karaciğer mikrozomlarındaki kimyasalların Deiodinaz 1 (DIO1) aktivitesi üzerindeki etkisini güvenilir şekilde değerlendirmek için kolorimetrik bir yöntemi tanımlar. Önceden tanımlanmış kabul kriterleri ve istatistiksel performans metriklerini içerir ve OECD test rehberlerine dahil edilmesi için devam eden çabaları destekler.

Sandell-Kolthoff Reaksiyonu Kullanılarak İnsan Karaciğer Mikrozomlarında Deiodinaz 1 Aktivitesinin Kolorimetrik Değerlendirmesi

Keşfedin insan serumunda enzim stabilitesini değerlendirme yöntemlerini, kanser tedavisinde protein biyolojiklerinin farmakokinetik profillerini ve terapötik etkinliğini artırmak için.

İnsan Adenozin Deaminaz 1 Enziminin Serum Stabilitesinin Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet