Name: Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Öğrenin fare dalak dokularından eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu için kolajenaz tip I sindirimi ve diferansiyel ultrasantrifüjasyon yöntemini. Bu teknik, hücre membran bütünlüğünü koruyarak yüksek kaliteli eksozom elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Örnekler, Guangdong Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından verilen etik onay ile farelerden elde edildi. Bu protokolde kullanılan malzeme, ekipman ve yazılımların ayrıntılı açıklamaları Malzeme Tablosunda verilmiştir. Ekstraksiyon öncesi preparatın detayları Şekil 1'de gösterilirken, Spleen-Exo ekstraksiyonu ve zenginleştirme işlemi Şekil 2'de açıklanmaktadır.
1. Hazırlık
<ol>
	<li>Yüksek hızlı ve ultra yüksek hızlı santrifüjleri 4 °C'ye önceden soğutun ve masaüstü çalkalayıcının sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Şekil 1A, B'de gösterildiği gibi hücre kültürü kapları (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100 mm), 50 mL steril santrifüj tüpleri, buz ve steril hücre süzgeci (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) hazırlayın.</li>
	<li>Makas ve forsepsleri u alkol spreyi kullanarak sterilize edin, ardından yüksek sıcaklıkta sterilizasyon yapın. Bu araçlar Şekil 1C'de gösterilmiştir.</li>
	<li>Dalak dokusunu buz üzerinde 100 mm'lik steril <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">bir Petri kabına yerleştirin ve yüzey kanını 1x buzlu steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Dalak dokularını steril gazlı bezle kurulayın ve kuruduktan sonra tartın. NOT: Doku donmuşsa, devam etmeden önce bir tabakta buz üzerinde 15 dakika çözdürün.</li>
	<li>Steril bir transfer pipeti kullanarak süzgecin içine 1 mL steril PBS bırakarak hücre süzgecini (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) nemlendirin.</li>
	<li>Sindirim tamponunu (% 0.1 tip I kollajenaz) bir girdap karıştırıcı ile 1x PBS kullanarak hazırlayın. NOT: Her 100 mg dalak dokusu için 10 mL sindirim tamponu kullanın. Bu çalışmada kollajenaz konsantrasyonu, ürün talimatlarına göre seçilmiştir. Diğer doku türleri için, araştırmacıların bu parametreleri doku yoğunluğuna ve bileşimine göre ayarlamaları gerekebilir. Her doku tipi için en uygun koşulları belirlemek için değişen konsantrasyonlarda ve sindirim sürelerinde ön deneyler yapılması önerilir.</li>
</ol>
2. Doku sindirimi
<ol>
	<li>Dokuyu buz üzerinde bir kültür kabında makasla düzgün küçük parçalar halinde kesin (Şekil 3A) ve steril bir transfer pipeti ile 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Yukarıda belirtildiği gibi dalak dokusu ağırlığına göre tüpe sindirim tamponu ekleyin (Şekil 3B), ardından tüpü 37 °C'de yatay bir çalkalayıcı üzerinde 45°'lik bir açıyla çalkalayın. Sindirim ilerlemesini izleyin ve doku parçaları dağıldığında ve çoğu şeklini kaybettiğinde sindirimi durdurun. Sindirim süresi dokular arasında farklılık göstermelidir. Bu çalışmadaki deney koşullarında sindirim süresi yaklaşık 30 dakikadır.</li>
	<li>Fibröz ve daha büyük doku kalıntılarını gidermek için sindirilmiş karışımı oda sıcaklığında (RT) bir hücre süzgecine (Ф70 μm) aktarın. NOT: Sindirimden hemen sonra filtrelemeyi tamamlayın.</li>
	<li>Süzüntüyü 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüpünde toplayın.</li>
</ol>
3. Diferansiyel santrifüjleme ile eksozom izolasyonu
<ol>
	<li>Santrifüj filtratları 500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca süzülür. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra artık hücreler, hücre kalıntıları ve çekirdekler içeren bir pelet görülebilir.</li>
	<li>Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyin. Şekil 3D'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra apoptotik cisimler ve mikrozomlar içeren bir pelet görülebilir.</li>
	<li>Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Pelet içeren mikro-parçacıklar ve plazma zarı, Şekil 3E'de gösterildiği gibi santrifüjlemeden sonra görülebilir.</li>
	<li>Elde edilen süpernatanı 4 ° C'de 2 saat boyunca 120.000 x g'da ultrasantrifüjleyin. Şekil 3F'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra tüpün dibinde bir pelet görülebilir.</li>
	<li>Süpernatanı atın, peleti PBS ile yıkayın ve eksozomları elde etmek için 4 ° C'de 2 saat boyunca 120.000 x g'da tekrar ultrasantrifüj edin. Şekil 3G'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra tüpün dibinde bir pelet görülebilir.</li>
	<li>İzole eksozomları steril PBS (dalak başına 200 μL) ile çözün ve izole edilen eksozomları -80 °C'de yeni bir 2 mL santrifüj tüpünde saklayın.</li>
</ol>
4. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile eksozom karakterizasyonu
NOT: Ekstrakte edilen Exo'nun vezikül özellikleri gösterip göstermediğini belirlemek için TEM kullanıldı. Elektron mikroskobu ile tanımlanan Exo numuneleri taze numuneler olmalı veya kısa bir süre için 4 °C'de kısa bir süre saklanmalıdır.
<ol>
	<li>Eksozomları (2-6 μg/μL) %2 elektron mikroskobu (EM) dereceli paraformaldehit ile RT'de 2 saat sabitleyin.</li>
	<li>Bakır bir ağ üzerine 10 μL eksozom solüsyonu yerleştirin, RT'de 10 dakika inkübe edin, steril damıtılmış su ile durulayın ve fazla sıvıyı emici kağıtla kurulayın.</li>
	<li>Bakır ağı 1 dakika boyunca %2 uranil asetat ile boyayın, fazla sıvıyı filtre kağıdı ile kurulayın ve 2 dakika akkor lamba altında kurutun.</li>
	<li>Hazırlanan numuneyi 80 kV'da bir transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemleyin.</li>
</ol>
5. Eksozomların boyut dağılımı ve partikül konsantrasyonu ölçümü
<ol>
	<li>Standart polistiren nanopartikülleri (250 nm) nano akış sitometresine yükleyin.</li>
	<li>Bir BCA protein test kiti kullanarak Exo numunelerinin protein konsantrasyonunu ölçün. BCA Protein Testi sonuçlarına göre Exo örneğini PBS ile seyreltin (eksozomları 1-10 ng/μL'ye seyreltin), ardından yan saçılma yoğunluğunu (SSI) ölçmek için Exo örneklerini nano akışa yükleyin.</li>
	<li>Standart polistiren nanopartiküllerdeki SSI'nin partikül konsantrasyonuna oranına göre Exo konsantrasyonunu hesaplayın. NOT: Boyut ölçümü için, gradyan boyutlarına (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) sahip standart silika nanopartiküllerin nano akış sitometresine yüklenmesiyle standart bir eğri oluşturulur. Exo numunesinin yüklenmesi bunu takip eder. Exo'nun boyut dağılımı standart kürlemeye göre hesaplandı.</li>
</ol>
6. Eksozom proteinlerinin lizis ve immünoblot doğrulaması
<ol>
	<li>Protein analizi için eksozom peletine 100 μL radyo immünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu ekleyin.</li>
	<li>Kuvvetlice girdap yapın, parafilm ile örtün, RT'de 20 dakika sallayın, sonra tekrar girdap yapın.</li>
	<li>Numuneyi toplamak için 30-60 saniye boyunca 1000 x g'da kısa bir süre santrifüjleyin, yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve analize kadar -20 °C ila -80 °C arasında saklayın.</li>
	<li>İmmünoblot için, 1x konsantrasyon elde etmek için numuneleri 5x yükleme tamponu ile karıştırın ve jel elektroforezi için hazırlanın.</li>
	<li>Tüm doku homojenat kontrolleri isteniyorsa, yukarıda detaylandırıldığı gibi dokuyu parçalamak için bir proteaz inhibitörü ile güçlü bir lizis tamponu kullanın. Ardından, numuneleri 10,000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve kalan hücre dışı matrisi, tüm hücreleri veya sağlam hücresel kalıntıları atın.</li>
	<li>Eksozom veya doku homojenatı içeren numune tamponunu 95 °C'de 5-10 dakika kaynatın. 'luk bir SDS-PAGE jele şerit başına eşit protein yükleyin. Kontrol olarak eşit doku homojenat proteini yükleyin.</li>
	<li>Konvansiyonel elektroforez tamponunu kullanarak yaklaşık 2 saat boyunca 80 V'luk bir voltaj altında jel elektroforezine devam edin. Saflaştırılmış lizatlardaki Exo protein ekspresyonunu doğrulamak için western blot analizi yapın ve fraksiyonlardaki nispi Exo bolluğunu karşılaştırın.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Murin Dalak Kaynaklı Eksozom İzolasyonu için Rafine Etme Teknikleri

<ol><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+systems+and+their+potential+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Front Mol Biosci. 7, 33(2020).</li>
<li>Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+extracellular+vesicles+in+oral+cancer%2C+from+transcriptomics+to+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics.</a> Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enrichment+method+for+small+extracellular+vesicles+derived+from+liver+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue.</a> J Vis Exp. (192), e64499(2023).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+and+particle+biomarkers+define+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers.</a> Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yiwei+decoction+promotes+apoptosis+of+gastric+cancer+cells+through+spleen-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes.</a> Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).</li>
<li>Useckaite, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+paired+human+liver+homogenate+and+tissue-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles.</a> Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Lai, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+processing+and+characterization+approaches+for+research+and+technology+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Exosome processing and characterization approaches for research and technology development.</a> Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Roh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+exosomes+alleviate+particulate+matter-induced+inflammatory+response+and+skin+barrier+damage+in+atopic+dermatitis-like+triple-cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model.</a> PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+methods+for+isolation+and+quantification+of+exosomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review.</a> Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).</li>
<li>Menu, E., Vanderkerken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+multiple+myeloma%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside.</a> Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lysate%2Ftissue+storage+at+-80+degrees+C+on+subsequently+extracted+EVs+of+epithelial+ovarian+cancer+tissue+origins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins.</a> iScience. 26 (4), 106521(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>70 ve mikro; m Hücre Süzgeci</td><td>Biologix Group Co., Ltd.ABD</td><td>15-1070</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD9 antikoru</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojisi, Inc (CST), ABD</td><td>983275</td><td></td></tr><tr><td>Anti GM130 antikoru</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>66662-1-lg</td><td></td></tr><tr><td>Anti TSG101 antikoru</td><td>Abcam Plc, İngiltere</td><td>125011</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Kabı</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Çin</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Çin</td><td>788211</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip I</td><td>Sigma-Aldrich Corp., ABD</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Termostatik Çalkalayıcı</td><td>Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., Çin</td><td>THZ-100</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez tamponu</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Çin&nbsp;</td><td>G2081-1L</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş BCA Protein Test Kiti</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Çin&nbsp;</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Akış NanoAnalizörü</td><td>NanoFCM Inc., Çin</td><td>N30E</td><td></td></tr><tr><td>Floresan / Kemilüminesans görüntüleme sistemi&nbsp;</td><td>Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Çin</td><td>GelView 6000Plus</td><td></td></tr><tr><td>HRP Keçi anti-Fare IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>15014</td><td></td></tr><tr><td>HRP Keçi anti-Tavşan IgG Proteintech</td><td>Group, Inc.China&nbsp;</td><td>15015</td><td></td></tr><tr><td>mikroplaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar, ABD</td><td>CMax Plus</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Şangay&nbsp; Tıbbi&nbsp; Aletler (grup) &nbsp; Co., Ltd., Çin</td><td>WA1010</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobik cımbız</td><td>Şangay & nbsp; Tıbbi&nbsp; Aletler (grup) &nbsp; Co., Ltd., Çin</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge X1R Pro santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific, ABD</td><td>75009750</td><td></td></tr><tr><td>Oftalmik makas</td><td>Şangay&nbsp; Tıbbi&nbsp; Aletler (grup)&nbsp;Co., Ltd.,Çin</td><td>Y00030</td><td></td></tr><tr><td>Oftalmik cımbız</td><td>Şangay&nbsp; Tıbbi&nbsp; Aletler (Grup)&nbsp;Co., Ltd., Çin&nbsp;</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-100 Ultrafiltrasyon santrifüjü</td><td>Beckman Coulter, ABD</td><td>A94469</td><td></td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Çin</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lizis tamponu (güçlü, inhibitörsüz)</td> <td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Çin&nbsp;</td><td>P0013K</td><td></td></tr><tr><td>Cetvel</td><td>Şarküteri&nbsp; İmalat&nbsp; Şirket, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Numune Yükleme Tamponu, 5x</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Çin&nbsp;</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipeti</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>30-0238A1</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon Elektron Mikroskobu</td><td>Hitachi, Japonya</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpü</td><td>Beckman Coulter, ABD</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Batı Transfer Tamponu&nbsp;</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Çin&nbsp;</td><td>G2028-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

fare dalak dokularından elde edilen eksozomların İzolasyonu ve karakterizasyonu

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Dalak kaynaklı eksozomların izolasyonu ve saflaştırılması Eksozomları fare dalak dokusundan izole etmek için, kollajenaz sindirimi ve diferansiyel ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullandık (Şekil 2). İlk adımlar, yüzey kanını çıkarmak için dalak dokusunun ön işlemden geçirilmesini ve ardından Tip I kollajenaz ile sindirimi içeriyordu. Bu enzimatik işlem, hücre dışı matris bileşenlerinin parçalanmasını kolaylaştırdı, böylece bütünlüklerini korurken eksozomları serbest bıraktı. Sindirim sonrası, hücresel kalıntıları, apoptotik cisimleri ve daha büyük vezikülleri sırayla çıkarmak için bir dizi santrifüjleme aşaması kullanıldı ve eksozomları peletlemek için süpernatantın 120.000 x g'da ultrasantrifüjlenmesiyle sonuçlandı. Sonraki izolasyon prosedürleri, Şekil 3G'de gösterildiği gibi, dalak türevi Exo ile zenginleştirilmiş PBS'de çözünür peletler verdi.
TEM sonuçları İzole edilen eksozomların morfolojisi, eksozomların karakterizasyonunu incelemek için altın standart bir yöntem olan transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak incelendi. TEM, eksozomların varlığını doğrulamak, eksozomların kalitesini değerlendirmek ve eksozomların morfolojisini gözlemlemek için yaygın olarak kullanılır. TEM görüntüleri (Şekil 4A), eksozomların karakteristiği olan fincan şeklindeki veziküllerin varlığını ortaya çıkardı. Bu veziküller, eksozomların dalak dokusundan başarılı bir şekilde izole edildiğini doğrulayan berrak bir lipid çift katmanlı yapı sergiledi.
Dalak-Exo'nun boyut dağılımı Eksozomların boyut, dağılım ve konsantrasyonu bir nano akış sitometresi kullanılarak belirlendi. Sonuçlar (Şekil 4B), izole edilen eksozomların çapının 30-150 nm arasında değiştiğini ve tepe konsantrasyonunun yaklaşık 60 nm olduğunu göstermiştir. İzole edilmiş parçacıkların çapı baskın olarak 50-80 nm arasındaydı ve ortalama parçacık konsantrasyonu 4.6 x 109 parçacık / mL'dir. Bu boyut aralığı, eksozomların daha önce bildirilen özellikleriyle tutarlıdır ve izolasyon protokolünü daha da doğrular.
Batı lekesi analizi Ekzozomal belirteçlerin varlığını doğrulamak için bir western blot analizi yaptık. Spleen-Exo örneklerinde ekzozomal belirteçler TSG101 ve CD9 tespit edilirken, negatif kontrol olarak kullanılan bir Golgi matris proteini olan GM130 tespit edilmedi (Şekil 4C). Karşılaştırıldığında, bu belirteçlerin proteini fare dalak dokularında (Dalak-T) eksprese edildi. Bu, hücresel kirleticilerden yoksun oldukları için izole edilen eksozomların yüksek saflığını gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig01.jpg"> 
Şekil 1: Tedarik hazırlığı. (A) 50 mL'lik santrifüj tüpleri, kültür kapları, buz ve cerrahi aletler bir biyogüvenlik kabinine yerleştirildi. (B) Steril bir hücre süzgeci (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm). (C) Sterilize edilmiş cerrahi aletler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig02.jpg"> 
Şekil 2: Dalak-Exo izolasyon prosedürü. Dalak dokusunu hazırlayın ve buzlu PBS'de küçük parçalar halinde kesin, ardından Tip I kollajenaz ile sindirim ve belirtildiği gibi santrifüjleme yapın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig03.jpg"> 
Şekil 3: Dalak-Exo izolasyonunun temsili görüntüleri. (A) Sonraki sindirim için hazır küçük dalak blokları. (B) Sindirim tamponu ile dalak dokusu blokları. (C) 500 x g santrifüjlemeden sonra peletler. (D) 3.000 x g santrifüjlemeden sonra peletler. (E) 10.000 x g santrifüjlemeden sonra peletler. (F) 120.000 x g santrifüjlemeden sonra peletler. (G) 120.000 x g santrifüjlemeden sonra eksozom peletleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig04.jpg"> 
Şekil 4: Dalak-Exo'nun tanımlanması. (A) İzole edilmiş parçacıkları fincan şeklinde morfolojiye sahip yuvarlak veya oval zarlı veziküller olarak gösteren TEM sonuçları. Ölçek çubuğu = sırasıyla 200 nm ve 50 nm. (B) Flow Nano Analizörü ile yapılan boyut dağılımı analizi, Spleen-Exo'nun çapının baskın olarak 50 nm ila 80 nm arasında değiştiğini ve ortalama partikül konsantrasyonunun 4.6 × 109 partikül / mL olduğunu gösterdi. (C) GM130'un negatif ekspresyonu ile Dalak-Exo'da eksozoma özgü belirteç proteinlerinin (TSG101 ve CD9) ekspresyonunu gösteren Western blot analizi. Bu belirteçler, fare dalaklarından (Dalak-T grubu) ekstrakte edilen protein örneklerinde tespit edilebilirdi. Temsili western blot görüntüleri gösterildi (n = 6 doku). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

isolation-characterization-exosomes-derived-from-mouse-spleen

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video gentleMACS Dissociator kullanarak fare dalak tek hücre süspansiyonları hazırlamak için otomatik doku ayrılma için basit, zaman tasarrufu sağlayan bir teknik açıklar.

Fare Dalak gentleMACS Dissociator Tek Hücreli Cezalar hazırlanması

Bu kağıt, izolasyon, saflaştırma ve exosomes tespiti, moleküler içerik analizi teknikleri gibi yöntemleri gösteriyor. Bu yöntemler, hücre kültürü medya ve biyolojik sıvılarda exosome izolasyonu için uyarlanabilir ve moleküler içerik analizi ötesinde işlevsel çalışmalarda da yararlı olabilir.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu yazıda, fare ikamet akciğer mezenkimal kök hücreler (akciğer MSC), genişleme, karakterizasyonu ve immünomodülatör özellikleri analiz izolasyonu göstermektedir.

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA'lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.

Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) partiküllerinden eksozomları ayırmak için bir gradyan prosedürünü tanımlayan teknikler açıklanmıştır. Bu prosedür, HIV ile enfekte olmuş bireylerden insan plazmasındaki HIV partiküllerinden eksozomları izole etmek için kullanıldı. İzole edilen eksozomlar sitokin / kemokin içeriği açısından analiz edildi.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Safra sıvısı, potansiyel olarak önemli biyobelirteçler içeren hücre dışı veziküller/eksozomlar için değerli bir kaynaktır. Bu protokol, miRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmek için sağlam bir yöntemi temsil eder.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Burada, manyetik hücre sıralama ve içine saf fareler sonraki evlat edinen transfer tarafından fare dalağı dendritik hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yüksek tuz aktif dendritik hücre modeli evlat edinen transfer ve Akış Sitometresi adım adım yordamlar açıklamak için seçildi.

Yalıtım ve yüksek tuz evlat edinen Transfer dendritik hücreler antijen sunan tedavi

Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Bu çalışmada akım sitometrisi ve izole perfüze edilmiş farelerin beyin koroid pleksusları üzerinde iki farklı geçit stratejisi kullanılmaktadır; Bu protokol, bu beyin yapısını dolduran ana bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlar.

Mikro Disseke Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Öğrenin fare dalak dokularından eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu için kolajenaz tip I sindirimi ve diferansiyel ultrasantrifüjasyon yöntemini. Bu teknik, hücre membran bütünlüğünü koruyarak yüksek kaliteli eksozom elde edilmesini sağlar.

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet