Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu
20 Eylül 2024
Burada, kollajenaz tip I ile sindirim ve ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullanarak fare dalağından türetilmiş eksozomları izole etmek için bir protokol sunuyoruz.
Doku kaynaklı eksozomlar, doku özgüllüğünü ve mikro çevreyi doğru bir şekilde yansıtma yetenekleri nedeniyle artan ilgi görmüştür. Araştırmamız, kardiyovasküler hastalıklarda dalak kaynaklı eksozomların temel ve translasyonel rollerini anlamaya odaklandı. Bu çalışmada, farelerin dalak dokularından eksozomları izole etmek için pratik bir protokol geliştiriyoruz ve daha sonraki tanımlama analizi ve fonksiyonel çalışmalar için tekrarlanabilir bir teknik sağlıyoruz.
Sindirim için bir Tip I kollajenaz kullanıyoruz, ardından yüksek kaliteli dalak eksozomu elde etmek için diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla filtrasyon yapıyoruz. Önceki raporların aksine, doku süspansiyonu elde etmek için doku homojenizasyonunu kullanarak, yaklaşımımız dokulardaki hücrelerin zar bütünlüğünü korur. Bu teknik, eksozomun bağışıklık tepkilerindeki rolünü incelemede özellikle yararlı olabilir.
Dalağın bağışıklık sistemindeki kritik işlevi göz önüne alındığında, gelecekteki çalışmalar bu protokolü insan dokularına uyarlayabilir ve tanı ve tedavi amaçlı klinik olarak ilgili eksozomun çıkarılmasını sağlayabilir. Başlamak için, yüksek hızlı ve ultra yüksek hızlı santrifüjleri dört santigrat dereceye önceden soğutun ve masaüstü çalkalayıcının sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. 100 milimetre çapında hücre kültürü kaplarını hazırlayın.
Ardından, 50 mililitre steril santrifüj tüpleri, buz ve 70 mikrometre çapında steril hücre süzgeçleri düzenleyin. Makası ve forsepsleri sterilize etmek için %75 alkol püskürtün ve daha fazla sterilize etmek için yüksek sıcaklıkta ısıtın. Daha sonra dalak dokusunu buz üzerinde steril 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve yüzeydeki kanı soğuk 1X PBS ile yıkayın.
Dokuları tartmadan önce dalağı steril gazlı bezle iyice kurulayın. Daha sonra, steril bir transfer pipeti kullanarak, nemlendirmek için 70 mikrometrelik bir hücre süzgecine bir mililitre PBS ekleyin. Son olarak, sindirim tamponunu elde etmek için bir girdap karıştırıcı ile 1X PBS'de% 0.1 Tip I kollajenaz hazırlayın.
Başlamak için, doku işleme için reaktifleri ve steril araçları hazırlayın. Makasla, dalak dokusunu buz üzerinde bir kültür kabında küçük, düzgün parçalar halinde kesin ve steril bir transfer pipeti kullanarak 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, dalak dokusunun ağırlığına bağlı olarak sindirim tamponunu tüpe ekleyin ve tüpü 37 santigrat dereceye ayarlanmış yatay bir çalkalayıcı üzerinde 45 derecelik bir açıyla sallayın.
Doku parçaları dağıldığında ve parçaların çoğu şeklini kaybettiğinde sindirimi durdurun. Fibröz ve daha büyük doku kalıntılarını gidermek için sindirilmiş karışımı oda sıcaklığında 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Süzüntüyü 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpünde toplayın.
Süzüntüyü 500 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve santrifüjleme adımını uygun hızlarda tekrarlayın. Ultrasantrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve peleti PBS ile yıkayın.
Eksozomları izole etmek için dört santigrat derecede iki saat boyunca 120.000 G'de tekrar ultrasantrifüj edin. Son olarak, izole edilen eksozomları dalak başına 200 mikrolitre steril PBS'de çözün ve eksi 80 santigrat derecede iki mililitrelik bir santrifüj tüpünde saklayın. Transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri, eksozomların karakteristiği olan bir lipid çift tabakasına sahip fincan şeklindeki veziküllerin varlığını ortaya çıkardı.
Eksozom boyutları, boyut dağılım grafiğinde gösterildiği gibi 60 nanometrede tepe konsantrasyonu ile 30 ila 150 nanometre arasında değişmektedir. Western blot analizi, ekzozomal belirteçler TSG101 ve CD9'un varlığını doğrularken, GM130 ve negatif kontrol tespit edilmedi.
Genel Bakış
Bu çalışma, kardiyovasküler hastalıklardaki rollerini anlamak için kritik olan fare dalağı dokusundan eksozomları izole etmek için pratik bir protokol sunmaktadır. Yöntem, hücre zarı bütünlüğünü korurken yüksek kaliteli eksozom verimi sağlamak için tip I kolagenaz sindirimini ultrasantrifüjleme ile birleştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Kardiyovasküler Araştırma
Arka Plan
- Dokudan elde edilen eksozomlar, doku özgüllüğünü ve mikroçevreyi yansıtır.
- Dalaktan elde edilen eksozomlar bağışıklık tepkilerinde rol oynar.
- Eksozom fonksiyonunu anlamak, kardiyovasküler hastalık araştırmaları için hayati önem taşır.
- Önceki yöntemler zar bütünlüğünü tehlikeye atabilir.
Çalışmanın Amacı
- Dalaktan elde edilen eksozomları izole etmek için tekrarlanabilir bir protokol geliştirmek.
- Sonraki tanımlama analizini ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak.
- Kardiyovasküler hastalıktaki eksozom rolleri hakkındaki anlamayı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Tip I kolagenaz kullanarak dalağın sindirimi.
- Diferansiyel ultrasantrifüjleme ile filtrasyon.
- Yüksek kaliteli eksozomların izolasyonu.
- Süreç boyunca hücre zarı bütünlüğünün korunması.
Ana Sonuçlar
- Dalaktan elde edilen eksozomların başarılı izolasyonu.
- Daha fazla analiz için uygun yüksek kaliteli eksozomlar.
- Yöntem, zar bütünlüğünün korunmasında iyileştirilmiş gösterdiğini kanıtlamaktadır.
- Bağışıklık tepkilerini incelemede potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş protokol, fare dalağından eksozomları izole etmek için etkilidir.
- Bu teknik, kardiyovasküler hastalıktaki eksozom fonksiyonları üzerindeki araştırmaları geliştirebilir.
- Gelecek çalışmaları, bu yöntemi immünoloji alanında çeşitli uygulamalar için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of spleen-derived exosomes enables mechanistic de-risking and target validation in immune and cardiovascular disease research. This protocol supports predictive confidence by preserving exosome integrity and ensuring reproducibility across discovery and translational workflows. The method positions tissue-specific exosome analysis as a reusable capability for biomarker and functional studies in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of exosome-mediated signaling pathways in disease-relevant immune tissues.
- Supports biological de-risking by providing tissue-specific extracellular vesicle profiles.
- Facilitates functional target validation through reproducible exosome isolation and marker confirmation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated exosome samples for downstream quantitative and qualitative assays.
- Standardizes exosome isolation for reproducible biomarker and mechanistic screening.
- Enables scalable workflows for comparative analysis of exosome populations across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns exosome characterization with disease-relevant immune and cardiovascular models.
- Supports translational biomarker discovery by reflecting tissue microenvironment and specificity.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation of exosome-based hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust exosome isolation for hypothesis testing, biomarker identification, and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on exosome-mediated intercellular communication and immune modulation.
- Screening: Delivers reproducible, marker-validated exosome preparations for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative size distribution and marker expression data for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling tissue-specific exosome studies relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol adaptable to other tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in exosome research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable exosome isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biomarker and mechanistic studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of exosome-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue processing, ultracentrifugation, and exosome analytics.
- Needs access to high-speed and ultra-high-speed centrifuges, electron microscopy, and western blot infrastructure.
- Demands cross-team standardization of tissue handling and analytical protocols.
- Adaptation to other tissues may require optimization of digestion and isolation parameters.
- Yield and purity depend on tissue quality and precise execution of protocol steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Preparation of Equipment and Reagents for Spleen Tissue-Derived Exosome Isolation for Functional Analysis
3:00
Efficient Isolation of Exosomes from Mouse Spleen Using Collagenase Digestion for Biomarker Studies
4:50
Representative Results
