Name: Ex Vivo Modelde Doku Mineralizasyonunun Kapsamlı Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Keşfedin, doku mineralizasyonunun kapsamlı karakterizasyonu için ex vivo model kullanarak kemik rejenerasyonunu değerlendirme yöntemlerini. Mikro-CT, nano indentasyon ve Raman spektroskopisi ile yeni kemik oluşumunun kalitesini analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, bir etik ve hayvan refahı komitesi ve Fransız Ulusal Veterinerlik ve Gıda İdaresi tarafından G44171 numarası ile onaylanmıştır.
1. Osteokondral eksplantların hazırlanması ve kültürü
<ol><li>Aseptik bir ortamda taze ötenazi yapılmış hayvanlardan koyun eklem örneklerini hasat edin. Koyunları sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve sol arka bacağını tıraş edin. Diz eklemi çevresini alkolle dezenfekte ederek hazırlanın. Ön ve arka çapraz bağları ortaya çıkarmak için lateral parapatellar artrotomi kullanın, ardından femoral trokleayı ortaya çıkarmak için patellar çıkık yapın.<ol><li>Doku alımını takiben, osteokondral otogreft transfer sistemi kullanılarak lateral kondilde 4.75 mm çapında bir defekt oluşturun.</li>
	</ol></li>
	<li>Ortopedik bir çekiç kullanarak, 10 mm derinliğinde bir kusur oluşturun ve eksplantı kondilden alın. Daha sonra, bir osteokondral otogreft transfer sistemi kullanarak, birincinin etrafında ortalanmış, 8 mm çapında ikinci bir kusur gerçekleştirin. Bu, 4.75 mm x 10.0 mm'lik bir merkezi defekt içeren 8 mm x 10 mm ölçülerinde osteokondral eksplantlar verir.</li>
	<li>Lojistik nedenlerle gerekirse, eksplantları %1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (hBSS) içinde taşıyın ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Eksplantları 3x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile durulayın, ardından 4.75 mm x 10.0 mm'lik kusuru 40 μg/mL BMP2 ile desteklenmiş bir kalsiyum fosfat çimentosu ile enjekte edin. Çimentoyu aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.<ol><li>Apatitik trikalsiyum fosfat çubuklarının (120 MPa'da izostatik pres) 1364 °C'de en az 12 saat süreyle ısıl işlemle α-trikalsiyum fosfat (α12-TCP) üretin ve ardından havayla söndürme 14.</li>
		<li>13,1 ± 1,7 μm'lik ince bir toz elde etmek için α-TCP çubuklarını bir planet değirmen bilyesi ile 2x bir planet değirmen bilyesi ile 500 rpm'de 5 dakika boyunca öğütün (daha önce açıklandığı gibi lazer kırınım kullanılarak ölçülmüştür14).</li>
		<li>α-TCP tozunu 180 °C'de 45 dakika kuru ısıtarak sterilize edin. Kalsiyum fosfat çimentosunu α-TCP tozunu %2,5 (a/a)Na2HPO4 0,22 μm filtrelenmiş çözelti (sıvı/toz oranı 0,35) ile 1 dakika karıştırarak hazırlayın.</li>
		<li>Çimento macununu enjeksiyondan önce 18 G'lik bir iğne kullanarak 3 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika sonra, eksplantları 25 cm²'lik bir şişeye aktarın ve nazikçe fetal sığır serumu ve penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) yüksek glikozundan oluşan 10 mL tam kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>Eksplantları %5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde 28 güne kadar koruyun ve laminer akış başlığı altında her 2 günde bir tüm kültür ortamını değiştirin.</li>
	<li>Eksplantları 3x PBS ile durulayın. Bunları 50 mL'lik tüplere aktarın, 20 mL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve 3 gün boyunca 4 °C'de tutun. Daha sonra, eksplantları PBS ile durulayın ve sonraki analizlerden önce% 70 etanol içinde saklayın.</li>
</ol>2. Mikro-CT analizi
<ol><li>Mikro-CT X-ışını kullanarak mikro-tomografi analizleri yapın. 1200 ms pozlama süresi ve 1 mm alüminyum filtre (80 kV ve 125 μA) ile 10,7 μm çözünürlükte X-ışını projeksiyonları elde edin. Sinyal-gürültü oranını artırmak için her 0,45° dönüş artışı için ortalama üç görüntü.</li>
	<li>Üç boyutlu (3B) görüntüleri, bir referans taraması ile bir X/Y hizalamasından sonra üreticinin yeniden yapılandırma yazılımını kullanarak aşağıdaki parametrelerle yeniden oluşturun - Yumuşatma: 0, Halka Artefakt: 3, Işın Sertleştirme: 5. Görüntü işleme yazılımı ile görüntü yığınlarını temizleyin ve iki boyutlu (2D) ve 3D görselleştirme araçlarıyla gözlemleyin.</li>
</ol>3. Derin öğrenme görüntü analizleri
<ol><li>Özel özel yazılım kullanarak görüntü segmentasyonu gerçekleştirin. Kemik ve çimento ayrımı için derin bir öğrenme modeli eğitmek üzere entegre segmentasyon Sihirbazı'nı kullanın.</li>
	<li>Yeniden yapılandırılmış mikro-BT görüntülerinden kemik, çimento ve arka plan içeren temsili bir bölge (yani çerçeve) seçin. Bu ilk kareyi, yazılım tarafından sağlanan basit (örn. eşik) veya güçlü araçları (örn. yayılma) kullanarak manuel olarak bölümlere ayırın.</li>
	<li>Model sekmesinde bir derin öğrenme modeli oluşturun ve açılır menüden 3D-UNET Rutini'ni seçin. Oluşturulan modele sağ tıklayarak analiz edilecek görüntülerle birlikte deneysel parametrelerini tanımlayın; burada: 5 derinlik, yama boyutu 32 x 32, Adadetla algoritması, 0.25 adım oranı, veri büyütme x10.</li>
	<li>Hızlı ve doğru görüntü segmentasyon yetenekleriyle ilgili olduğu kabul edilen derin öğrenme rutinini eğitmek için bölümlere ayrılmış çerçeveyi kullanın (Eğit Düğmesine tıklayın) 3,15. Eğitim tamamlandıktan sonra, ikinci bir çalışma alanı (çerçeve) tanımlayın ve tahmin fonksiyonunu kullanarak otomatik olarak segmentlere ayırın.<ol><li>Daha doğru eğitim verileri oluşturmak için gerekirse manuel düzeltme uygulayın. Rutini bir kez daha eğitin. Tatmin edici bir sonuç elde edilene kadar işlemi tekrarlayın; Eğitim çerçevelerinin sayısı arttıkça veri büyütme sayısı giderek azalır. NOT: Model eğitimi sırasında sağlanan DICE indeksi, modelin doğruluğunun bir göstergesini verir (girdi bilgilerine kıyasla) ancak yeterli değildir. Modelin uygunluğunun doğrulanması, otomatik olarak bölümlere ayrılan verilerin 3 bağımsız deneyimli araştırmacı tarafından doğrulanmasıyla gerçekleştirilmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Dışa Aktar düğmesine tıklayarak modeli yayınlayın ve Dışa Aktarılan Modeli Segmentlere Ayır &gt;&gt; Tam Veri Kümesini Segmentlere Ayır'a tıklayarak tüm mikro -CT veri setine uygulayın.</li>
</ol>4. Gömme
<ol><li>Kemik eksplantlarını, p aseton ve 0 ksilenden oluşan 25 mL dehidrasyon solüsyonu içeren 40 mL'lik bir cam şişeye yerleştirerek kurutun. Cam şişeyi RT'de 1 saat boyunca dönen bir tekerleğe yerleştirin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Dehidrasyon solüsyonunu 25 mL ksilen ile değiştirin ve cam şişeyi RT'de 1 saat boyunca dönen tekerleğe yerleştirin.</li>
	<li>Ksilen çözeltisini benzoil peroksit (BPO) ve dibutil ftalat (DBP) ile zenginleştirilmiş 25 mL metilmetakrilat (MMA) ile değiştirin. RT'de 1 saat boyunca dönen tekerleğin üzerine yerleştirin. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.</li>
	<li>MMA çözeltisini% 10 BPO,% 10 DBP ile zenginleştirilmiş 25 mL MMA ve% 450 μL N, propan-2-ol içinde 1: 20 oranında seyreltilmiş N dimetilanilin ile değiştirin. Cam şişeyi gece boyunca -20 °C'ye yerleştirin. Çözelti sarımsı hale gelir.</li>
	<li>Eksplantı orta büyüklükte bir gömme kalıbına yerleştirin ve MMA-BPO-DBP-N, N anilin'i kalıba dökün. Kalıbı plastik bir kutuya yerleştirin ve 5 dakika boyunca nitrojen akışı ile havalandırın. Kutuyu hava geçirmez şekilde kapatın ve MMA polimerizasyonu ve sertleşmesi için 48 saat boyunca 4 ° C'ye yerleştirin.</li>
	<li>Eksplant içeren reçineyi kalıptan çıkarın ve sonraki analiz için işlenene kadar 4 °C'de tutun.</li>
</ol>5. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) - kantitatif geri saçılmış elektron görüntüleme (qBEI)
<ol><li>Eksplant içeren pMMA bloğunu uzun ekseni boyunca bir elmas testere ile kesin. Histolojik analiz için bloğun ilk yarısını saklayın. 1,5 mm kalınlığında bir bölüm oluşturmak için diğer yarısını daha fazla kesin. Kesimi 3000 rpm'de 3 mm/dak hızla gerçekleştirin.</li>
	<li>Bölümü, daha düşük tane boyutuna karşılık gelen artan sayılara sahip silisyum karbür kağıtla öğütün: 10 sn için SiC 320, 15 sn için SiC 1000, 30 sn için SiC 2000 ve 30 sn için SiC 4000.</li>
	<li>Bölümü elmas macunu ve özel giysilerle cilalayın: 3 μm Mol B3 elmas solüsyonu ile 1 dakika parlatma bezi ve 1 μm Nap B1 elmas solüsyonu ile 1 dakika polar kumaş.</li>
	<li>Bölümü çift damıtılmış su altında durulayın ve elmas parçacıklarını bir pamuklu çubukla temizleyin. Bölümü nitrojen gazı altında kurutun.</li>
	<li>Kalın bölümü (10 nm karbon film kalınlığı) karbonla kaplayın ve gümüş boyalı bir alüminyum saplama üzerine monte edin. Elektron yükünün toprağa tahliyesini sağlamak için bölüm üstü ile saplama arasında gümüş bir boya köprüsü yapın.</li>
	<li>Saplamayı SEM aşamasına yerleştirin. Numunenin yanında, SEM odasına karbon, alüminyum ve silikon standartlarına sahip bir Faraday kabından oluşan bir kontrol saplaması yerleştirin. Bu, elektron demetini kalibre etmek ve gri seviyeleri Ca'nın yüzdelerine dönüştürmek için kullanılacaktır. SEM odasını kapatın ve vakumlayın.</li>
	<li>Elektron ışınını açın ve SEM parametrelerini geri saçılmış elektron modunda çalışacak şekilde ayarlayın. Geri saçılmış görüntülerde, karbon standardının gri seviyesi 25, alüminyum standardı 225 ve silikon standardı 253'tür. Bir gösterge olarak, kullanılan sistemde SEM parametreleri hızlanma voltajı 20 keV, Faraday kabı ile ölçülen prob akımı: 250 pA, çalışma mesafesi: 15 mm, diyafram: 30 μm, görüntü çözünürlüğü: 1024 x 768 piksel, vakum: &lt; 4.10-4 Pa, 100 μs/piksel bekleme süresi, parlaklık ~38 ve kontrast ~72.</li>
	<li>SEM standartlarla kalibre edildiğinde, geri saçılan elektron modunda numunenin görüntülerini elde edin.</li>
	<li>Roschger ve ark.16'da açıklandığı gibi, gri seviyeleri kalsiyum içeriğine dönüştürmek için numunenin geri saçılmış elektron görüntüsünü kullanın. Bunu herhangi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Kalsiyum içeriğinin dağılımını çizin. Kalsiyum içerik dağılımı bir Gauss dağılımı gösterir. İlgilenilen üç ana parametre hesaplanır: Görüntüdeki ortalama kalsiyum içeriği olarak Caortalaması, görüntüde en sık karşılaşılan kalsiyum konsantrasyonu olarak Cazirvesi ve kalsiyum içeriği dağılımının maksimumunun yarısında tam genişlik olarak Cagenişliği . NOT: qBEi'nin tekrarlanabilirliği, aynı ilgi bölgesinin art arda 5 gün boyunca (günde bir edinim) görüntülenmesiyle araştırılmıştır. Bu, elektron demetinin seanslar arasında açılıp kapatıldığı anlamına gelir. Caortalaması, Cazirvesi ve Cawidth hata yüzdesi sırasıyla %0.5, %0.7 ve %1.2 olarak tahmin edildi. Kalsiyum içeriği ayrıca Enerji dağıtıcı X-ışını analizi (EDS) ile araştırılmıştır. Roschger ve ark. daha önce17 tarafından elde edilen verilere benzer şekilde, EDS tarafından tahmin edilen R² değeri 0.99 olan Caortalaması ile kalsiyum içeriği arasında çok iyi bir doğrusal ilişki kurulmuştur.</li>
</ol>6. Histoloji
<ol><li>Her numune için, tungsten bıçaklı 7 sert doku mikrotomu kullanarak 18,19 μm'lik kesitler kesin. Otomatik boyama sistemi kullanarak bölümleri Goldner trikrom, HES ve MOVAT boyası ile boyayın.</li>
	<li>Deplastifikasyon için, numuneleri art arda asetonda 5 dakika bekletin ve 2 kez tekrarlayın. Numuneleri damıtılmış suda 5 dakika durulayın ve 2 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Goldner Trikrom renklendirmesini aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.<ol><li>Örnekleri 20 dakika boyunca Weigert ferrik hematoksilen içine yerleştirin. Musluk suyu ile yıkayın. Numuneleri 30 s-1 dakika boyunca %0,5 asit alkole daldırın. 20 dakika musluk suyu ile yıkayın.</li>
		<li>Numuneleri 5 dakika boyunca Ponceau/fuksin asit/azofloksin çözeltisine yerleştirin. 1 dakika boyunca% 1 asetik aside daldırın.</li>
		<li>Fosfomolibdik asit / Turuncu G çözeltisi ile 20 dakika boyayın. 1 dakika boyunca% 1 asetik aside daldırın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 15 dakika veya 60 ° C'de 8 dakika hızlı yeşil çözelti ile boyayın. Musluk suyuyla iyice durulayın; 3x tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Movat Pentachrome renklendirme işlemini aşağıda anlatıldığı gibi gerçekleştirin.<ol><li>Alcian Blue boyama: numuneleri 30 dakika boyunca Alcian Blue solüsyonuna daldırın. Numuneleri musluk suyunda 5 dakika durulayın. Numuneleri 60 dakika boyunca alkali etanol içine yerleştirin. Numuneleri musluk suyunda 10 dakika durulayın. Damıtılmış su ile son bir durulama yapın.</li>
		<li>Weigert Hematoksilen boyama: Örnekleri 20-30 dakika boyunca Weigert Ferric Hematoxylin'e yerleştirin. Numuneleri musluk suyunda 15 dakika durulayın. Damıtılmış su ile tekrar durulayın.</li>
		<li>Crocein Brilliant/fuksin asit ile boyama: numuneleri 10 dakika boyunca bir Crocein Brilliant/Acid Fuchsin çözeltisine daldırın. % 0,5 asetik asit ile durulayın. Numuneleri 20 dakika boyunca %5'lik bir fosfotungstik asit çözeltisine daldırın. % 0,5 asetik asit ile 2 dakika durulayın. 0 etanol ile her biri 5 dakika süren üç ardışık durulama gerçekleştirin.</li>
		<li>Safran du Gatinais ile boyama: numuneleri 15 dakika boyunca Safran du Gatinais'e yerleştirin. Musluk suyuyla son bir durulama yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>HES renklendirmesini aşağıda anlatıldığı gibi gerçekleştirin.<ol><li>Weigert Hematoksilen ile boyama: Örnekleri 30 dakika boyunca Weigert Hematoksilin'e batırın. Musluk suyu ile 2 dakika durulayın.</li>
		<li>Renk giderme: numuneleri 10 saniye boyunca hidroklorik asit alkole batırın. Musluk suyu ile 2 dakika durulayın.</li>
		<li>Nötralizasyon: numuneleri 1 dakika boyunca bir lityum karbonat çözeltisine daldırın. Musluk suyu ile 2 dakika durulayın. 1 dakika boyunca damıtılmış su ile son bir durulama yapın.</li>
		<li>Eozin-Eritrosin ile boyama: numuneleri 3 dakika boyunca bir Eozin-Eritrosin çözeltisine yerleştirin. Musluk suyu ile 10 saniye durulayın.</li>
		<li><li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li></li><li><li></li><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li></li></ol><ol><li><li><li> </li><li><li><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67235/67235eq01.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67235/67235eq02.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67235/67235eq03.jpg" style="margin: auto;"></li><li> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67235/67235eq04.jpg" style="margin: auto;"></li><li> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67235/67235eq05.jpg" style="margin: auto;"></li><li></li><li> </li></ol></li></ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Eksplant Modelleri Kullanılarak Kemik Oluşumunun Multimodal Analizi

<ol><li>Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+bone+grafts+and+substitutes%3A+A+review+of+recent+advancements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Adv%22%5BJournal%5D)">Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications.</a> Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP2+activity%2C+although+dispensable+for+bone+formation%2C+is+required+for+the+initiation+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing.</a> Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).</li>
<li>Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boneremodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Boneremodeling.</a> Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).</li>
<li>Boivin, G., Meunier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+mineralization+of+bone+tissue+measured+by+computerized+quantitative+contact+microradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tiss+Int%22%5BJournal%5D)">The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography.</a> Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).</li>
<li>Boivin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+remodeling+on+the+mineralization+of+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporo+Int%22%5BJournal%5D)">Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue.</a> Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).</li>
<li>Zanghellini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+and+comparison+of+stoichiometric+and+structural+characteristics+of+parosteal+and+conventional+osteosarcoma+with+massive+sclerosis+in+human+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone.</a> J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).</li>
<li>Trento, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((formation+around+two+titanium+implant+surfaces+placed+in+bone+defects+with+and+without+a+bone+substitute+material%3A+A+histological%2C+histomorphometric%2C+and+micro-computed+tomography+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Implant+Dent+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation.</a> Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).</li>
<li>Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiscale+analytical+approach+to+evaluate+osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration.</a> J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).</li>
<li>Budán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+radiomics+evaluation+of+bone+formation+utilizing+multimodal+%28SPECT%2FX-ray+CT%29+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging.</a> PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).</li>
<li>Hulsart-Billström, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surprisingly+poor+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+testing+of+biomaterials+for+bone+regeneration%3A+results+of+a+multicentre+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cells+Mater%22%5BJournal%5D)">A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis.</a> Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).</li>
<li>Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+bone+models+and+their+potential+in+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Osteoporo+Rep%22%5BJournal%5D)">Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation.</a> Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).</li>
<li>Chan, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trabecular+bone+explant+model+of+osteocyte-osteoblast+co-culture+for+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology.</a> Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).</li>
<li>Doke, S. K., Dhawale, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+animal+testing%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharma+J%22%5BJournal%5D)">Alternatives to animal testing: A review.</a> Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).</li>
<li>Moussi, H., et al. New formulation of injectable and degradable calcium phosphate/silanized hyaluronic acid composite foam: Investigation in a rabbit model of long bone defect. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoussi%2C+H+%22SSRN%22">SSRN</a>. , (2024).</li>
<li>Paré, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+and+axially+vascularized+calcium+phosphate-based+implants+for+segmental+mandibular+defects%3A+A+promising+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept.</a> Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).</li>
<li>Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+backscattered+electron+imaging+for+the+measurement+of+mineral+density+distribution+in+human+bone+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies.</a> Bone. 23 (4), 319-326 (1998).</li>
<li>Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+scanning+electron+microscopy+approach+to+the+quantification+of+bone+mineral+distribution%3A+backscattered+electron+image+grey-levels+correlated+to+calcium+K+alpha-line+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Micro%22%5BJournal%5D)">A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities.</a> Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).</li>
<li>Porter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+inexpensive+paraffin-embedding+method+for+dynamic+bone+formation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses.</a> Sci Rep. 7, 42505(2017).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
<li>Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+osteonal+tissues+by+Raman+spectral+mapping%3A+Orientation-composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition.</a> J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).</li>
<li>Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+assessment+of+bone+by+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy.</a> Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).</li>
<li>Oliver, W. C., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+technique+for+determining+hardness+and+elastic+modulus+using+load+and+displacement+sensing+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments.</a> J Mater Res. 7 (6), 1564-1583 (1992).</li>
<li>Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+anatomical+study+of+the+human+knee+and+six+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Knee%22%5BJournal%5D)">A comparative anatomical study of the human knee and six animal species.</a> Knee. 19 (4), 493-499 (2012).</li>
<li>Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+anatomy+of+the+stifle+joint+in+Sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Surg%22%5BJournal%5D)">The surgical anatomy of the stifle joint in Sheep.</a> Vet Surg. 27 (6), 596-605 (1998).</li>
<li>Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+human+osteochondral+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">An ex vivo human osteochondral culture model.</a> J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.20 filtreler</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>18 G iğne (1,2x40 mm)</td><td>Sterican</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>3 mL şırınga</td><td>HENKE-JECT</td><td>8300005762</td><td></td></tr><tr><td>%37 hidroklorik asit&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>1.00317.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit (buzul)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A6283&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aseton&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20063-365&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Mavisi 8GX</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>361186</tr><tr><td>Amonyum hidroksit</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>318612</tr><tr><td>Apatitik trikalsiyum fosfat&nbsp;</td><td>Biyomedikal ve Sağlık Mühendisliği Merkezi (Mines Saint Etienne, Fransa)</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azofloksin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>210633</tr><tr><td>Benzoil peroksit</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.01641.0250</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Medtronic ve nbsp;</td><td>İndüktler 1.5 mg / mL</td><td></td></tr><tr><td>Brillant krosein&nbsp;</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>2107507</tr><tr><td>CTVox&nbsp;</td><td>Bruker-DataViewer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Skyscan-Diamond</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>bıçak</td><td>Struers</td><td>MOD13</td><td></td></tr><tr><td>Elmas testere</td><td>Struers</td><td>Accutom-50</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Mol B3 elmas çözeltisi</td><td>Struers</td><td>40600379</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Nap B1 elmas çözeltisi</td><td>Struers</td><td>40600373</td><td></td></tr><tr><td>Dibazik sodyum fosfat (Na2HPO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102404598</tr><tr><td>Dibutil Phtalate</td><td>Chimie-Plus Laboratoires</td><td>28656</td><td></td></tr><tr><td>DragonFly yazılımı&nbsp;</td><td>ORS</td><td>2022.1.0.1231.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) yüksek glikozu, GlutaMAX (TM), piruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Eozin Y-Surgipath&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>1002830105</tr><tr><td>Eritrosin B</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102141057</tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>20820362</tr><tr><td>Eukitt&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>6.00.01.0003.06.01.01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Ferrik klorür hekzahidrat (FeCl3, 6H2O)&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.03943.0250</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00</td><td></td></tr><tr><td>Fuksin asit</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.05231.0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Biosera</td><td>MS01NG100J</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>86.118.9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İzostatik pres</td><td>Nova Suisse</td><td>Pmax 1500 bar</td><td></td></tr><tr><td>Lazer kırınım granülometrisi</td><td>&nbsp; Malvern</td><td>Mastersizer 3000</td><td></td></tr><tr><td>Açık yeşil</td><td>Prolabo&nbsp;</td><td></td><td></td>28947135</tr><tr><td>Lityum karbonat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A13149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MD-Mol parlatma bezi</td><td>Struers</td><td>40500077</td><td></td></tr><tr><td>Metilsikloheksan</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilsikloheksan&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilsikloheksan&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilmetakrilat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.00590.2500</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-CT, mikro tarayıcı&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1272</td><td></td></tr><tr><td>Monobazik sodyum fosfat (NAH2PO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>Harç</td><td>Fritsch&nbsp;</td><td>Pulverisette 6</td><td></td></tr><tr><td>N, N, Dimetilanilin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>803060</td><td></td></tr><tr><td>Nanoindentasyon istasyonu</td><td>Anton Paar</td><td>NHT2</td><td></td></tr><tr><td>ND-Nap parlatma bezi</td><td>Struers</td><td>40500080</td><td></td></tr><tr><td>OATS Osteokondral Otogreft Transfer Sistemi Seti, 4,75 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-04S</td><td></td></tr><tr><td>OATS Osteokondral Otogreft Transfer Sistemi Seti, 8 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-08S</td><td></td></tr><tr><td>Turuncu G</td><td>Ral</td><td>M15</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Soyulabilir tek kullanımlık gömme kalıpları</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18646C-1</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin (P / S)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Fosfomolibdik asit ve nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>221856-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Fosfotungstik asit</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>12863-5&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Parlatma makinesi</td><td>Sturers</td><td>Dap V</td><td></td></tr><tr><td>Poupinel</td><td>MEMMERT</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Raman mikrospektrometresi</td><td>Renishaw</td><td>InVia Qontor</td><td></td></tr><tr><td>Safran du G&acirc; tinais&nbsp;</td><td>Labonord&nbsp;</td><td></td><td></td>11507737</tr><tr><td>Taramalı elektron mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td>Evo LS 10</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Zeiss</td><td>Carl Zeiss Evo LS10</td><td></td></tr><tr><td>SiC folyolar/Taşlama kağıtları</td><td>Struers</td><td>40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş boya</td><td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Faraday kabı, karbon, alüminyum ve silikon standartlarına sahip standart saplama</td><td>Mikro Analiz Danışmanları Ltd</td><td>8602</td><td></td></tr><tr><td>T25 şişesi</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28975.325</td><td></td></tr><tr><td>Ksilidin Ponceau</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>19.976-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo modelde doku mineralizasyonunun kapsamlı karakterizasyonu

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

Eksplantın mikro-BT görüntüsü Şekil 2'de gösterilmiştir. Manuel segmentasyon kullanmak, global eşikleme kullanarak kemiği merkezi kanalda bulunan çimentodan en iyi şekilde ayıramaz. Trabeküler kemik ve çimentonun tanınmasını geliştirmek için derin öğrenmeyi kullanmayı öneriyoruz. Derin öğrenme, biyomateryal özelliklerini tanımak için güçlüdür ve kemik ile çimento arasındaki ayrımı iyileştirmeye yardımcı olarak çimento-kemik etkileşimlerinin daha iyi değerlendirilmesini sağlar. Bu, çimento ile arayüzde oluşan kemik miktarını doğru bir şekilde ölçmek ve bu hesaplamaya yanlış pikseller dahil etmemek için son derece önemlidir.
Bununla birlikte, arayüzde sadece kemiğin ölçülmesi, yeni oluşan kemiği karakterize etmek için yeterli değildir. Yeni kemiğin gücünü ve bu yeni matrisin oluşumuna yol açan hücresel mekanizmaları daha iyi anlamak için kemik matrisi kalitesi ve hücresel bileşimi hakkında daha derinlemesine bir çalışma gereklidir. Kemik matriksi iki tamamlayıcı yaklaşım kullanılarak karakterize edilebilir: qBEI ve Raman mikrospektroskopisi. Bir qBEI görüntüsü örneği Şekil 3'te sunulmuştur. qBEI ile, gri tonlamalı olarak kodlanmış her piksel bir kalsiyum konsantrasyonuna dönüştürülür. Bu, trabeküler kemikteki kalsiyum içeriğinin dağılımını değerlendirmek ve (i) çimento ile arayüzde yeni oluşan kemiğin mineralizasyon derecesini ve (ii) çimento varlığının trabeküler kemik mineralizasyonunu bozup bozmadığını anlamak için bir ön koşuldur. qBEI'nin avantajı, daha uzun bir çekim süresi gerektiren Raman mikrospektroskopisinin aksine, çok kısa sürede yüksek çözünürlüklü bir görüntü elde etme yeteneğidir. Caortalaması, Cazirvesi ve Cagenişliği gibi qBEI parametreleri daha sonra kalsiyum dağılımından türetilebilir ve iki çimento veya biyomalzeme arasındaki yanıtı karşılaştırmak için kullanılabilir.
Öte yandan, qBEI, biyomateryal ile arayüzde kemik matrisinin organik fazının kalitesi hakkında herhangi bir bilgi sağlamaz. Organik fazın malzeme özellikleri ile ilgili ek bilgiler Raman mikrospektroskopisinden elde edilir. Raman mikrospektroskopisi, iletken karbon tabakasını çıkarmak için hızlı bir yüzey taşlama ve parlatma işleminden sonra qBEI için kullanılanla aynı numune üzerinde gerçekleştirilir. Raman mikrospektroskopisinde, spektrumlar her piksel konumunda elde edilir. Ham işlenmemiş ve işlenmiş Raman spektrumlarının örnekleri Şekil 4'te verilmiştir. Her spektrum, analiz edilen pikselin bileşimi hakkında bilgi içerir ve gömme reçinesi ile ilgili tepe noktalarını içerir, bu durumda, pMMA, mineral faz, v1PO4 ve v1CO3 zirveleri ve organik faz, zirveler Pro, Hyp, CML, Amid III, PG, CH2, Kalem. ve Amid I. Şekil 4'teki örnekte, işlenmemiş spektrum, yakın kızılötesi kırmızı lazer kullanılmasına rağmen, kaplama reçinesinin ~ 812 cm-1'deki katkısını ve floresan nedeniyle sıfır olmayan kavisli bir taban çizgisini göstermektedir. Spektrum işleme, özellikle arka plan floresansının ortadan kaldırılması olmak üzere, çeşitli Raman parametrelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlamak için bir ön koşuldur. Veri alırken, kullanıcı ~960 cm-1'de bulunan v1PO4 tepe noktasının varlığını doğrulamak için hem doğru konumlandırmayı hem de dedektör doygunluğundan kaçınmalıdır. İşlem sonrası, karakteristik titreşim modunun konumuna göre en yüksek yoğunluk oranları hesaplanır.
Bununla birlikte, malzeme bileşimindeki değişikliklerin biyomekanik tepkide değişikliklere yol açıp açmadığı tartışmalıdır. Yeni oluşan kemiğin biyomekaniği hakkında bilgi toplamak için, Raman mikrospektroskopisi için kullanılan aynı numune üzerinde sistematik olarak nanoindentasyon araştırmaları yapıyoruz. Doku mekanik bilgisi, yüke karşı derinlik eğrileri ile temsil edilen nanoindentasyon eğrilerinden elde edilir (Şekil 5). Testin sonunda derinliğin sıfıra geri dönmediğini, plastik deformasyonu ve malzemede yaratılan kalıcı hasarı temsil ettiğini belirtmekte fayda var. Girinti sürünme hızı, derinlik ve zaman eğrisinden türetilir.
Son olarak, hücresel düzeyde biyomateryale doku yanıtını değerlendirmek için histolojik boyama kullanılır (Şekil 6). Önerilen histolojik boyalar, osteoid dokunun varlığını belirlememize izin verir, aynı zamanda hücrelerin (makrofajlar, çok çekirdekli dev hücreler, osteoklastlar, osteoblastlar) tanımlanmasına ve biyomateryal ile arayüzde fibröz bir kapsülün olası varlığına izin verir. Bu, bir biyomateryalin biyouyumluluğunu anlamak için çok önemlidir, aynı zamanda biyomateryal bozulduğunda yeni kemiğin kalıcılığını da anlamak için çok önemlidir.
Genel olarak, çoklu yöntem yaklaşımı, kemik oluşumu, yeni oluşan kemiğin kalitesi ve hücresel bileşimin derinlemesine incelenmesini sağlar. Önerilen sıralı sırayla gerçekleştirildiğinde, tüm araştırmalar aynı numune üzerinde gerçekleştirilebilir, bu da maliyeti ve işlem süresini azaltır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig01.jpg"> Şekil 1: Grafiksel özet. Protokol adımlarının bir özeti burada verilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig02.jpg"> Şekil 2: Mikro-BT ve derin öğrenme analizleri. (A) Mikro-BT görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu. (B) Kemik ve çimento segmentasyonu: manuel segmentasyon ve derin öğrenme arasında karşılaştırma. Ölçek çubuğu = 5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig03.jpg"> Şekil 3: Kalsiyum içeriğini belirlemek için kantitatif geri saçılmalı elektron görüntüleme. (A) Taramalı elektron mikroskobunda (SEM) elde edilen gri seviyelerden oluşan geri saçılmış görüntü, görüntü analiz yazılımı tarafından (B) kemik örneğinin sıcak noktalarını gösteren bir kalsiyum haritasına dönüştürülür. (C) Kalsiyum içeriğinin kemik alanına karşı dağılımı çizilir ve üç ana qBEI parametresi, Camean, Capeak ve Cagenişliği hesaplanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig04.jpg"> Şekil 4: Raman spektrumu örneği. (A) 800 - 1800 cm-1 spektral aralığında elde edilen ham işlenmemiş Raman spektrumu. Spektrumlar 0'dan başlamadığı için floresan arka plan açıkça görülebilir. Reçine katkısı (pMMA) ~ 812 cm-1'de açıkça görülebilir. (B) İşlenmiş spektrum. İlgilenilen farklı titreşim modlarının konumu spektrum üzerinde belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig05.jpg"> Şekil 5: Nanoindentasyon ile doku mekanik özelliklerinin incelenmesi. (A) Nanoindentasyon cihazı, numune bloğunun yüzeyindeki ilgilenilen bölgenin konumunu tanımlamak için kullanılan optik bir parçadan oluşur ve daha sonra blok, girinti kısmının altına çevrilir. (B) Zamana karşı yük ve zamana karşı derinlik, girinti testi sırasında çizilir ve (C) yüke karşı derinlik eğrisi. Bu örnekte seçilen derinlik 400 nm olarak sabitlenmiştir. Maksimum yük (Lm), yükleme sonundaki derinlik (hl), duraklama süresinden sonraki derinlik (hm), boşaltma segmentinin eğimi (S) ve testin yükleme-boşaltma aşaması altındaki alan (Wplast) yüke karşı derinlik eğrisinden türetilir ve farklı nanoindentasyon parametrelerini hesaplamak için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig06.jpg"> Şekil 6: 28 günlük kültürden sonra çimento ile muamele edilen osteokondral eksplantların histolojik analizi. (A) Movat boyama, kemik ve defekti dolduran çimento dahil olmak üzere doku yapısını gösterir. (B) HES boyama, çimento etrafındaki doku entegrasyonunu ve hücresel yanıtı gösterir. Ölçek çubuğu: 2,5 mm. (C) (B)'de, çimento ile çevresindeki doku arasındaki arayüzü detaylandıran, hücrelerin çimentoyu istila ettiği gözlemlenebilen vurgulanan alanın büyütülmesi. Ölçek çubuğu: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Ex Vivo Modelde Doku Mineralizasyonunun Kapsamlı Karakterizasyonu

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous ...

comprehensive-characterization-tissue-mineralization-an-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (BT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Hayvan modelleri sık kemik kanseri metastazı araştırmak için kullanılmaktadır. Bu protokolü biz kemik metastazı çalışmaları için tümör inokülasyonu iki genel metot tanımlamak ve kısaca bu modeller izlemek ve ölçmek için kullanılan analizler bazı anlatacağız.

Kemik Metastaz Modelleri

Bu videoda, anyonik bir boya olan Alizarin Red S kullanılarak osteoblast tarafından salgılanan kalsiyum birikintilerinin tespiti için bir yöntem açıklıyoruz. Kültürlenmiş osteoblastlar önce boyanır ve daha sonra boya, kalsiyum birikintilerinin kolorimetrik miktar tayini veya osteoblast mineralizasyon derecesi için geri kazanılır.

İn Vitro Mineralizasyon Deneyi: Alizarin Red S Boyama ve Ekstraksiyonu ile Kemik Grefti İkamesi Üzerindeki Osteoblast Kalsiyum Birikintilerini Ölçmek İçin Kolorimetrik Bir Yöntem

Bu el yazmasında, mineralize dokuların donmuş kesitleri üzerinde birkaç tur floresan görüntülemeden çoklu yanıt ölçümlerinin hizalanmış kompozit görüntülerini üretmek için yüksek verimli, yarı otomatik bir kriyohistoloji platformu sunuyoruz.

Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology

Biz iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Qafqaz profillerini Alizarin Red-boyama, ultraviyole (UV) ışık görselleştirme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ve enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (EDX) tarafından S (AR-S) analiz edildi.

Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAO'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi

Kardiyovasküler hastalık dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Vasküler kalsifikasyon kardiyovasküler morbidite ve mortalite yüküne önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu protokol, floresan görüntüleme ile vasküler düz kas hücresi aracılı kalsiyum çökelmesini in vitro olarak ölçmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır.

In Vitro Kalsiyum Birikimini Ölçmek için Yarı Otomatik ve Tekrarlanabilir Biyolojik Tabanlı Bir Yöntem

Burada, insan kemik iliğinin in vivo yapısının karmaşıklığını yansıtan, çok çeşitli normal ve patolojik olayları ince bir şekilde incelemek için uygun bir model sağlayan, uygulaması kolay, standartlaştırılmış, mikrofizyolojik bir sistemi tanımlıyoruz.

Fizyolojik veya Tümöral Bağlamlarda Yerleşik Hücreler Arasındaki Dinamiği ve Etkileşimleri Araştırmak için Bir İnsan Kemik İliği 3D Modeli

Bu yazıda, murin aortlarının izole edilmesi, ardından mineralizasyon potansiyelini gözlemlemek için kalsifiye hücre dışı veziküllerin ekstraksiyonu ile vasküler kalsifikasyonun elde edilmesi ve değerlendirilmesi için metodoloji sunulmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Aracılı Vasküler Kalsifikasyonun In Vitro ve In Vivo Modeller Kullanılarak Analizi

Bu protokol, Hematoksilen-Eozin (HE) boyama ve mikro-bilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) tekniklerini birleştirerek osteoporozun fare modelinde kemik mikromimarisinin kantitatif değerlendirilmesi için ekonomik ve etkili bir yöntem sunar.

Osteoporoz Fare Modelinde Trabeküler Kemik Mikromimarisinin Değerlendirilmesi

Kemik yenilenmesini çeşitli hiyerarşik seviyelerde değerlendirmek için bir protokol öneriyoruz. Bu çok modlu yaklaşım, farklı uzunluk ölçeklerinde yapısal analizlere olanak tanır ve örnek hazırlığındaki zorlukları etkili bir şekilde ele alır. Ayrıca, biyomalzemelerin kemik yenilenmesini teşvik etmedeki etkinliğini değerlendirmek için güvenilir bir iş akışı sağlar.

Kemik Yenilenmesi ve İskelet Performansını Değerlendirmek İçin Multimodal Yaklaşım

Bu protokol, metakrilatlenmiş jelatin (GelMA) hidrojellerine gömülü insan osteositleri kullanılarak 3D kemik yapılarının üretilmesini ve decellularize ekstrasellüler matriks ile desteklenmesini açıklar. Yöntem düşük maliyetli, ölçeklenebilir ve temel laboratuvar ekipmanlarıyla uyumludur; bu da kas-iskelet hastalıkları süreçlerini incelemek için translasyonel bir platform sağlar.

Kas-iskelet hastalıklarının modellenmesi için insan osteositleri ve hücresizleştirilmiş ekstrasellüler matriks kullanan 3D kemik kültürü platformu

Keşfedin, doku mineralizasyonunun kapsamlı karakterizasyonu için ex vivo model kullanarak kemik rejenerasyonunu değerlendirme yöntemlerini. Mikro-CT, nano indentasyon ve Raman spektroskopisi ile yeni kemik oluşumunun kalitesini analiz edin.

Ex Vivo Modelde Doku Mineralizasyonunun Kapsamlı Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet