Name: Tek Moleküllü Manyetik Cımbız Kullanarak Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerinin İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Öğrenin, tek moleküllü manyetik cımbız kullanarak TRF2 ve telomerik DNA arasındaki etkileşimleri incelemeyi. Bu yöntem, protein-DNA bağlanma kinetiği ve telomer biyolojisi araştırmaları için güçlü bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Tek Moleküllü Test Kullanılarak Telomerik DNA ile TRF1/2 Etkileşimlerinin İncelenmesi

<table><tbody><tr><td>Anti-Digoxigenin</td><td>Roche</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>BfaI</td><td>New England Biolab (NEB)</td> <td>R0568S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>CMOS kamera&nbsp;</td><td>Mikrotron</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>CviAII</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0640S</td><td></td></tr><tr><td>DIG-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>DNA ekstraksiyon çözeltisi</td><td>G-CLONE</td><td>EX0108</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I, Rnaz İçermeyen, Hc Ea</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)</td><td>P032-02</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Solarbio</td><td>D1070</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 ve nbsp; boncuklar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65305</td><td>Streptavidin boncuklar</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne boncuklar Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>Streptavidin boncuklar</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Tianjin No.6 Kimyasal Reaktif Fabrikası</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Pekin Hwrkchemical ve Tic. Ltd. Şti. Ltd</td><td>SMG66258-1</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Solarbio</td><td>II0070</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Tianjin No.6 Kimyasal Reaktif Fabrikası</td><td>A1079</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>Klenow parçası (3 & prime; -5 & prime; exo-)</td> <td>New England Biolab (NEB)</td> <td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td>https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html</td><td>Grafik programlama yazılımı&nbsp;</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)</td><td>BD136449</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Solarbio</td><td>L8120-5</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Şangay Aladdin</td><td>C111533</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td></td><td>Spektrofotometre</td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Ni NTA Boncuk 6FF</td><td>Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., Ltd</td><td>SA005025</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran</td><td>ABklonal</td><td>RM02801</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Solarbio</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>ST535-500mg</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Tampon</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>2124902</td><td></td></tr><tr><td>Sumo proteaz</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>P2312M</td><td></td></tr></tbody></table>

tek moleküllü manyetik cımbız kullanarak telomerik protein-dna etkileşimlerinin İncelenmesi

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Şekil 1A, prokaryotik hücrelerde eksprese edilebilen sırasıyla 439 ve 542 amino asitten oluşan TRF1 ve TRF2'nin şematik alanlarını ve yapılarını göstermektedir. TRF1'in hazırlanması daha önce literatürdetanımlanmıştır 41. Burada, TRF2'nin hazırlanmasının kapsamlı bir tanımını ve temsili sonuçlarını sunuyoruz. Şekil 1B, E. coli'de TRF2'yi eksprese etmek için kullanılan plazmid haritasını göstermektedir. Şekil 1B'de gösterildiği gibi E. coli'de indüksiyondan önce ve sonra TRF2 ekspresyonunu değerlendirdik. Saflaştırma ve etiket bölünme süreçleri de SDS-PAGE kullanılarak analiz edildi (Şekil 1C). Bu protokolü takiben, her iki telomerik bağlayıcı protein, TRF1 ve TRF2, E. coli'de başarılı bir şekilde eksprese edildi.
Telomerik DNA, terminal kısıtlama fragmanları (TRF'ler) şeklinde, dört kısıtlama enziminin bir kombinasyonu kullanılarak insan genomlarından üretilir. Şekil 2A'da gösterilen akış şemasını takiben, insan hücrelerinden genomlar çıkardık. Enzimler, tam uzunluktaki telomerik DNA'yı bozulmadan bırakırken genomik DNA'yı seçici olarak sindirir, böylece tek moleküllü tahliller için materyal sağlar. TRF DNA preparatını çeşitli insan hücre dizileri kullanarak kapsamlı bir şekilde test ettik. Genomik DNA'nın bütünlüğü, Şekil 2B'de gösterildiği gibi agaroz jel elektroforezi kullanılarak incelendi. TRF'ler daha sonra, başka bir yerde açıklanan bir yöntem izlenerek, telomerik tekrar dizisi TTAGGG'ye (Şekil 2C) tamamlayıcı olarak floresan etiketli oligonükleotidler kullanılarak Güney lekeleme ile analiz edildi41,56. Ortalama olarak, insan TRF'lerinin uzunluğu birkaç kilobaz civarındadır.
Tek moleküllü tahliller, Şekil 3A'da tarif edildiği gibi bir araya getirilmiş bir akış hücresinde gerçekleşir. Bir nitroselüloz kaplama, negatif yüklü cam yüzeyi kaplayarak antikor adsorpsiyonu için hidrofilik bir matris sağlar. BSA pasivasyonu, nitroselüloz matrisinin anti-digoksigenin antikorları tarafından bağlanmayan alanlarını bloke eder. Demir nanopartikülleri içermeyen polistiren boncuklar, referans boncuk görevi görür. TRF bağları, nitroselüloz matris üzerindeki digoksigenin-antikor ile manyetik boncuk yüzeyindeki biyotin-streptavidin arasındaki afinite etkileşimleri yoluyla oluşturulur (Şekil 3B). TRF1 veya TRF2, serbest difüzyon yoluyla TRF DNA bağlarına bağlanarak akış hücresine sokulur. Manyetik cımbız, manyetik alanı modüle etmek, TRF bağlarını germek ve gevşetmek için manyetik boncuklar üzerinde kuvvetler oluşturmak ve böylece protein-DNA etkileşimlerinin araştırılmasını sağlamak için kullanılır.
Tek moleküllü bir mekanik tahlil, manyetik cımbız motorlarının hareketlerini kontrol etmek için bir senaryo geliştirilerek tasarlanmıştır. Bir akış şeması, manyetik cımbız kullanan tek moleküllü bir test için MatLab'da bu komut dosyasını oluşturmak için yapılandırılmış bir yaklaşım sağlar (Şekil 4A). Mıknatıslar, z ekseni boyunca 0-25 mm aralığında hareket eder. Kuvvetler, literatürde54 açıklanan denklemler kullanılarak, mıknatıs konfigürasyonuna göre mıknatıs konumlarına göre hesaplanır. Belirli bir kuvvet yükleme hızı için, mıknatıs konumları ve hareket hızları, kuvvet rampası tahlili örneğinde gösterildiği gibi, istenen kuvvet manipülasyon profilini elde etmek için MatLab'da tasarlanır ve programlanır (Şekil 4B-D).
Örnek olarak TRF1'i kullanarak, tek moleküllü manyetik cımbız ile telomerik DNA-protein etkileşimlerini araştırdık. Deney düzeneği, Şekil 5A'da gösterildiği gibi, kuvvet-uzama eğrilerinin, protein-DNA etkileşimlerinin kırılması ve gevşeme sırasında düzgün izler nedeniyle gerilme sırasında zikzak özellikler sergilediği ve protein aracılı döngüler olmadan DNA lifini yansıttığı bir kuvvet-rampa tahlili olarak yapılandırılabilir. Kurulum, Şekil 5B,C'de gösterildiği gibi, belirli kuvvetler altında genişlemedeki değişiklikleri ve protein-DNA etkileşimlerinin sürelerini ölçmemize izin veren bir kuvvet atlama testi olarak da yapılandırılabilir. Telomerik DNA-protein komplekslerinin ayrışma kinetiği bu ölçümlerden türetilebilir (Şekil 5D). Ek olarak, DNA-protein komplekslerindeki döngülerin oluşumu, uzantıdaki değişikliklerle ortaya çıkarılabilir (Şekil 5E). Ayrıca, protein konsantrasyonu bu telomerik DNA deney düzeneği içinde titre edilebilir. Ayrıca, insan hücrelerinden gelen telomerik DNA'nın uzunluk heterojenliği, çeşitli uzunluklardaki telomerlerdeki döngü oluşum mekanizmasını araştırmamıza izin verir (Şekil 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig01v2.jpg"> Şekil 1: TRF1/2'nin ekspresyonu ve saflaştırılması. (A) TRF1 ve TRF2'nin etki alanı mimarisi. (B) E. coli'de TRF2'yi eksprese etmek için pET28a-SUMO-TRF2'nin plazmid haritası. (C) İfade ve saflaştırmanın çeşitli aşamalarında elde edilen numunelerin SDS-PAGE analizi. Şerit 1: IPTG tarafından indüklenmemiş. Şerit 2: Hücre lizizi ile elde edilen IPTG kaynaklı çökelti. Şerit 3: Hücre lizizinden sonra elde edilen IPTG kaynaklı süpernatant. Şerit 4: Ni sütunundan geçin. Şerit 5: Safsızlık proteinlerini çıkarmak için düşük imidazol tamponu ile yıkayın. Şerit 6: 300 mM imidazol içeren tampon ile 6xHis-SUMO-TRF2'nin elüsyonu. Şerit 7: SUMO etiketlerinin SUMO proteaz enzimi tarafından sindirilmesi. Şerit 8: Ni sütunu ile yeniden saflaştırma ve 20 mM imidazol içeren tampon ile TRF2'nin elüsyonu (6xHis ve SUMO etiketleri kaldırıldı). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig02.jpg"> Şekil 2: Terminal kısıtlama fragmanlarının (TRF) hazırlanması . (A) İnsan hücrelerinden TRF'lerin hazırlanması için akış şeması. (B) 5 insan hücre hattı için% 1 agaroz jel kullanılarak genomik DNA bütünlüğünün incelenmesi. (C) 5 insan hücre hattı için Southern blotting ile gerçekleştirilen TRF analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig03.jpg"> Şekil 3: Tek moleküllü mekanik tahlillerin hazırlanması. (A) Tek moleküllü mekanik tahliller için bir akış hücresinin hazırlanmasını gösteren akış şeması. (B) Manyetik cımbız kullanılarak tek moleküllü mekanik tahlillerin şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig04.jpg"> Şekil 4: Tek moleküllü bir mekanik tahlilin tasarımı. (A) Bir kuvvet rampası tahlili yürütmek için bir komut dosyası oluşturmak için akış şeması. (B) Mıknatısların z ekseni boyunca hareket profili. (C) Mıknatıs hareketine karşılık gelen kuvvet profili. (D) Mıknatıs konumları ile ortaya çıkan kuvvetler arasındaki korelasyon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig05.jpg"> Şekil 5: Tek moleküllü manyetik cımbızla incelenen telomerik DNA-protein etkileşimleri. (A) TRF1-telomer etkileşimleri, 23 ° C'de 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA ve 100 mM NaCl içeren bir tamponda kuvvet-rampa deneylerinde (N = 10) araştırıldı. TRF1'in konsantrasyonu 10 nM idi ve ±1 pN/s'lik bir kuvvet yükleme hızı vardı. (B) TRF bağı, kuvvet atlama deneylerinde gerildi ve gevşetildi. Uygulanan kuvvet protokolü Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN ve Fmax = 20 pN idi. Tampon ve sıcaklık koşulları (A)'daki ile aynıydı. Kare hızı = 200 Hz. (C) TRF1-telomer etkileşimleri, 10 nM'lik bir TRF1 konsantrasyonu ile kuvvet atlama deneylerinde incelendi. (D) TRF1-telomer komplekslerinin ayrışma kinetiği. Test edilen kuvvetlerde ayrışma hızının logaritması (Ortalama ± SD, n = 206) Kramer-Bell-Evans modelini (kırmızı eğri ve efsane denklemi) takip eder. Ek, Ftest'te ortalama ayrışma süresini (&lt;τ&gt;) gösterir. (E) TRF1-telomer komplekslerinin yırtılma olayları üzerine uzamadaki (ΔL) değişikliklerin dağılımı. Siyah ve kırmızı eğriler Gauss bağlantı parçalarını temsil eder. Bu rakam Li ve ark.41'in izniyle değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig06.jpg"> Şekil 6: Bir telomerde TRF1 tarafından oluşturulan DNA halkalarının sayısı ve boyutları. (A) [TRF1] = 20 nM'de DNA döngü boyutlarının (ΔL) telomer uzunluğu bağımlılığı. Eğriler Gauss bağlantı parçalarını temsil eder. (B) [TRF1] = 40 nM'de ΔL'nin telomer uzunluğu bağımlılığı. (C) ΔL ile telomer başına kopma olaylarının sayısı arasındaki korelasyon, N. Sıfır dereceli korelasyon r = -0.20, p &lt; 0.001'dir (örneklem büyüklüğü = 1496). (D) ΔL ve N arasındaki negatif korelasyonu açıklayan olası bir mekanizmayı gösteren ve TRF1'in birincil döngü alanlarına sahip tek bir telomeri yüksek dereceli bir topolojiye sıkıştırabileceğini öne süren bir karikatür. Bu rakam Li ve ark.41'in izniyle değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Komut dosyaları oluşturmak için MatLab kodu.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-MatLab%20code%20for%20generating%20scripts.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: Sabit kuvvet assay.txt için komut dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20constant%20force%20assay.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: Kuvvet rampası assay.txt için komut dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20force%20ramp%20assay.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Tarifler <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Tek Moleküllü Manyetik Cımbız Kullanarak Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerinin İncelenmesi

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper ...

analyzing-telomeric-protein-dna-interactions-using-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Manyetik cımbız, güçlü bir tek moleküllü manipülasyon teknikleri, biyolojik makromoleküllerin (manyetik bir tork cımbız olarak adlandırılan bir konfigürasyonu kullanılarak) ve tork (manyetik cımbız serbestçe yörüngeli adı konfigürasyonu kullanılarak) bükümün doğrudan ölçümleri için uyarlanabilir. Bu tür ölçümler yapmak için rehber DNA ve ilgili nükleotid protein filamanların çalışma uygulamaları da dahil olmak üzere verilmiştir.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Burada, kuvvete duyarlı biyomoleküller üzerinde maksimum 1.2 kHz hızında nanomekanik ölçümler yapan yüksek hızlı bir manyetik cımbız kurulumunu açıklıyoruz. DNA saç tokalarına ve SNARE komplekslerine model sistemler olarak uygulanmasını tanıtıyoruz, ancak mekanobiyolojik olaylarda yer alan diğer moleküllere de uygulanabilecektir.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

TIRF mikroskobu ile büyük verici-alıcı ağlardan smFRET verilerini elde etmek için kurulum ve deneysel prosedürü sunuyoruz. Bu ölçümlerin Bayes çıkarım yazılımı Fast-NPS ile adım adım analizi, uyarlanmış boya modellerinin uygulanması yoluyla yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler verir.

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Burada, üç renkli smFRET veri ve onun analizi ile 3D ensemble gizli Markov modeli elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yaklaşım ile bilim adamları Kinetik bilgi cooperativity veya ilişkili etkileşimler de dahil olmak üzere karmaşık protein sistemlerden ayıklayabilirsiniz.

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Bu makalede, açık kaynaklı, ucuz smfBox'ı kullanarak biyomolekülleri serbestçe dağıtarak, açmadan hizalamaya ve odaklanmaya, veri toplama ve analize kadar, bireysel olarak tam olarak düzeltilmiş doğru FRET ölçümleri yapmak için adım adım yönergeler sağlanır.

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

Bu protokol, optik cımbız kullanarak RNA-protein etkileşimlerini incelemek için eksiksiz bir deneysel iş akışı sunar. Optik cımbızın konfokal mikroskopi ile kombinasyonu da dahil olmak üzere çeşitli olası deneysel kurulumlar özetlenmiştir.

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

Öğrenin, tek moleküllü manyetik cımbız kullanarak TRF2 ve telomerik DNA arasındaki etkileşimleri incelemeyi. Bu yöntem, protein-DNA bağlanma kinetiği ve telomer biyolojisi araştırmaları için güçlü bir çerçeve sunar.

Tek Moleküllü Manyetik Cımbız Kullanarak Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerinin İncelenmesi

Daha fazla video keşfet