Name: Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Öğrenin, dijital damlacık PCR ile adeno ilişkili viral genom miktar tayini için standart bir protokol oluşturun. Bu yöntem, gen terapisi araştırmalarında güvenilirliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Dijital Damlacık PCR Kullanarak Viral Genom Ölçümü için Standartlaştırılmış Protokol

<ol><li>Balakrishnan, B., Jayandharan, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+biology+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+used+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy.</a> Curr Gene Ther. 14 (2), 86-100 (2014).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-tropism+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors.</a> Curr Opin Virol. 21, 75-80 (2016).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
<li>Gimpel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+process+and+product+characterization+of+recombinant+adeno-associated+virus-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for process and product characterization of recombinant adeno-associated virus-based gene therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 20, 740-754 (2021).</li>
<li>Brimble, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+packaging+of+translatable+P5-associated+DNA+contaminants+in+recombinant+AAV+vector+preps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preventing packaging of translatable P5-associated DNA contaminants in recombinant AAV vector preps.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 24, 280-291 (2022).</li>
<li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-related+impurities+in+clinical-grade+recombinant+AAV+vectors%3A+Characterization+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: Characterization and risk assessment.</a> Biomedicines. 2 (1), 80-97 (2014).</li>
<li>Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDobnik%2C+D+%22Front+Microbiol%22">Front Microbiol</a>. 10, (2019).</li>
<li>Sidransky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ras+oncogene+mutations+in+the+stool+of+patients+with+curable+colorectal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors.</a> Science. 256 (5053), 102-105 (1992).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Anal Chem. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories Inc. Planning droplet digital PCR experiments. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments">https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments</a> (2024).</li>
<li>Dorange, F., Le Bec, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+characterize+AAV+vector+production+%26+purification%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Ther+Insights%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to characterize AAV vector production & purification: Advances and challenges.</a> Cell Gene Ther Insights. 4 (2), 119-129 (2018).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Prantner, A., Maar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+concentration%2C+characterization%2C+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18 (1), e0280242(2023).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Front Microbiol. 10, 1570(2019).</li>
<li>Suoranta, T., Laham-Karam, N., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+accurate+titration+of+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for accurate titration of adeno-associated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1270-1279 (2021).</li>
<li>Bio-Rad. Droplet digital PCR applications guide. Bulletin 6407. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>8 kanallı pipet 10 & mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,010</td><td></td></tr><tr><td>8 kanallı pipet 200 & mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,036</td><td></td></tr><tr><td>8 kanallı pipet 300 & mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,052</td><td></td></tr><tr><td>8 oyuklu PCR şeridi</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>C1000 96&ndash ile Dokunmatik Termal Döngüleyici; Derin Kuyu Reaksiyon Modülü</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>Problar için ddPCR Tampon Kontrolü 9 mL (2 x 4,5 mL)</td><td>Problar için Bio-Rad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix (dUTP Yok) (2 x 1 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863023</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96 Kuyulu Plakalar (25 paket)</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Damlacık Okuyucu Yağı (2 x 1L)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Kartuş Tutucu</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>QX200/QX100 için DG8 Kartuşları (24 paket)</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>QX200/QX100 için DG8 Contalar (24 paket)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (10U/&mikro; L) + tampon</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Problar için Damlacık Oluşturma Yağı (10 x 7 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filtre Ucu, 0.1-10 & mu; L, 34 mm, Raf, PCR Temiz, STERİL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078500</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Çift Filtreli T.I.P.S. Filtre Ucu, 20-300 & mu; L, 55 mm, Raf, PCR Temiz, STERİL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078560</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Çift Filtreli T.I.P.S. Filtre Ucu, 2-100 & mu; L, 53 mm, Raf, PCR Temiz, STERİL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078543</td><td></td></tr><tr><td>100 mM&nbsp'de ileri liyofilize primerler ve ilgili ana stoklar;</td>Hedef dizi olarak <td>IDT</td><td></td><td>GFP. İleri astar: 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'Lyopohilized</td></tr> <tr><td>prob ve 100 & mikro'da ana stok; M&nbsp;</td>Hedef dizi olarak <td>IDT</td><td></td><td>GFP. PrimeTime Eko Probu: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür (MgCl<alt>2</alt>)</td><td>Chemlab Analitik</td><td>CL00.1381</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>IDT</td><td>11-04-02-01</td><td></td></tr><tr><td>PCR Plakası Isı Yalıtımı, folyo, delinebilir (100'lük paket)</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 iyonik olmayan yüzey aktif madde (100x)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td><td>Honeywell araştırma kimyasalları</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>QX yönetici yazılımı</td><td>ddPCR verilerini analiz etmek için</td><td>Bio-Rad</td><td></td> Yazılımı</tr><tr><td>QX200 Damlacık Jeneratörü</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Okuyucu</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif rezervuarı</td><td>VWR</td><td>613-1181</td><td></td></tr><tr><td>100 mM'de ters liyofilize primerler ve ilgili ana stoklar&nbsp;</td>Hedef dizi olarak <td>IDT</td><td></td><td>GFP. Ters astar: 5'-TGCTCAGGTAGTGTGTCG-3'SafeSeal</td></tr> <tr><td>reaksiyon tüpü, 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>Somon Sperm DNA'sı, kesilmiş (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>TE tampon</td><td>IDT</td><td></td><td>Tris</td></tr><tr><td>hidroklorür (Tris-HCl)</td> siparişi verirken astarlarla birlikte <td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr></tbody></table>

dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu ile saflaştırılmış vektör Örneklerinde adeno İlişkili viral genomların miktar tayini

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Sonuçlar uygun yazılım kullanılarak görselleştirilebilir. Her kuyu için, 1B genlik grafiği, genliklerine göre tüm damlacıkları görüntüler. Pozitif ve negatif damlacıklar arasında net bir ayrım beklenir. Pozitif ve negatif damlacık bulutları arasında toplam damlacıkların 'undan fazlası bulunursa (damlacık yağmuru olarak adlandırılan bir fenomen), numunenin yeniden ölçülmesi gerekir (bkz. Şekil 1). Damlacık yağmuru hakkında ek bilgi tartışmada mevcuttur.
Numune adı, kabul edilen damlacık sayısı (olay sayıları) ve konsantrasyon (kopya/μL) dahil olmak üzere kaydedilen tüm bilgileri özetlemek için bir veri tablosu oluşturulabilir. İdeal olarak, olay sayısı 15.000 ila 20.000 kabul edilen damlacık arasında olmalıdır. Bir kuyu için olay sayısı 10.000'in altındaysa, veri noktası analizden çıkarılmalıdır. Çıktı verilerinin bir örneği Tablo 5'te verilmiştir.
vg titresi, numune seyreltmeleri dikkate alınarak konsantrasyona (kopya/μL) dayalı olarak hesaplanabilir. dd_PCR çalışma aralığı 10-10.000 kopya/μL'dir. 10 kopya/μL'nin altındaki değerler analizden çıkarılmalıdır. Numuneler için vg titresinin yanı sıra pozitif ve negatif kontroller de hesaplanmalıdır. Pozitif kontrolün ölçülen değeri, teorik değere göre% 20'den daha düşük bir varyasyon katsayısına (% CV) sahip olmalıdır. Negatif kontrol 5 kopya/μL'den az olmalıdır. Ek olarak, her numune için tekrarlar ve farklı seyreltmeler arasındaki %CV hesaplanmalıdır. Farklı seyreltmeler arasındaki %CV 'yi aşarsa, değer yanlış olarak kabul edilebilir ve numunenin yeniden ölçülmesi gerekebilir.
Başarılı bir ölçüm, pozitif ve negatif damlacık bulutlarının net bir şekilde ayrılması, en az 10.000 kabul edilen damlacık, 10 kopya/μL ile 10.000 kopya/μL arasında bir değer ve 'den düşük tekrarlar arasında %CV ile karakterize edilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig01.jpg"> Şekil 1: dd_PCR damlacıklarının görselleştirilmesi. (A) 1D genlik grafiği, pozitif ve negatif damlacıkların net bir şekilde ayrıldığını gösterir, bu da başarılı damlacık bölümlemesini gösterir. (B) Grafik, damlacık yağmuru olarak bilinen pozitif ve negatif damlacıkların zayıf bir ayrımını gösterir, bu da optimal olmayan bölümlemeyi veya tahlille ilgili potansiyel sorunları önerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig02.jpg"> Şekil 2: Dijital damlacık PCR kullanarak viral genomların miktarını belirlemek için iş akışı. (1) Tamponlar, reaktifler ve çözeltiler, üreticinin talimatlarına veya protokolün 1. adımına (Stok çözeltilerinin hazırlanması) göre hazırlanır. (2) DNaz I çözeltisinin 45 μL'si, 8 tüplü bir PCR şeridinin her bir tüpüne aktarılır. Numunelerin girdaplanması ve kısaca santrifüjlenmesinden sonra, tüplerden birine 5 μL numune eklenir. DNaz I ve numune içeren sekiz tüplü PCR şeridi, 37 ° C'de 1 saat boyunca bir termosiklerde inkübe edilir, ardından numunelerin seri seyreltmeleri yapılır. (3) PCR mastermix'i tarif edildiği gibi hazırlanır ve 8 tüplü bir PCR şeridinin her bir tüpüne 19.8 μL eklenir. 2. adımdaki numune seri seyreltmeleri mastermix'e eklenir. 20 μL mastermix plus numune çözeltisi kartuşun orta sırasına yüklenir ve 60 μL damlacık oluşturma yağı, damlacık üreten bir kartuşun alt kuyularına aktarılır. Kartuş daha sonra damlacık üretecine yerleştirilir ve belirtilen koşullara göre çalıştırılır. Damlacık oluşumundan sonra, kartuşun üst sırasından 42,5 μL, çok kuyulu bir PCR plakasına aktarılır. (4) PCR plakası bir PCR termocycler'a yüklenir ve sağlanan koşullara göre çalıştırılır. Plaka, bir dd_PCR okuyucu kullanılarak analiz edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Hassas veriler. Bu tablo, her biri beş konsantrasyona (QC1-QC5) sahip dört set kalite kontrol (QC) numunesinden elde edilen hassas verileri sunar. Her QC beş kez ölçüldü. Tekrarlanabilirliği (A) temsil eden farklı çalışmalar arasındaki ve orta hassasiyeti (B) temsil eden farklı numune setleri arasındaki varyasyon katsayısı (%CV) gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 2: Örnek seyreltmeler. Tablo, beklenen viral genom titresine (vg/mL) dayalı olarak önerilen numune seyreltmelerini göstermektedir. En az iki değerin testin çalışma aralığına girmesini sağlamak için toplam üç seyreltme önerilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%202.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 3: dd_PCR ana karışım bileşimi. Bu tablo, bir ileri ve geri astar (909 nM), prob (227 nM) ve problar için dd_PCR süper karışım (dUTP olmadan, 1x) içeren dd_PCR ana karışımının bileşimini özetlemektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%203.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 4: Termodöngü koşulları. Tablo, aşağıdakileri içeren önerilen PCR programını detaylandırmaktadır: (1) kapsid bozulması ve enzim aktivasyonu için 95 ° C'de 10 dakikalık bir inkübasyon, (2) DNA denatürasyonu için 94 ° C'de 30 s'lik 40 döngü ve tavlama ve uzatma için 60 ° C'de 1 dakika, (3) enzim deaktivasyonu için 98 ° C'de 10 dakikalık bir inkübasyon, ve (4) 4 ° C'de tutma. Tavlama sıcaklığı, kullanılan astar/prob setine bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%204.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 5: Gerçek bir AAV çalışmasından elde edilen çıktı verilerine örnek. Tablo, bir numunenin her biri çift olarak iki farklı seyreltmede ölçüldüğü gerçek bir AAV çalışmasından elde edilen çıktı verilerinin bir örneğini sağlar. Viral genom (vg) titresi (vg / mL cinsinden) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: 10 (DNaz I ön işlemi) x 10 (ana karışımda seyreltme) x 1.000 (μL ila mL) x AAV seyreltme tamponunda seyreltme. STDEV standart sapmayı temsil eder ve CV varyasyon katsayısını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%205.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

quantification-adeno-associated-viral-genomes-purified-vector-samples

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Tüm viral kodlama dizilerinden yoksun yüksek kapasiteli adenoviral vektörlerin üretilmesi için bir protokol sunulmuştur. Vektör genomunda bulunan transgenlerin klonlanması, hedef güdümlü endonükleazlara dayanmaktadır. Yapışık hücreler olarak büyütülen ve süspansiyon halinde üretilen üretici hücrelerde virüs amplifikasyonu, trans halinde viral genler sağlayan yardımcı bir virüse dayanır.

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

Bu el yazması bir basit nokta leke tahlil Nefelometri adeno ilişkili virüs (AAV) titreleri ve derleme aktif rol çalışmaya uygulanması için detayları proteinleri (AAPs), yapısal olmayan viral proteinlerin tüm AAV buldu romanı bir sınıf serotipleri, soydaş ve kapaklı AAV serotipleri türetilmiş capsids Meclisi teşvik.

Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler

Bu protokol, küçük ölçekli AAV üretimi, intravitreal enjeksiyon, retina görüntüleme ve retina genomik DNA izolasyonu ile birlikte dijital damlacık PCR (dd-PCR) kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyon verimliliğinin nasıl ölçüleceğini sunar.

Murine Retina'da AAV Transdüksiyon Verimliliğinin Nicelleştirilmesi için Dijital Damlacık PCR Yöntemi

Burada, gen tedavisi vektörlerinin klinik gelişimini desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu ile insan gözyaşlarında adeno ilişkili viral vektörlerin uyumlu tespitinde iyi laboratuvar uygulamalarının geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz.

Gözyaşlarının Biyodökülme Çalışmalarında Adeno-İlişkili Viral Vektörlerin Tespiti için Doğrulanabilir Bir Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), klinik ve preklinik gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. rAAV'ler için yeterince takdir edilmeyen bir kullanım, kültürlenmiş hücrelerin saflaştırmaya gerek kalmadan sağlam bir şekilde aktarılmasıdır. rAAV'ye yeni başlayan araştırmacılar için, transgen kaset klonlama, ham vektör üretimi ve hücre kültürü transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Burada, yetişkin farelerde adeno-ilişkili virüsü (AAV) sistemik olarak uygulamak için fare lateral kuyruk veni enjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü detaylandırıyoruz. Ek olarak, AAV transdüksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan tahlillerin protokollerini açıklıyoruz.

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (BT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Küresel diyastolik fonksiyonunun doğru, nedensellik-tabanlı ölçüm parametrized Diyastolik aracılığıyla transmitral akışı Dolum (PDF) biçimcilik kinematik modelleme tabanlı analizi ile elde edilmiştir. PDF benzersiz sertlik, rahatlama, ve yük parametrelerini üretir ve disfonksiyon duyarlı ve özel indeksler sunarken 'yeni' fizyolojisini açığa kavuşturmaktadır.

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Gelişmiş karanlık alan mikroskobu ve spektral haritalama ile hiperspektral görüntüleme, geleneksel yöntemlere göre daha hızlı ve doğru bir şekilde histolojik örneklerdeki nano ölçekli malzemelerin taranmasını, lokalizasyonunu ve tanımlanmasını sağlar. Bu makalenin amacı, histolojik örneklerde metal oksit nanopartiküllerinin karanlık alan görüntüleme ve hiperspektral haritalaması için yöntemler sağlamaktır.

Gelişmiş Darkfield Mikroskopi ve Hiperspektral Haritalama ile histolojik Örneklerinde Metal Oksit Nanopartiküller Kimlik

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Öğrenin, dijital damlacık PCR ile adeno ilişkili viral genom miktar tayini için standart bir protokol oluşturun. Bu yöntem, gen terapisi araştırmalarında güvenilirliği artırır.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini (Video) | JoVE Journal

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini

Daha fazla video keşfet