Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Elektroporasyon, yüksek voltajlı elektrik darbeleri vasıtasıyla hücre zarı geçirgenliğini geçici olarak artırır. Kas ve nöronal hücreleri hedef alan elektroporasyona dayalı hızla gelişen birkaç klinik tedavi vardır. Bu nedenle, elektroporasyonun bu uyarılabilir hücrelerin aksiyon potansiyellerini tetikleme yeteneğini nasıl etkilediğini araştırmak çok önemlidir.

Elektroporasyonun uyarılabilir hücreler üzerindeki etkilerini anlamak için in vitro deneyler çok önemlidir. Bununla birlikte, birincil miyositler ve nöronlar, uyarma ve elektroporasyon arasındaki etkileşimi çözmeyi son derece zorlaştıran çok karmaşık bir iyon kanalı ekspresyon profiline sahiptir. Tet-on spiking HEK hücreleri kullanarak aksiyon potansiyeli üretiminde elektroporasyonun neden olduğu değişiklikleri izlemek için bir protokol geliştirdik.

Bu hücreler, onları uyarılabilir kılan minimum sodyum ve potasyum kanallarını eksprese eder. Bu nedenle, bu hücre deneyleri ve elde edilen sonuçların teorik analizini basitleştirdi. Protokolümüzü kullanarak, çok hafif elektroporasyonun hücre kabul edilebilirliğini önemli ölçüde etkileyebileceğini bulduk.

Bu sonuçlar, elektroporasyon ve hücre kabul edilebilirliği ile ilgili teorik modellerin geliştirilmesinin önünü açacak ve bu, toplumun kalp, beyin ve iskelet kaslarında hızla ortaya çıkan elektroporasyon temelli tedavileri geliştirmesine yardımcı olacaktır. Başlamak için, iki kuyulu kapak cam haznesi kızaklarının bir kuyucuğuna bir mililitre PBS pipetleyin. 10 mikrolitre steril, mililitre başına bir miligram poli-L-lizin çözeltisi ekleyin ve bir pipetle iyice karıştırın.

Steril koşullar altında laminer akış başlığında oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe edin, ardından PBS'yi daha fazla yıkamadan poli-L-lizin ile çıkarın. Hücreleri tohumlamak için, 1.5 mililitrelik bir tüpte bir kültür ortamında bir ila 10 seyreltme doksisiklin stok çözeltisi hazırlayın. Şimdi, kültür ortamını T-25 şişesinden çıkarın.

Hücreleri 2.5 mililitre tripsin EDTA çözeltisi ile 37 santigrat derecede bir karbondioksit inkübatörde iki dakika boyunca tripsinize edin. 2,5 mililitre taze kültür ortamı ekleyin ve hücreleri yüzeyden ayırmak için nazikçe pipetleyin. Kültürü oluşturmak için gereken tripsinizlenmiş hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın.

Kültür ortamının hacmini hesaplamak için önceden hesaplanan hücre süspansiyon hacmini 1.470 mikrolitreden çıkarın. Uyarılabilir S HEK hücreleri ile numuneler hazırlamak için, kültür ortamının ve tripsinizli hücre süspansiyonunun hesaplanan hacmini bir oyuğa pipetleyin. 30 mikrolitre doksisiklin seyreltmesi ekleyin.

Hazneleri karbondioksit inkübatörüne yerleştirmeden hemen önce nazikçe pipetleyerek iyice karıştırın. Uyarılmayan NS HEK hücreleri ile numuneler hazırlamak için, hesaplanan kültür ortamı hacmini bir kuyuya pipetleyin ve doksisiklin içermeyen S HEK hücreleri için hesaplanan hücre süspansiyonu hacminin% 90'ını ekleyin. Deneyden iki ila üç gün önce% 5'lik bir karbondioksit inkübatörünü 37 santigrat derecede inkübe edin.

Deneyden önce, üç mikrolitre potansiyometrik boya stoğu çözeltisini 1,5 mililitrelik bir tüpe pipetleyin. Etanolün buharlaşmasını ve potansiyometrik boyanın kurumasını sağlamak için açık tüpü oda sıcaklığında laminer bir akış başlığında yaklaşık 15 dakika bırakın, ardından boyayı 12 mikromolar nihai konsantrasyona çözmek için tüpe dört santigrat derecede 997 mikrolitre soğuk kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, kültür ortamını kuyudan çıkarın.

Hücrelere bir mililitre potansiyometrik boya çözeltisi ekleyin. Hücreleri dört santigrat derecede soğutun ve 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, potansiyometrik boya çözeltisini çıkarın ve bir günde altı ardışık deney için daha fazla yeniden kullanım için bir tüpte saklayın.

Hücreleri tiroz çözeltisi ile üç kez nazikçe yıkayın. Son yıkamadan sonra, bir mililitre düşük potasyumlu tiroz çözeltisini kuyuya pipetleyin. Başlamak için, HEK hücrelerini elektroporasyon için hazırlayın, ardından darbe üretecini tetikleyen mikroskop sisteminden bir TTL sinyali kullanarak darbe iletiminin görüntü elde etme ile senkronizasyonunu yapılandırın.

Odanın dibine, 0.8 milimetre çapında ve iç kenarlar arasında beş milimetre mesafeli iki paralel platin-iridyum tel elektrot yerleştirin. Odayı mikroskop altına sabitleyin, ardından elektrotları darbe üretecine bağlayın. Bir voltaj ve bir akım probu kullanarak, deney sırasında doğru darbe iletiminin doğrulanmasını sağlamak için darbe üretecinin çıkışını bir osiloskopa bağlayın.

Hücreleri parlak alana odaklayın ve elektrotlar arasında ortada bulunan hücreleri görüntüleyin. Hızlandırılmış modda saniyede en az 25 kare hızında 80 görüntü elde edin. Hücreleri 635 nanometrelik bir uyarma dalga boyu ile aydınlatın, maruz kalma süresini 10 milisaniyeye ayarlayın ve emisyonu yaklaşık 700 nanometrede tespit edin.

Satın alma işleminden sonra iki dakika bekleyin. Darbe üreteci arayüzündeki voltajı 63 volta ayarlayın. Her iki dakikada bir aynı şekilde hızlandırılmış çekim kaydedin.

Bu çekimler sırasında, 10. görüntünün alınması sırasında 100 mikrosaniyelik tek bir darbe uygulayın. 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 ve 200 volt darbe voltajlarına sahip görüntüler elde edin. Hücrelerin maruz kaldığı elektrik alanını, uygulanan voltaj-elektrot mesafe oranı olarak tahmin edin.

Veri analizi için, zaman atlamalı kayıtları TIFF formatına aktarın, ardından tek bir deneyden uygulanan voltajların tüm zaman atlamalı kayıtlarını tek bir klasöre yerleştirin. MATLAB'ın elektrik alanını tanıyabilmesi için her zaman atlamalı kaydı yeniden adlandırın. Deneyin başında, hiçbir darbenin uygulanmadığı alım için, 000Vcm ifadesini kullanarak yeniden adlandırın.

Ardından, GitHub'dan indirilen uygulamayı açın. Bir deneyin hızlandırılmış kayıtlarını içeren klasörü seçmek için Veri klasörü seç'e tıklayın. Pikselleri seçmek için, membranların net bir görüntüsü için düşük eşiği ve analizdeki kalıntıları ortadan kaldırmak için yüksek eşiği belirlemek için iki kaydırıcı kullanın.

Şimdi, Verileri analiz et'e tıklayın. Analiz" sekmesinde, çıkarılan parametrelere sahip bir tablo görünecektir. Tablonun sağ tarafında, kullanılan her bir elektrik alanı için zaman içindeki bağıl floresan grafikleri görüntülenecektir.

Tablonun sol tarafında bulunan açılır menüden belirli bir elektrik alanı için grafikleri seçin. Tüm grafikleri inceleyin ve yanlış tepe tespiti durumunda manuel düzeltme yapın. Otomatik olarak algılanan tepe noktalarını temizlemek için Analiz" sekmesinin altındaki "OTOMATİK tepe noktalarını temizle"yi seçin.

Yeni bir zirve zaman noktasını manuel olarak belirlemek için grafiğe tıklayın. Gerekirse, otomatik tepe algılamayı tekrar gerçekleştirmek için Analiz" sekmesinin altındaki "OTOMATİK tepe algılamayı yeniden çalıştır"ı seçin. Çıkarılan parametreler şimdi yeni tepe noktasına ayarlanacaktır.

Daha sonra, verileri bir dotmap dosyası, bir elektronik tablo dosyası ve kullanılan her elektrik alanı için PNG görüntüleri ile aynı klasöre aktarmak için Analiz'in sağ alt köşesindeki "Verileri Dışa Aktar" sekmesini seçin. Santimetre başına 126 voltluk elektrik darbeleri, zaman içinde floresan değişimindeki belirgin salınımların gösterdiği gibi, uyarılabilir hücrelerde çoklu floresan zirvelerini tetikledi. Artan elektrik alan kuvveti ile, yanıt değişti ve santimetre başına 400 voltta sürekli depolarizasyon sergiledi.

Uyarılma yeteneğine sahip olmayan hücreler, en düşük elektrik alan kuvvetlerine yanıt olarak önemli bir tepe noktası sergilemedi, bu da uyarılma olmadığını gösterir. Daha yüksek elektrik alan kuvvetlerinde, uyarılamayan hücreler ayrıca elektroporasyonu gösteren sürekli depolarizasyon sergiledi. Uyarılabilir hücrelerdeki maksimum tepe sayısı, santimetre başına 150 voltta gözlendi ve voltaj bu noktanın ötesine arttıkça tepe sayısında azalma eğilimi oldu.