Name: Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Keşfedin, genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking HEK hücrelerinde elektroporasyonun aksiyon potansiyeli üretimine etkilerini optik izleme ile nasıl incelendiğini. Bu yöntem, uyarılabilir hücrelerdeki membran geçirgenliği değişikliklerini anlamak için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Genetik Olarak Tasarlanmış Spiking HEK Hücreleri Üzerindeki Elektroporasyon Etkilerinin Değerlendirilmesi

<ol><li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+and+electropermeabilization%3A+Mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models.</a> Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).</li>
<li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+technologies+for+medicine%3A+principles%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li>
<li>Kotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based applications in biotechnology.</a> Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).</li>
<li>Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+food+processing+and+biorefinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Memb+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation in food processing and biorefinery.</a> J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).</li>
<li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+field+or+conventional+thermal+ablation+for+paroxysmal+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation.</a> New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).</li>
<li>Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+contractions+and+pain+sensation+accompanying+high-frequency+electroporation+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses.</a> Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).</li>
<li>Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+strong+electrical+shock+on+cardiac+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue.</a> Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).</li>
<li>Batista Napotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+HEK+cells+as+a+valuable+tool+for+studying+electroporation+in+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells.</a> Sci Rep. 14 (1), 720(2024).</li>
<li>McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+controlled+oscillators+in+an+engineered+bioelectric+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+X%22%5BJournal%5D)">Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue.</a> Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).</li>
<li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-based+pooled+screening+yields+improved+far-red+genetically+encoded+voltage+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators.</a> Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).</li>
<li>Sweeney, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+membrane+permeability+induced+by+monopolar+and+high-frequency+bipolar+bursts+of+electrical+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses.</a> Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).</li>
<li>Pakhomov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+plasma+membrane+permeabilization+in+mammalian+cells+by+nanosecond+pulsed+electric+field+%28nsPEF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF).</a> Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).</li>
<li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+ratiometric+optical+mapping+enables+high-resolution+cardiac+electrophysiology+in+pig+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models.</a> Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tüp</td><td>Ratiolab&nbsp;</td><td>5615000</td><td></td></tr><tr><td>2 kuyulu Nunc Lab-Tek II Odacıklı #1.5 Alman Kapak Camı Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>155379 ADP305 Diferansiyel voltaj probu</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AP015 Akım probu</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113903</tr><tr><td>CO2 inkübatörü ve nbsp;</td><td>PHCbi&nbsp;</td><td>MCO -230AICUV</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta yüksek glikoz büyüme ortamı</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)</td><td>Potansiyometrik Problar</td><td>31795</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10131035</tr><tr><td>Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış başlığı</td><td>Iskra Pio&nbsp;</td><td>MC 15-2</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Matematik İşleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin&ndash; streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P07681</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin hidrobromür&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P9155-5MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Darbe üreteci&nbsp;</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>referansa bakın11< / sup</td></tr><tr><td>>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113803</tr><tr><td>T25 25cm ve sup2; Doku kültürü şişesi</td><td>TPP&nbsp;</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Tet-on spiking HEK hücreleri</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu ATCC</td><td>CRL-3479</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu için Gök Gürültüsü Görüntüleyici Canlı Hücre sistemi</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>WavePro 7300A Osiloskop</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking hek hücrelerinde aksiyon potansiyeli Üretiminde elektroporasyona bağlı değişikliklerin İzlenmesi

Monitoring Electroporation-Induced Changes in Action Potential Generation in Genetically Engineered Tet-On Spiking HEK cells

Elektrik darbeleri ile tetiklenen in vitro uyarılabilir hücrelerde TMV'deki değişiklikler bu protokol ile optik olarak izlenebilir ve floresan sinyalleri, ilgili parametrelerini çıkarmak için analiz edilebilir.
Deney düzeneği Şekil 1A'da gösterilmiştir. Deneylerde kullanılan 100 μs'lik tipik bir elektrik darbesi sinyali Şekil 1B'de gösterilmiştir. Mikroskop altına yerleştirilen odacıklardaki hücreler tipik olarak Şekil 1C (parlak alan görüntüsü) ve Şekil 1D'deki (floresan görüntü) hücrelere benzer. Her 2 dakikada bir, aynı hücrelere artan voltajlı bir elektrik darbesinin uygulandığı bir deney yapıyoruz. 2 dakikalık darbe arası sürenin, özellikle belirgin elektroporasyon ile ilişkili olan en yüksek genlikli darbeler kullanıldığında, hücre zarlarının tam olarak yeniden sızdırmaz hale getirilmesine ve geri kazanılmasına izin vermek için yeterince uzun olmayabileceğini unutmayın. Bu nedenle, bakliyatların bazı kümülatif etkileri beklenebilir. Bu kümülatif etkilerden kaçınmak için, darbeler arası gecikme uzatılabilir, ancak test edilen darbe genliklerinin sayısını azaltmak ve hücreleri mikroskopta çok uzun süre tutmaktan kaçınmak pahasına.
Deneylerde floresan görüntüleri yakaladıktan sonra, bunları özel MATLAB uygulamasıyla analiz edin. İlk olarak, piksel eşiklerini belirleyin (Şekil 2A); Düşük eşiği ayarlayarak, hücrelerin etrafındaki zarların (mor renkte) net bir görüntüsünü elde ederiz ve yüksek eşiği ayarlayarak döküntü sinyalini (yeşil) kaldırırız. Uygulama daha sonra, floresan F/F0'daki nispi değişimin zamana bağlı bir sinyalini elde etmek için iletilen her ardışık darbe için tüm eşik piksellerinin ortalama floresan yoğunluğunu belirler. Bu sinyal, hiçbir darbenin uygulanmadığı kontrol hızlandırılmış kaydından belirlenen F'nin doğrusal azalmasının eğiminin çıkarılmasıyla boya fotoağartması için düzeltilir (Şekil 2B). Sinyali düzelttikten sonra, yanıtların parametreleri bir uygulama içi tablo ve düzeltilmiş floresan sinyalinin bir grafiği şeklinde çıkarılır (Şekil 2C). Nadir durumlarda, algoritma belirgin bir tepe noktası algılamaz veya sahte gürültü sinyallerini yanlış pozitifler olarak algılar. Bu durumlar için, kullanıcı, floresan sinyalindeki ilgili noktayı bir tepe noktası olarak manuel olarak seçme veya tespit edilen yanlış tepe noktasını kaldırma seçeneğine sahiptir (Şekil 2D-elektrik darbesi uygulanmadan önce anormal bir şekilde tespit edilen küçük bir tepe noktasının çıkarılması).
MATLAB uygulamasını kullanarak, hem uyarılabilir S-HEK (Şekil 3A) hem de uyarılamayan NS-HEK hücrelerinde (Şekil 3B) elektrik darbelerine TMV yanıtlarının görüntülerini elde edebiliriz. Aşağıdaki yanıt parametreleri çıkarılır (Tablo 1<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig02v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig03v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig03large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be ...

monitoring-electroporation-induced-changes-action-potential

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Tek hücreli elektroporasyon (SCE), in vivo hazırlıkları da dahil olmak üzere sağlam doku içindeki tek tek hücrelerin içine DNA veya diğer makromoleküller teslim sağlayan özel bir tekniktir. Xenopus laevis larva bozulmamış beyin içinde nöronların bir floresan boya veya plazmid DNA SCE için burada ayrıntılarıyla prosedür.

Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Kaynak: Keener, D. G., et al. Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü İnhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültüründe Tek Hücreli Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. (2020).Bu video, fare hipokampal dilim kültürleri içindeki nöronlara plazmit DNA'yı sokmak için tek hücreli elektroporasyon sürecini göstermektedir. Prosedür, nöronal zarı geçici olarak geçirgen geçirgen hale getirmek ve gen transferini kolaylaştırmak için hassas pipet konumlandırma, basınç ayarlamaları ve elektroporasyon...

Fare Hipokampal Dilim Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon Yoluyla Gen İfadesi

Bu videoda, bir floresan raportör ile kaynaşmış ışığa bağımlı iyon kanalı proteinlerini ifade eden embriyonik böbrek hücresi kültürleri, ışığın iyon hareketi üzerindeki etkisini göstermektedir. Tüm hücre yama kelepçesi, iyonların hareketini izlemek için kullanılır.

Işığa Bağımlı İyon Kanallı Hücrelerin Optogenetik Elektrofizyoloji Kaydı

Bu sunum, hücreler iletken ve şeffaf indiyum-kalay oksit ile kaplanmış bir slayt üzerinde büyürken, hücreler arası, kavşak iletişiminin incelenmesi için yapışık, kültürlenmiş hücrelerin elektroporasyonunun kullanıldığı bir yöntemi göstermektedir.

Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

Elektroporasyon, saflaştırılmış bakteriyel virülans efektör proteinlerini doğrudan canlı ökaryotik hücrelere yerleştirmek için kullanıldı. Protein lokalizasyonu konfokal immünofloresan mikroskopi ile izlendi. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerde heterolog ekspresyon ihtiyacını ortadan kaldırarak, aktif eksojen proteinleri kullanarak kaçakçılık, fonksiyon ve protein-protein etkileşimleri üzerine çalışmalara izin verir.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri kullanılarak zar potansiyelindeki değişiklikleri görüntülemek için bir yöntem açıklanmıştır.

Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Bu protokol, çip üzerinde laboratuvar, mikroakışkan elektroporasyon cihazı oluşturmak için gereken mikrofabrikasyon tekniklerini açıklar. Deney düzeneği, sürekli bir akışta kontrollü, tek hücre düzeyinde transfeksiyonlar gerçekleştirir ve popülasyon tabanlı kontrol ile daha yüksek verimlere genişletilebilir. Hücre zarı geçirgenliğinin derecesini gerçek zamanlı olarak elektriksel olarak izleme yeteneğini gösteren bir analiz sağlanmıştır.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

Gözenekli substrat elektroporasyonu (PSEP), tutarlı, yüksek verimli iletimi yüksek hücre canlılığı ile eşleştirir. Transepitelyal elektrik empedans (TEEI) ölçümlerinin tanıtılması, PSEP'in ara süreçleri hakkında bilgi sağlar ve etiketsiz teslimata olanak tanır. Bu makalede, PSEP dağıtım deneylerini ve TEEI ölçüm analizini aynı anda gerçekleştirmek için bir yöntem tartışılmaktadır.

Transepitelyal Elektriksel Empedans İzleme ile Gözenekli Substrat Bazlı Elektroporasyon

Keşfedin, genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking HEK hücrelerinde elektroporasyonun aksiyon potansiyeli üretimine etkilerini optik izleme ile nasıl incelendiğini. Bu yöntem, uyarılabilir hücrelerdeki membran geçirgenliği değişikliklerini anlamak için değerli bir araç sunar.

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi (Video) | JoVE Journal

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Daha fazla video keşfet