İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi
18 Ekim 2024
Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.
Nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin miktar tayini için gerçek zamanlı bir mikroskopi yöntemi geliştirdik. Bu NET'ler doğuştan gelen bağışıklık savunmasında önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, dokularda NET birikiminin çoklu inflamatuar ve otoimmün hastalıkların patofizyolojisine katkıda bulunduğu anlaşılmıştır.
NET'lerin patolojik etkileri nedeniyle, NETosis antagonistlerinin geliştirilmesine olan ilgi artmıştır. NETosis inhibisyonunu incelemek için, insan NET salınımının nicelleştirilmesi için gerçek zamanlı bir mikroskopi yöntemi geliştirdik ve bu da NETosis'i ve inhibisyonunu yüksek verimli bir şekilde incelememize olanak tanıdı. Nötrofiller hassas hücrelerdir ve mekanik, mikrobiyal ve diğer stres türleri nedeniyle saflaştırma işlemi sırasında uyaranlara tepkilerini değiştirebilirler.
Bu nedenle, nötrofil aktivasyonunu en aza indirmek için nötrofil izolasyon protokolünü doğrulamak önemlidir. Dolayısıyla bu teknik, hem sağlıklı hem de hastalıklı bireylerden NET salınımının incelenmesini sağlar. Ek olarak, farklı fizyolojik uyaranların neden olduğu NET oluşumunun kinetiğini incelememize izin verir.
Bu yüksek verimli mikroskopi tekniği ile, sitrüline histonlar 2A ve 4'ü hedefleyen bir monoklonal antikor olan NETosis antagonisti CIT-013'ün bir IC 50 veya 4.6 nanomolar ile NET salınımını etkili bir şekilde inhibe edebildiğini gösterebildik. Bu, bu testin NETosis Antagonistlerini test etmek için uygun olduğunu göstermektedir. Sağlıklı gönüllüden periferik kanı bir lityum heparin tüpünde topladıktan sonra, kanı 50 mililitrelik taze bir tüpe aktarın.
Lityum heparin tüpünü DPBS ile durulayın ve aynı 50 mililitrelik tüpe aktarın, böylece kanın DPBS oranının 1: 1 olduğundan emin olun. Karıştırdıktan sonra, yoğunluk gradyan çözeltisinin üzerine seyreltilmiş kan ekleyin. Kanı 400 G'de 40 dakika boyunca minimum hızlanma ve kırılma ile santrifüj edin.
Üst plazma katmanını 10 mililitrelik bir pipetle atın. Ardından, periferik kan mononükleer hücrelerini ve yoğunluk gradyan çözeltisini atmak için plastik bir pastör pipeti kullanın. Eritrosit ve nötrofil içeren tabakayı 15 mililitre DPBS'de tekrar süspanse etmeden önce hafifçe çalkalayın.
25 mililitre %6 dekstran ve %0.9 sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve tüpü ters çevirerek karıştırın. 25 dakikalık inkübasyondan sonra, üst nötrofil tabakasını 10 mililitrelik bir pipet ile 50 mililitrelik taze bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için tüpü boşaltın ve peleti 10 mililitre amonyum klorür potasyum lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
Aynı lizis tamponundan 40 mililitre ekleyin ve çözelti yarı saydam hale gelene kadar tüpü sürekli olarak ters çevirirken oda sıcaklığında inkübe edin. Tüpü 350 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, yavaşça ve damla damla olarak, nötrofilleri süspansiyona getirmeden nötrofil peletinin üzerine% 10 olmak üzere beş mililitre kültür ortamı ekleyin.
Nötrofil peletinin üzerinde bulunan eritrositlerin çoğu kültür ortamında yeniden süspanse edilene kadar tüpü hafifçe döndürün. Süpernatanı çıkardıktan sonra, nötrofil peletini 10 mililitre kültür ortamında yeniden askıya alın,% 10 Tamamen yeniden askıya alındıktan sonra,% 50 mililitreye kadar kültür ortamı% 10 ekleyin ve peleti 10 mililitre Nötrofil Hücre Dışı Tuzak veya NET tahlil tamponunda yeniden askıya almadan önce karışımı santrifüjleyin. Başlamak için, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna% 0.001 Poli-L-lizin çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.
Kuyuları 200 mikrolitre DPBS ile üç kez yıkayın ve kuyuları havayla kurutun. Ardından, Nötrofil Hücre Dışı Tuzak veya NET tahlil tamponunda gerekli sayıda nötrofili yeniden askıya alın. NET tahlil tamponunda dört kez konsantre DNA boyasını her bir oyuğa aktarın.
NET tahlil tamponunda ilgili kuyucuklara dört kez konsantre NETosis uyarısı ekleyin. Daha sonra, NET tahlil tamponunda dört kez konsantre NETosis antagonistleri ve nötrofil süspansiyonunu karşılık gelen kuyucuklara ekleyin. Plakayı 100 G'de iki dakika santrifüjleyin.
Ardından, plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirilmiş canlı hücre mikroskobu analiz sistemine yerleştirin. Nötrofil süspansiyonu içeren 96 oyuklu görüntüleme plakasını canlı hücre mikroskobu analiz sistemine yerleştirdikten sonra sistem yazılımını açın. Almak için programla'ya tıklayın ve başlatmak için artı düğmesine tıklayın.
Ardından, programa göre tara'yı seçin ve ileri'ye tıklayın. Sıfırdan yeni bir gemi oluşturmak için, gemi oluştur bölümünde yeni'yi seçin ve ileri'ye tıklayın. Scan Type (Tarama Türü) bölümünde, Standard (Standart) seçeneğini belirleyin ve Next (İleri) düğmesini tıklatın.
Tarama ayarlarını hücre hücre seçin, yok. Görüntü kanalları, yeşil faz kontrastı. Çekim süresi, 100 milisaniye ve objektif 20x.
Ardından İleri'ye tıklayın. Gemi Seçimi bölümünden, taranacak uygun tekne tipini seçin ve İleri'ye tıklayın. Teknenin çekmecedeki konumunu belirtin ve İleri'ye tıklayın.
Tarama Modeli bölümünde, taranması gereken kuyucukları ve kuyu başına görüntü sayısını seçin. Sonrakine tıkla. Gemi Not Defteri bölümünde, gemi hakkında bilgi verin.
Plaka adını girin ve İleri'ye tıklayın. Analysis Setup (Analiz Ayarı) bölümünde, analizi daha sonraya ertele'yi seçin ve Next'e (İleri) tıklayın. Tarama Zamanlaması bölümünde, belirli aralıklarla taramalarla yeni zamanlama oluştur'u seçin ve Taramaları Zamanlamaya Ekle bölümünde bir saat seçin.
İlk taramadan beş saat sonra Taramayı durdur'u seçin. Tarama bilgilerinin ne zaman doğru olduğunu planlamak için İleri'ye tıklayın ve Ekle'ye tıklayın. Nötrofillerin faz kontrastı ve immünofloresan görüntülerini aldıktan sonra, canlı hücre mikroskobu analiz yazılımını başlatın.
Görünümden, analiz edilecek canlı hücre mikroskobu deneyini seçin. Create New Analysis Definition (Yeni Analiz Tanımı Oluştur) seçeneğini seçin ve Next (İleri) düğmesini tıklatın. Daha sonra Analiz Türü kısmından temel çözümleyiciyi seçiniz ve Next'e tıklayınız.
Görüntü Kanalı bölümünde yeşili seçin, fazın seçimini kaldırın ve İleri'ye tıklayın. Görüntü katmanları penceresini açın, yeşili seçin ve fazın seçimini kaldırın. Yeşil bölümde otomatik ölçeklendirmeyi kapatın ve minimum ve maksimum değerleri el ile ayarlayın.
Ardından gemi tarama süreleri penceresini açın ve NET'lerle pozitif kontrol kuyularını temsil eden görüntüleri seçin. Analiz tanımı ayarları penceresini açın ve nesne adı için NET'leri yazın. Segmentasyon için Uyarlanabilir'i seçin.
GCU eşiği için üç ile beş arasında bir seçim yapın ve Kenar Bölme Açık'ı eksi 10 ile sıfır arasında ayarlayın. Ardından, temizleme için 100 mikrometre kareye kadar Delik Doldurma'yı seçin ve boyutu eksi bir piksel olarak ayarlayın. Filtrelerden 200 mikrometre kareden büyük alan, Ortalama Yoğunluk 24.6'dan az ve Entegre Yoğunluk 7.000'den büyük seçin.
Ardından, ayarları uygulamak için geçerli önizleme'yi veya tümünü önizleme'yi tıklayın. Farklı NET yapılarının üzerine gelin ve yanlış pozitif ve yanlış negatif NET'lerde ince ayar yapmak için analiz ayarlarını yapın. NET çözümlemesi için ayarlar doğru olduğunda, İleri'yi tıklatın.
Tarama süreleri ve kuyu bölümünde analiz edilecek zaman noktalarını ve kuyuları seçiniz ve Next'e tıklayınız. Analiz Tanımını Kaydet ve Uygula kısmına tanım adını girin ve İleri'ye tıklayın. Analiz bilgileri doğrulandıktan ve doğru olduğundan Son'a tıklayın.
İlgilendiğiniz gemideki analize tıklayarak deney analizini açın. Ardından, grafik ölçümleri penceresini açın. Ardından, bir metrik oluşturmak için artı düğmesini tıklayın.
Verileri yüzde NET birleşmesi olarak sunarken, Ölçüm bölümünde Alan'ı seçin ve Değer bölümünde Birleşme'yi seçin. Verileri NETting nötrofillerin yüzdesi olarak sunarken, Metrik bölümünde Nesne Sayısı'nı seçin ve Değer bölümünde Görüntü başına'yı seçin. Ölçüm ayarlarını yapılandırdıktan sonra, kullanıcı tanımlı Ölçümler bölümünde NETs Area Confluence veya NETs Object Count Per Image (Görüntü Başına NET Nesne Sayısı) öğesini seçin.
Sırasıyla Select Scans (Taramaları Seç) ve Select Well (Kuyu Seç) bölümlerinden analiz için gerekli tüm zaman noktalarını ve kuyuları seçin. Son olarak, Verileri Dışa Aktar'ı tıklayın. Kalsiyum iyonofor stimülasyonu, PMA'ya kıyasla daha hızlı NETosis'i indükledi ve bu da NET'leri serbest bırakan nötrofillerin daha yüksek bir oranıyla sonuçlandı.
Kalsiyum iyonoforlar tarafından indüklenen NET'ler, nötrofil plazma zarının ötesinde daha yaygınken, PMA ile indüklenen NET'ler nötrofil plazma zarına daha yakın kaldı. Nötrofiller kaplanmış bağışıklık kompleksleri, FMLP ve monosodyum ürat kristalleri ile aktive edildiğinde yüksek NET seviyelerine doğru bir eğilim gözlenmiştir. NET salınımı, bir 23187'ye yanıt olarak, 4.6 nanomolar'lık bir yarı maksimum inhibitör konsantrasyonda CIT-013 tarafından tamamen inhibe edildi.
Genel Bakış
Bu çalışma, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve nicellemek için gerçek zamanlı bir mikroskopi yöntemi sunmaktadır, bu da doğuştan gelen bağışıklık savunmasını ve enflamatuar hastalıklardaki NET'lerin rolünü anlamak için çok önemlidir. Geliştirilen protokol, NET oluşumunun ve NETozis antagonistlerinin etkilerinin yüksek verimli analizini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Doğuştan gelen bağışıklık savunması
- Nötrofil biyolojisi
- Enflamatuar ve otoimmün hastalıklar
Arka Plan
- NET'ler, çeşitli hastalıkların bağışıklık tepkileri ve patofizyolojisine katkıda bulunur.
- Nötrozis antagonistlerine patolojik etkileri nedeniyle artan ilgi.
- Nötrofil izolasyon protokollerinin aktivasyonu en aza indirgemek için optimize edilmesinin önemi.
Kullanılan Yöntemler
- Yüksek verimli gerçek zamanlı mikroskopi
- Biyolojik sistem olarak insan nötrofilleri
- NET salınımı ve inhibisyonunu test etmek için testler
Ana Sonuçlar
- CIT-013 tarafından NET salınımının 4.6 nanomolarlık bir IC50 değeri ile etkili bir şekilde inhibisyonunun gösterilmesi.
- NET salınımı kinetikleri ve antagonistlerin farmakolojisinin değerlendirilmesi için tekrarlanabilir bir yöntemin kurulması.
- NETozis inhibitörlerini test etmek için testin doğrulanması.
Sonuçlar
- Bu çalışma, NET salınım mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunan bir yöntemi göstermektedir.
- NET'leri içeren hastalıklara karşı terapötik stratejiler geliştirmek için önemli potansiyele sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative, high-throughput microscopy for NETosis enables robust target validation and pharmacological profiling of NETosis antagonists in early discovery. This platform addresses the need for standardized, reproducible assessment of NET release kinetics and antagonist efficacy, directly impacting inflammatory and autoimmune disease portfolios. Real-time, semi-automated analysis supports predictive confidence and de-risks advancement of NET-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of NETosis mechanisms and antagonist effects in human neutrophils.
- Supports functional target validation by quantifying NET release in response to disease-relevant and non-physiological stimuli.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing NETs from non-netting activated neutrophils.
- Provides quantitative IC50 data for antagonist potency, informing portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, semi-automated quantification of NET release for scalable compound screening.
- Standardizes assay conditions and readouts, improving reproducibility across experiments and teams.
- Generates robust, quantitative outputs (e.g., NET area confluence, object count) for reliable compound evaluation.
- Enables screening of NETosis antagonists against multiple stimuli and disease-relevant triggers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns NET quantification with disease-relevant stimuli, supporting translational biomarker strategies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by using primary human neutrophils from healthy and diseased donors.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for NET-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This real-time microscopy method integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation for NETosis-targeted programs.
- Discovery Biology: Provides quantitative hypothesis testing and pathway clarification for NETosis mechanisms.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for high-throughput antagonist evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative metrics (NET area, object count, IC50) to compare antagonist efficacy and NET release kinetics.
- Translational Research: Connects in vitro NET quantification to disease-relevant triggers and patient-derived samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for NETosis research and pharmacology across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in NETosis-targeted discovery.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability for NET quantification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust pharmacological data early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of NETosis antagonist candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neutrophil isolation and live-cell microscopy analysis.
- Needs access to high-content imaging platforms and compatible analysis software.
- Demands cross-team standardization of assay setup and analysis parameters.
- Adaptable to both healthy and diseased donor samples for broader translational relevance.
- Dependent on careful validation of neutrophil purity and activation state to ensure data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:48
Neutrophil Isolation from Human Peripheral Blood for Assessing Pharmacology of NETosis Antagonists
4:25
Optimized Assay for NETosis Analysis Using Multiple 96‐Well Imaging Plates with Stimuli and Antagonists
5:37
Configuring Live Cell Microscopy Analysis System Software for the Phase Contrast and Immunofluorescence Imaging of Neutrophils
7:27
Analyzing Neutrophil Extracellular Trap (NET) Formation Using Live Imaging Microscopy Software
