Name: Optogenetik Allosterik Regülasyon Yoluyla Protein Aktivitesinin Uzay-Zamansal Kontrolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Keşfedin optogenetik allosterik regülasyon yöntemiyle Src kinaz aktivitesinin uzay-zamansal kontrolünü. Bu yöntem, hücre sinyalleşme dinamiklerini ve yönlü hücre hareketini incelemek için tersinir, ışıkla düzenlenebilir protein fonksiyonları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Işık Ayarlı Allosterik Anahtar Kullanılarak Enzim Aktivitesinin Optogenetik Kontrolü

<table><tbody><tr><td># 1.5 Cam Lamel 25 mm Yuvarlak</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>64-0715&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Tüpler&nbsp;</td><td>ABD Bilimsel&nbsp;</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr>500 mL için<td>2x Laemmli Tampon</td><td></td><td></td><td>: 5.18 g&nbsp; Tris-HCL, 131.5 mL gliserol, 52.5 mL %20 SDS, 0.5 g bromofenol mavisi, son pH 6.8</td></tr><tr><td>%4-20 Mini-PROTEAN TGX Prekast Jel</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Tampon&nbsp;</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>60 LED Mikroskop Halka Işık</td><td>Boli Optik</td><td>ML46241324</td><td>Mavi LED, 60 mm çap, 5 W</td></tr><tr><td>Agaroz&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ERK 1/2 Antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Antikor</td><td>invitrojen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry Antikoru</td><td>invitrojen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MEK</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p130Cas</td><td>BD Biosciences</td><td>610271</td><td></td></tr><tr><td>Anti-paxillin</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-Erk 1/2 T202 / Y204 Antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-pY249 p130Cas</td><td>Hücre Sinyali</td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-Y118 Paxillin</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2541</td><td></td></tr><tr><td>Anto-fosfo-S217 / 221 MEK</td><td>Hücresi Sinyalizasyon</td><td>9121</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uyumlu Güç Kaynağı</td><td>Kurumsal Bilgisayar</td><td>LJH -186</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno Rev3</td><td>Arduino</td> <td>& lrm; </td><td></td>A000066</tr><tr><td>Attofluor Hücre Odası</td><td>invitrojen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Fetal Sığır Serumu (FBS)&nbsp;</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>Isı ile İnaktive Edilmiş Üçlü 0.1 ve mikro; m steril filtreli&nbsp;</td></tr><tr><td>bRaf-V600E-Dr</td><td>. John O'Bryan'dan</td>Venüs <td></td><td></td> Hediyesi, MUSC</tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>A-420&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin (Disodyum)</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Koyu Kırmızı plazma membran boyası</td><td>invitrojen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Koloni Ekranı MasterMix&nbsp;</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a yetkin hücreler&nbsp;</td><td>NEB&nbsp;</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNA Merdiveni&nbsp;</td><td>AltınBiyo&nbsp;</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP'ler&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1 Enzimi&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, Cleland Reaktifleri&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros&nbsp;</td><td></td><td></td>409910250</tr><tr><td>FastLightR-bRaf-mVenüs</td><td>Addgene</td> <td># 162155</td><td></td></tr><tr><td>Sığır plazmasından fibronektin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Transfeksiyon Reaktifi&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Jel Yeşil Nükleik Asit Boyası&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Jel Yükleme Boyası Mor 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Jel ekstraksiyon Kiti</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td>K0692</td><td>Jel Ekstraksiyon Kiti&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneJET Plazmid Miniprep Kiti</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>HEK 293T Hücreleri&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Hücreleri&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Iot Röle</td><td>Dijital Kaydediciler</td><td>DLI 705020645490</td><td>Aydınlatma için AC / DC kontrol rölesi</td></tr><tr><td>Kanamisin Monosülfat</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-045-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB Ağar&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LED Grow Işık Sistemi</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td>LED panel lamba sistemi&nbsp;</td></tr><tr><td>LightR-bRaf-mVenüs</td><td>Ekle</td><td>#162154</td><td></td></tr><tr><td>LightR-iCre-miRFP670</td><td>Ekle</td><td>#162158</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2024a</td><td>CellGEO Komut Dosyalarını çalıştırmak için yazılım</td></tr><tr><td>Metamorf</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Görüntüleme Analiz</td></tr><tr><td>Yazılımı MgCl2&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Madeni Yağ</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>Mini Hazırlık Seti&nbsp;</td><td>Gen Seçimi&nbsp;</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Prekast Jeller 12 kuyulu</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Biyoloji Sınıfı Su&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>46-000-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Çok Bantlı Polikroik Ayna</td><td>89903BS</td><td>Chroma</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>S271-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS, Ca ve Mg&nbsp'siz;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-iCre</td><td>Addgene</td><td>#89573</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry</td><td>Addgene</td><td>#122963</td><td></td></tr><tr><td>pCEFL-ERK2</td><td></td><td></td><td>Dr. Channing Der'in Laboratuvarından Hediye, UNC</td></tr><tr><td>PCR Tüpleri&nbsp;</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0,2 mL 8 şeritli tüpler ve kapaklar, sert şerit ayrı ayrı takılan kubbe kapakları&nbsp;</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA</td><td>Polimeraz Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>pmiRFP670-N1</td><td>Addgene</td> <td># 79987</td><td></td></tr><tr><td>Polygon 400 Desenli Aydınlatıcı</td><td>Mightex</td><td>DSI-G-00C</td><td></td></tr><tr><td>Astarlar&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membranlar</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF / Filtre Kağıdı Sandviçleri&nbsp;</td></tr><tr><td>T0.25% Tripsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodyum</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Asetat-EDTA (TAE) 50x&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP1332-1&nbsp;</td><td>Elektroforez için&nbsp;</td></tr><tr><td>UPlanSApo 40x Mikroskop Objektif</td><td>Olympus</td><td>1-U2B828</td><td></td></tr><tr><td>USB TTL Kutusu</td><td>Ulusal Aletler</td><td>6501</td><td>TTL arayüzü için</td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

optogenetik allosterik regülasyon yoluyla protein aktivitesinin uzay-zamansal kontrolü

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

LightR-Src, Şekil 1A,B'de açıklanan stratejiye göre tasarlanmış ve üretilmiştir. LightR-Src'nin biyokimyasal analizi, 60 dakikalık sürekli aydınlatmada mavi ışığa yanıt olarak bilinen endojen Src substratlarının, p130Cas (Y249)22 ve paxillin (Y118)23'ün fosforilasyonuna erişir (Şekil 2B). Özellikle, LightR-Src, transfeksiyondan sonra 16-18 saat boyunca sadece karanlıkta eksprese edildiğinde, Src kinazın arka plan aktivasyonu gözlenmez. Ayrıca, D388R mutasyonuna sahip LightR-Src'nin katalitik olarak aktif olmayan mutantı, Src substratının fosforilasyonunu indüklemez, bu da fosforilasyonun aktif LightR-Src tarafından gerçekleştirildiğini ve mavi ışık aydınlatmasının spesifik olmayan etkisinden kaynaklanmadığını gösterir (Şekil 2B). Canlı hücrelerde Src27 kinazın salınım aktivitesinin raporlarını kabul ederek, LightR-Src'nin döngüsel aktivasyon sergileyecek şekilde ayarlanıp ayarlanamayacağını araştırdık. Orijinal LightR-Src, yavaş devre dışı bırakma kinetiği gösterdi (Şekil 2C), bu da her iki VVD'de de I85V mutasyonunu barındıran yeni bir varyant olan Fast-LightR-Src'nin üretilmesine yol açtı. Şekil 2D, Fast-LightR-Src'nin belirgin şekilde daha hızlı devre dışı bırakma kinetiği gösterdiğini ve LightR-Src için bir saatten fazla olan ışığı kapattıktan sonraki 10 dakika içinde tamamen devre dışı bıraktığını göstermektedir. FastLightR-Src kullanarak, tekrarlanan aktivasyon / inaktivasyon döngüleri de elde edebildik (Şekil 2E). Bu sonuçlar toplu olarak, LightR aracının canlı hücrelerde Src aktivitesinin spesifik ve sıkı bir şekilde kontrol edilen düzenlemesini sağlama yeteneğini göstermektedir.
FastLightR-Src uygulaması, geçici Src aktivasyonunun hücre morfodinamiği üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine de izin verir. HeLa hücrelerinde FastLightR-Src'nin aktivasyonu, hücre yayılmasını indükler ve bu işlem, FastLightR-Src inaktive edildiği anda durur. Aktivasyon üzerine, FastLightR-Src'nin perinükleer bölmeden fokal adezyonlara ve plazma membranına translokasyonunu gözlemledik, bu vahşi tip Src kinaz11,12 tarafından sergilenen bir davranış. Katalitik olarak inaktif mutant D388RLightR-Src'yi eksprese eden aydınlatıcı hücreler bu tür yayılma etkilerini gösteremez (Şekil 3B,C). Bu ayrıca, FastLightR-Src'nin vahşi tip muadili ile benzer şekilde çalıştığını doğrular. Bir hücre bölgesinin lokal olarak aydınlatılması, fokal yapışmada lokal birikim LightR Src ile gösterilen ve lokal membran çıkıntılarının oluşumu (Şekil 4B (i), (ii)) ve hücre merkezi kayması (Şekil 4C (i), (ii)) ile birlikte FastLightR-Src'nin lokalize aktivasyonu ile sonuçlanır ve bu da hücrenin ışığa doğru hareketine neden olur. Src kinazın düzenlenmesi için LightR aracının uygulamasını kurduktan sonra, LightR'nin bRaf kinaz ve DNA rekombinaz Cre'nin düzenlenmesine kadar uzanan geniş kapsamlı yardımcı programını sergiliyoruz. LightR-bRaf analizi, bRaf, MEK1'in endojen substratının ışık kaynaklı fosforilasyonunu ve yapısal olarak aktif bRaf mutantının (V1E) ile karşılaştırılabilir seviyelerdeERK24,25 24,25'in aşağı akış fosforilasyonunu gösterir (Şekil 5A). Tersine, katalitik olarak aktif olmayan D575RLightR-bRaf, aydınlatılmamış LightR-bRaf örnekleriyle karşılaştırılabilir hiçbir MEK1 ve ERK1/2 fosforilasyonu göstermez, böylece LightR-bRaf düzenlemesinin özgüllüğünü doğrular. Canlı hücre görüntüleme, tekrarlanan FastLightR-bRaf aktivasyon / inaktivasyon döngülerinin, bRaf aktivasyonunun28 bilinen sonuçlarıyla doğrulayarak, ERK2'nin çekirdeğin içine ve dışına tekrarlanan translokasyonunu indüklediğini gösterdi (Şekil 5B). LightR-Cre'nin aktivasyonu, LightR'nin farklı enzim sınıflarına uygulanabilirliğini gösteren bir raportör mCherry geninin başarılı bir şekilde rekombinasyonu ile sonuçlanır (Şekil 5C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig01.jpg"> 
Şekil 1: LightR yaklaşımının geliştirme stratejisi. (A) Karanlık durumdaki (PDB: 2PD7) iki Canlı monomerin ve aydınlık durumdaki dimer (PDB: 3RH8) kristal yapıları. (B) LightR tasarımının karikatür temsili. Katalitik alana yerleştirilen iki tandem bağlı VVD fotoreseptörü, karanlıkta proteinin katalitik aktivitesini bozar. Mavi ışığa tepki olarak VVD'nin dimerizasyonu protein aktivitesini geri kazandırır. (C) (i) Src (PDB 1Y57) ve (ii) bRaf (PDB 4MNF) katalitik alanlarının kristal yapıları. (ii) Cre rekombinazın yapısı (PDB 1MA7). Sarı oklar LightR yerleştirme bölgesini gösterir ve ikame edilmiş amino asidi gösterir. (D) LightR alanının bir hedef enzim dizisine eklenmesi için klonlama stratejisinin şematik diyagramı19. Adım 1'de, yerleştirme bölgesinden önce ve sonra hedef gende tavlama bölgeleri ile çevrili bir LightR fragmanının PCR sentezi için özel olarak tasarlanmış primerler kullanılır. Adım 2'de, bu şekilde üretilen LightR fragmanının, LightR'nin Hızlı değişim bölgesine yönelik mutajenez ile hedef enzim genine eklenmesi için bir "megaprimer" olarak kullanıldığı gösterilmiştir. Paneller A-C, Shaaya ve ark.10'un izniyle uyarlanmış ve değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig02.jpg"> 
Şekil 2: Tasarlanmış LightR-Proteinlerinin biyokimyasal karakterizasyonu. (A) LightR Src'nin Biyokimyasal karakterizasyonu için deneysel protokolün şematik gösterimi. (B) C-terminalinde bir mCherry ve bir myc etiketi taşıyan LightR Src yapısını geçici olarak ifade eden LinXE hücreleri, 465 nm'lik bir LED kurulumu kullanılarak 60 dakika boyunca sürekli olarak mavi ışıkla aydınlatıldı. Hücre lizatları, Src substratları, paxillin ve p130Cas'ın fosforilasyonu için problandı. Western Blot sonuçları, canlı hücrelerde LightR-Src'nin aktivasyonuna yanıt olarak endojen paxillin ve p130Cas'ın fosforilasyonunu göstermektedir. (C,D) C-terminalinde tandem mCherry-myc etiketini taşıyan belirtilen LightR-Src yapılarını geçici olarak ifade eden LinXE hücreleri, belirtilen süreler boyunca (0 dakika ve 30 dakika) sürekli olarak mavi ışığa maruz bırakıldı ve daha sonra belirtilen süreler boyunca karanlıkta bırakıldı. Hücre lizatları, (C) LightR-Src ve (D) FastLightR-Src arasındaki aktivasyon ve deaktivasyon kinetiğinin karşılaştırmasını gösteren Src substratlarının fosforilasyonu için incelendi. (E) C-terminalinde tandem mCherry-myc etiketi taşıyan belirtilen LightR-Src yapılarını geçici olarak ifade eden LinXE hücreleri, 20 dakika boyunca sürekli olarak mavi ışığa maruz bırakıldı, ardından karanlıkta 10 dakika ve ışıkta 20 dakika boyunca tekrarlanan inkübasyon yapıldı. Hücre lizatları toplandı ve Src substratlarının fosforilasyonu için araştırıldı, bu da aktivasyon ve inaktivasyon durumları arasındaki Src kinaz döngüsünün etkinliğini gösterdi. Tüm deneyler benzer sonuçlarla en az üç kez tekrarlandı. Her bir batı leke paneli B-E'nin yanında görüntülenen sayılar, kilodalton (kDa) cinsinden ölçülen proteinlerin moleküler ağırlıklarını temsil eder. Paneller B-E, Shaaya ve ark.10'un izniyle uyarlanmış ve değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig03v3.jpg"> 
Şekil 3: Küresel ve zamansal aydınlatma kontrolü ve FastLightR-Src aktivitesi üzerindeki etkisi. (A) Küresel ve zamansal döngüsel aydınlatmanın deneysel şemasının karikatür temsili ve müteakip veri analizleri. (B,C) Hücre morfolojisinin düzenlenmesi ve FastLightR-Src lokalizasyonunun mavi ışıkla yapılması, geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış bir seriden elde edilen HeLa hücrelerinin temsili görüntülerinde gösterilmiştir. Bu hücreler, Stargazin-iRFP670 (plazma zarı işaretleyicisi) ile birlikte FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 hücre) veya katalitik olarak inaktif D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 hücre) ile birlikte geçici olarak birlikte eksprese edildi. Canlı hücre görüntülemesi her dakika gerçekleştirilirken, hücreler küresel olarak mavi ışıkla (mavi ana hatlar) aydınlatıldı. (B) Sarı oklar, fokal yapışıklıklara benzeyen yapılarda FastLightR-Src lokalizasyonunu vurgular. Görüntüler, geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış bir dizi HeLa hücresinden elde edildi. (C<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig05large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%204.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%205.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%202_Updated.zip" target="_blank"></a>

Optogenetik Allosterik Regülasyon Yoluyla Protein Aktivitesinin Uzay-Zamansal Kontrolü

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most ...

spatiotemporal-control-protein-activity-through-optogenetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Işık tarafından küçük GTPaz aktivitesinin yerleşim-zaman kontrolü için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, rapamisin indüklenen FKBP-FRB heterodimerization ve foto-kafes sistemleri dayanmaktadır. Işık ışınlama Optimizasyonu Subselüler düzeyindeki küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon sağlar.

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Burada, foto-reaktif doğal olmayan bir amino asidi, kültürde veya in vivo nöronlarda eksprese edilen bir hedef nöronal proteine genetik olarak kodlayarak kısa bir ışık darbesi ile bir nöronal proteini seçici olarak aktive etmek için bir prosedür sunulmaktadır.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.

T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Bu protokol, PhyB ve PIF3 kullanarak kırmızı ve uzak kırmızı ışıkla gen ekspresyonunu kontrol etmek için optogenetik deneylerin nasıl yapılacağını açıklar. Gen ekspresyonunun veya diğer optogenetiğin bir bilgisayarla kontrol edilmesini sağlayan basit ve esnek bir aydınlatma sistemi oluşturmak için adım adım talimatlar dahildir.

Optogenetik Deneyler için Basit ve Çok Yönlü Bir Aydınlatma Sistemi Oluşturma

Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Mikrobiyal metabolizmanın optogenetik kontrolü, fermantasyon süreçleri üzerinde esnek dinamik kontrol sağlar. Buradaki protokol, farklı hacimsel ölçeklerde kimyasal ve protein üretimi için mavi ışık ayarlı fermantasyonların nasıl kurulacağını göstermektedir.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Bu protokol, mayadaki optogenetik sistemlerin yüksek verimli karakterizasyonunu gerçekleştirmek için otomatik platform Lustró'yu kullanma adımlarını özetlemektedir.

Otomatik platform Lustro kullanılarak mayada yüksek verimli optogenetik deneyler

Bu video, diseksiyon ve fetal timus çıkarılması de 2-dGuo ile tedavi edilen timus ex vivo kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

Keşfedin optogenetik allosterik regülasyon yöntemiyle Src kinaz aktivitesinin uzay-zamansal kontrolünü. Bu yöntem, hücre sinyalleşme dinamiklerini ve yönlü hücre hareketini incelemek için tersinir, ışıkla düzenlenebilir protein fonksiyonları sağlar.

Optogenetik Allosterik Regülasyon Yoluyla Protein Aktivitesinin Uzay-Zamansal Kontrolü

Daha fazla video keşfet