Mezenterik İskemi-Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Mezenterik Venüllerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İntravital Mikroskopi ile Görüntülenmesi

Belirli genlerin trombozun başlangıcı ve gelişimi üzerindeki rolü, bu durumda, iskemi-reperfüzyon hasarı üzerindeki endotelyal PAR1 ekspresyonunu araştırıyoruz. Endotelin hem iskemi sonrası hem de reperfüzyon sırasında yanıt üzerindeki etkisini belirlemeye çalışıyoruz. Şimdiye kadar yeterince çalışılmamış olan gerçekten önemli bir husus, mezenterik iskemi-reperfüzyon hasarında bağırsak kommensallerinin rolünü belirlemektir.

Bu soruyu incelemek için grubumuz intravital mikroskopiyi mezenterik iskemi-reperfüzyon yaralanma modeliyle birleştirdi ve bunu mikropsuz fare modelleriyle birleştirdik. Tromboz modellerinin intravital mikroskopi ile birlikte transgenik farelere uygulanması, bu tür teknolojiler, hastalığın başlangıcı sırasında hücresel davranışların in vivo olarak gözlemlenmesini sağlar. Deney cinsiyet, yaş, anestezi tedavisi, değişiklikler, hayvan refahı düzenlemeleri vb. gibi birçok faktörden etkilendiğinden, canlı bir organizma üzerinde deneysel modeller yapmak her zaman bir zorluktur.

Ayrıca, tromboz araştırmaları geçen yüzyılda başladı. Katkıda bulunan birçok faktör hala çözülmemiştir. Grubum bağırsak mikrobiyotasının tromboz, ateroskleroz, trombosit fonksiyonu ve vaskülarizasyon üzerindeki rolünü inceliyor.

Başlamak için, anestezi uygulanmış, traş edilmiş fareyi bir ısıtma yastığı üzerinde sırt yaslanmış olarak konumlandırın. Fareyi bir burun konisi aracılığıyla oksijen sistemine bağlayın. Farenin uzuvlarını cerrahi bantla ısıtılmış pede sabitleyin.

Kateterin juguler ven içine implantasyonu için trakea üzerinde enine bir kesi yapın. Boynu kaplayan cildi çıkarın ve sağ juguler veni izole edin. Daha sonra, beş santimetrelik bir ipek iplik kullanarak, damarın distal ucunu kapatın ve cerrahi forseps ile sabitleyin.

Damarın yaklaşık iki santimetre altına, biri distal uca yakın ve ikisi juguler damarın proksimal ucuna yakın üç ipek iplik yerleştirin. Cerrahi bir düğüm bağlayın, ancak damarı kapatmayın. Bir polietilen kateteri %0.9 sodyum klorür ile doldurun.

Hava kabarcıklarını çıkarın ve bir mililitrelik bir şırıngaya takın. İkinci ve üçüncü düğümler arasında bir delik açmak için makas kullanın ve kateteri şah damarına implante edin. Kateterde kan bulunduğundan emin olmak için şırıngayı aspire edin.

Kateteri damara sabitlemek için ipek ipliği bağlayın. Ardından, şırıngayı sabitlemek için tıbbi bir bant kullanın. Bir mililitre şırıngayı mililitre başına 0.5 miligram nihai konsantrasyonda akridin portakalı ve beş mikromolar konsantrasyonda nükleik asit boyası ile doldurun.

Nötrofil hücre dışı tuzaklar veya NET'ler için 50 mikrolitre SYTOX Orange enjekte edin. Farenin karın derisini alternatif olarak iyot bazlı fırçalama ve alkolle dezenfekte edin. Ardından, bir neşter kullanarak, doğrusal alba boyunca üç ila beş santimetrelik bir laparotomi gerçekleştirin.

İki tuzlu suyla nemlendirilmiş pamuk ucu kullanarak bağırsağı karın boşluğundan nazikçe dışarı yerleştirin ve minimum yağ örtüsü olan bir yer belirleyin. Arka plan sinyalini azaltmak için bağırsağın küçük dallarını siyah bir hamurun üzerine yerleştirin. Lekeli lökositleri görselleştirmek için juguler ven kateterinden 50 mikrolitre akridin portakalı enjekte edin.

İskemi reperfüzyonundan önce bağırsağın videosunu alın. Sodyum klorür ile nemlendirilmiş bir kompres hazırlayın ve bağırsağı içine yerleştirin. Superior mezenterik arteri küçük bir vasküler klemp ile tıkayın.

Tuzlu suyla nemlendirilmiş pamuklu çubuklar kullanarak bağırsağı nazikçe karın boşluğuna geri itin. Karın duvarını kapatmak, nem ve ısı kaybını önlemek için 7-0 dikiş kullanın. Bir saat sonra dikişi çıkarın.

İskemik dönemi takiben, kırpılan bölgeye birkaç damla salin uygulayın. Ardından, bir klips uygulayıcı kullanarak mikrovasküler klipsleri nazikçe çıkarın. Tuzlu suyla nemlendirilmiş pamuk uçları kullanarak, bağırsağı nazikçe tekrar karın boşluğundan dışarı yerleştirin ve damarın küçük dallarını siyah bir hamurun üzerine yerleştirin.

50 mikrolitre akridin portakalı enjekte edin ve damarın iskemik sonrası videosunu çekin. Uzun mesafeli kondansatör, monokromatatör, 10 kat suya daldırma objektifi ve şarj bağlantılı cihaz kamerası ile donatılmış yüksek hızlı, geniş alanlı floresan mikroskobunu açın. Pozlama süresini 30 milisaniyeye ayarlayın ve lökositleri ve NET'leri görselleştirmek için Alexa Fluor 488 ve Rhodamine Red filtrelerinin yüklü olduğu 5B kanalını seçin.

İlgilenilen 0,06 milimetre karelik bir bölgede hücre alımını ölçün. Ardından, 20 saniyelik bir gözlem periyodu boyunca sabit kalan veya endotel astarına bağlı kalan hücreleri sayarak yapışık lökositleri ölçün. Hem lökosit hem de nükleik asit floresan boyaları ile etiketlenmiş NET'leri tanımlayın.

İskemi-reperfüzyon hasarını takiben hem vahşi tip hem de F2r delta EC gruplarında iskemik mezenterik endotelyuma lökosit yapışması artmıştır, F2r delta EC grubunda belirgin derecede daha düşük bir adezyon gözlenmiştir, bu da lökosit alımında endotelyal PAR1'in rolünü ima etmektedir. İskemi-reperfüzyon hasarından sonra, NET'ler sadece endotel hücrelerinde normal PAR1 seviyelerini eksprese eden vahşi tip grupta gözlendi, bu da PAR1'in NETosis'te düzenleyici bir rol oynadığını gösteriyor.