Name: Mycobacterium smegmatisin Mikobakterilerde Çinko Sınırlı Büyüme Koşulları için Biyoindikatör Olarak Kullanılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Keşfedin, Mycobacterium smegmatis'in çinko sınırlı koşullarda biyoindikatör olarak kullanımını. Bu yöntem, mikobakterilerde çinko kısıtlamasına adaptasyonları ve translasyonel olarak aktif alternatif ribozomların üretimini standartlaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (NSF) KARİYER Ödülü 1844854, Amerikan Akciğer Derneği İnovasyon Ödülü IA -937538 ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) NIAID R21 AI109293 tarafından finanse edilmiştir. Allexa D. Burger'in şu anki adresi, Mānoa, Honolulu, Hawaii'deki Hawaii Üniversitesi, Pasifik Biyobilimler Araştırma Merkezi'dir. ABD.

Assessing Bioindicator Phenotypes for Zinc Limitation in M. smegmatis

<ol><li>Alloway, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+factors+associated+with+zinc+deficiency+in+crops+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Geochem+Health%22%5BJournal%5D)">Soil factors associated with zinc deficiency in crops and humans.</a> Environ Geochem Health. 31 (5), 537-548 (2009).</li>
<li>Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationships+between+dissolved+zinc+and+major+nutrients+phosphate+and+silicate+along+the+GEOTRACES+GA02+transect+in+the+west+Atlantic+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Biogeochem+Cycles%22%5BJournal%5D)">The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean.</a> Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+bacterial+zinc+regulons%3A+Enhanced+ion+transport%2C+pathogenesis%2C+and+rearrangement+of+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).</li>
<li>Outten, C. E., O’Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomolar+sensitivity+of+metalloregulatory+proteins+controlling+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis.</a> Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).</li>
<li>Merchant, S. S., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+economy%3A+microbial+strategies+for+optimizing+growth+in+the+face+of+nutrient+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Micro+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation.</a> Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).</li>
<li>Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+C+or+not+two+C%3A+recurrent+disruption+of+Zn-ribbons%2C+gene+duplication%2C+lineage-specific+gene+loss%2C+and+horizontal+gene+transfer+in+evolution+of+bacterial+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Biol%22%5BJournal%5D)">Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins.</a> Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).</li>
<li>Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+of+prokaryotic+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins.</a> PLoS One. 7 (5), e36972(2012).</li>
<li>Prisic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+regulates+a+switch+between+primary+and+alternative+S18+ribosomal+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).</li>
<li>Dow, A., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+ribosomal+proteins+are+required+for+growth+and+morphogenesis+of+Mycobacterium+smegmatis+under+zinc+limiting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions.</a> PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).</li>
<li>Chen, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+translation+by+alternative+bacterial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Selective translation by alternative bacterial ribosomes.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).</li>
<li>Natori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fail-safe+system+for+the+ribosome+under+zinc-limiting+conditions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis.</a> Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).</li>
<li>Gabriel, S. E., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Zur-controlled+ribosomal+proteins+to+growth+under+zinc+starvation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions.</a> J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).</li>
<li>Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+alignment%2C+evolution+of+prokaryotic+genome+organization%2C+and+prediction+of+gene+function+using+genomic+context%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context.</a> Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).</li>
<li>Akanuma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+ribosomal+protein+S14+demonstrated+by+the+reconstruction+of+chimeric+ribosomes+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).</li>
<li>Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-responsive+regulation+of+alternative+ribosomal+protein+genes+in+Streptomyces+coelicolor+involves+Zur+and+%CF%83R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR.</a> J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+induces+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).</li>
<li>Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+from+remodeling+to+hibernation+of+ribosomes+in+zinc-starved+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).</li>
<li>Graham, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+zinc+depletion+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Severe zinc depletion of Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F+420+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Patino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+mycobacteria+as+a+tool+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).</li>
<li>Dow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+limitation+triggers+anticipatory+adaptations+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Zinc limitation triggers anticipatory adaptations in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathogens. 17 (5), e1009570(2021).</li>
<li>Tobiasson, V., Dow, A., Prisic, S., Amunts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+does+not+necessarily+induce+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion does not necessarily induce ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 116 (7), 2395-2397 (2019).</li>
<li>Dow, A., Burger, A., Marcantonio, E., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+specifies+involvement+of+alternative+ribosomal+proteins+in+response+to+zinc+limitation+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling specifies involvement of alternative ribosomal proteins in response to zinc limitation in Mycobacterium smegmatis.</a> Front Microbiol. 13, 811774(2022).</li>
<li>Singh, A. K., Reyrat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Mycobacterium smegmatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit10C.1(2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+Leucine+and+Pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double Leucine and Pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs.</a> Infect Immunity. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Cheeseman, P., Toms-Wood, A., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+properties+of+a+fluorescent+compound+factor420%2C+from+Methanobacterium+strain+M.o.H%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation and properties of a fluorescent compound factor420, from Methanobacterium strain M.o.H.</a> J Bacteriol. 112 (1), 527-531 (1972).</li>
<li>Wayne, L. G., Hayes, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+sequential+study+of+shiftdown+of+Mycobacterium+tuberculosis+through+two+stages+of+nonreplicating+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence.</a> Infect Immunity. 64 (6), 2062-2069 (1996).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Alt-ribozomların mekanik temelleri üzerindeki bilgi boşluğuna önemli bir katkı, in vitro Zn2+ sınırlayıcı koşullara ulaşmanın zorluğudur. Laboratuvar ortamında eser Zn2+ kontaminasyonu yaygındır; bu nedenle, tekrarlanabilir Zn2+ ile sınırlı büyüme koşullarına ulaşmak zordur. Zn2+ kontaminasyonu çeşitli kaynaklardan kaynaklanabilir, ancak en önemli ve yaygın kontaminasyon ve değişkenlik kaynağı laboratuvar gereçlerini durulamak ve ortam yapmak için kullanılan ultra saf sudur. Ultra saf su sistemlerinin bakımı uygun şekilde yapılmalı ve laboratuvar gereçlerini durulamadan veya ortam için su kullanmadan önce 1 dakika yıkanmalıdır. Ultra saf su ile iyice yıkanmayan veya durulanmayan şişeler Zn2+ kontaminasyonuna neden olabilir ve bu, belirli şişe(ler)de artan hücre yoğunluğu ile açıkça görülecektir, ancak aynı ZLM partisinden diğerlerinde görülmeyecektir. Zn2+ kontaminasyonunun kaynağının yeniden kullanılan şişelerden mi yoksa ortamlardan mı kaynaklandığını değerlendirmek için yepyeni şişeler kullanılabilir. ZLM'deki Zn2+ kontaminasyonu, ortam yapmak için kullanılan öğelerin ve ZLM hazırlığı için belirlenmiş bir malzeme setinin daha fazla durulanmasıyla giderilmelidir. Bu önlemlerin hiçbiri beklenen biyoindikatör fenotiplerine ulaşmada başarılı olmazsa, ultra saf su ve ZLM'deki [Zn2+], su kaynağının Zn2+ ile kontamine olma olasılığını dışlamak için ölçülmelidir. Daha önce bildirildiği gibi, ZLM'nin [Zn2+] 115 ± 37 nM23'tür ve 70 nM'nin altındaki ve 150 nM'nin üzerindeki konsantrasyonlar genellikle sırasıyla Zn2+ tükenmiş ve Zn2+ ile kontamine fenotiplere yol açar. Bununla birlikte, iyi ortam hazırlığı, sonucu etkileyen faktörlerden yalnızca biridir ve aşının yanlış hazırlanması ve/veya kültürlenmesi, yani yıkama adımları sırasında Zn2+ ile dolu ortamın kötü boşaltılması nedeniyle yetersiz veya aşırı Zn2+ oluşabilir. Burada yer alan tüm M. smegmatis kültürleri aynı şekilde hazırlanmıştır - Zn2+ ile kontamine (ZLM-C) ve Zn2+ ile tükenmiş (ZLM-D) büyüme sonuçları, deneyler doğru yapıldığında bile aynı ultra saf su sistemini kullanan farklı ortam partileri arasında meydana gelebilecek değişkenliği vurgulamak için dahil edilmiştir.
ZLM'deki kültürleme hücrelerinin tekrarlanabilir Zn2+ sınırlayıcı biyoindikatör fenotipleri vermesini sağlamak için, şişeleri benzersiz bir şekilde etiketlemek, bunları her zaman aynı koşul için kullanmak (yani, ZLM veya ZRM ile), şişeleri birden fazla kullanım boyunca izlemek ve yaşam döngülerinin sonunda olan veya ZLM ile Zn2+ ile kontamine biyoindikatör fenotipleri vermeye devam eden şişeleri atmak önemlidir. Yetersiz yıkanmış tohum hücrelerinden Zn2+ taşınması, Zn2+ ile kontamine ZLM'den ayrıştırılması zor olabilen yaygın bir Zn2+ kontaminasyon kaynağı olduğundan, Zn 2+ sınırlayıcı büyüme elde etmek için uygun aşı hazırlığı çok önemlidir. M. smegmatis kültürleri, ZLM'de (ve paralel olarak büyütülen ZRM'de) 72 saatlik büyümeden sonra test edilmeli ve hasat edilmelidir. Morfogenez ve biyoindikatör fenotipleri 48-72 saat arasında telaffuz edilir; bu nedenle, Zn için kültürlerin değerlendirilmesi veya hasat edilmesi2+ sınırlaması çok erken (veya çok geç) tam biyoindikatör fenotipini vermeyebilir. Zn2+ içinde tükenen kültürler, Zn2+ ile kontamine olanlara benzer hücre uzunlukları sergileyecektir; bu nedenle, ikisini ayırt etmek için F420 floresan ve OD600 kullanılmalıdır. Benzer şekilde, Zn2+ ile kontamine kültürler her zaman Zn2+ ile sınırlı bakterilerden daha iyi büyümeyebilir, ancak F420 floresansı ve vahşi tipin hücre uzunluğu ve ΔaltRP mutant, Zn2+ ile sınırlı koşulun elde edilip edilmediğini ortaya çıkarmalıdır.
Aynısı M. tuberculosis için de geçerlidir, çünkü Zn2+ ile sınırlı kültürlerde F420 biyoindikatör fenotipinin kaybı, ZLM'de 8-10 günlük büyüme arasında belirgindir. M. tuberculosis, M. smegmatis gibi güçlü bir Zn2+ ile sınırlı biyoindikatör fenotipi sergilemese de, burada sunulan büyüme yöntemi, M. tuberculosis'in hem virülan hem de zayıflatılmış suşlarında fonksiyonel tahliller ve transkriptomik kullanılarak F420 biyoindikatör fenotipinin kaybını Zn2+ ile sınırlı büyüme ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır (ref23ve yayınlanmamış veriler). Bu nedenle, F420 floresansını takip etmek, M. tuberculosis'te biyolojik Zn2+ sınırlayıcı koşulları izlemek ve doğrulamak için erişilebilir bir yoldur. Zn2+ sınırlayıcı koşullar sırasında azalmış F420 floresansına yol açan mekanizmanın, indirgenmiş floresansın bir bütün olarak koenzim havuzunun bolluğunun azalmasından mı yoksa redoks durumundaki bir kaymadan mı kaynaklandığı ayrımı gibi çözülmemiş kaldığına dikkat etmek önemlidir, çünkü sadece oksitlenmiş form floresan29 yayar.
Burada gösterildiği gibi, Zn2+ sınırlayıcı ortamın hazırlanması nüanslıdır ve aynı protokolü takip ederken ve aynı reaktifleri kullanırken bile ortamdaki Zn2+ iyonlarının etkin konsantrasyonunu etkileyebilecek çok sayıda faktör vardır. ZLM'deki Zn2+ izleri, Zn2+ sınırlayıcı fenotipinin yeterli büyümesine ve ekspresyonuna izin verir. Sınırlamayı elde etmek içinZn2+ 'nın bu kademeli azalması, oksijenin kapalı bir şişede30 yetiştirilen bakteriler tarafından kademeli olarak tüketildiği Wayne hipoksi modeline benzer. Hem hipoksi hem de Zn2 + ile sınırlı fenotipler bakteri üremesine bağlı olduğundan, yeterli oksijen yoksa veya bu modelde Zn2+, aşı veya ortamda, bakteriler ilgili morfojenik programa girmeden önce büyümeyi durduracaktır. Bu nedenle, Zn2+ kontaminasyonu, Zn2+ sınırlaması elde etmek istendiğinde daha belirgin bir sorun olsa da, Zn2+ tükenmesi, aktif büyüme sırasında büyüme bozukluğu ve kaçırılan Zn2+ bağımlı tetikleyici nedeniyle de bir sorun teşkil edebilir. Ek olarak, floresan yoğunluğu için üst veya alt okuma modlarına sahip monokromatör veya filtre tabanlı plaka okuyucuların kullanılması, hesaplanan F375/420 yüzdesini biraz etkiler. Bu nedenle, her laboratuvardan alınan değerler burada sunulanlarla doğrudan karşılaştırılabilir olmayabilir, ancak benzer olmalı ve aynı eğilimleri takip etmelidir. Bu nedenle, Zn2+ sınırlayıcı büyüme sağlayan ZLM yapmak için yöntemler ve prosedürler, her laboratuvar ve ultra saf su sistemi için optimize edilmeli ve burada sunulan biyoindikatör fenotipleri, Zn2+ sınırlayıcı koşulları tanımlamak için standart olarak kullanılmalıdır.
Zn2 + ile sınırlı büyüme koşullarını standartlaştırma ve çoğaltmanın zorluğu nedeniyle, Zn2+ kontaminasyonunu atlatmak için erişilebilir bir yaklaşım, Zn2+ eklenmeden hazırlanan ortama bir şelatlama maddesi eklemektir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, Zn2+ sınırlamasına karşı gerçek biyolojik tepkiyi karıştırır ve genellikle Zn2+ ve diğer mikro besinler için aç bir ortam yaratır. Zn2+'ya özgü şelatlama ajanlarının bile, M. tuberculosis23'teki Zn2+'ya bağlı transkripsiyonel yanıta ek olarak, demir açlığına yanıtı yukarı regüle ettiği gösterilmiştir. Ayrıca, şelatlama maddelerinin kullanımı, Zn2+ dolu durumdan Zn2+ - sınırlı koşullara geçiş sırasında biyolojik tepkiyi yansıtmayan ciddi şekilde Zn 2+ aç bir ortamdan veya sınırlı serbest Zn2+ mevcudiyetine sahip ortamlarda kalıcı büyümeden kaçınmak için dikkatli bir titrasyon ve zamanlama gerektirir. Son olarak, şelatlama maddelerinin eklenmesi, sonraki uygulamalarla (örneğin, makrofaj veya hayvan enfeksiyonları) uyumlu olmayabilir. Aktif olarak büyüyen kültürlerde kademeli Zn2+ tükenmesine karşı şelatlama ajanları ile elde edilen Alt-ribozomların formu ve işlevi hakkında temelde farklı sonuçlar çıkarılmıştır17,24. Burada, prosedür doğru yapıldığında bile, farklı ortam gruplarında su saflığındaki nispeten küçük farklılıklardan kaynaklanan farklı fenotipler vurgulanmaktadır. Burada sunulan Alt-ribozomları üretmek için ölçülebilir, tekrarlanabilir ve biyolojik olarak ilgili sistem, yani Zn'de sunulan2+-sınırlı vahşi tip kültürlerde şelatör eklemeden, alternatif ribozom biyolojisinin daha iyi anlaşılmasına yönelik alandaki katkıları birleştirmek için çok önemli olacak standartlaştırılmış bir yöntem sunar.

Çinko iyonu (Zn2+) temel bir mikro besindir ve mikrobiyolojik ortamın standart bir bileşenidir. Bununla birlikte, Zn2+ sınırlayıcı koşullar yaygın olduğu için birçok bakteri çevrede Zn2+ sınırlamasına dayanır; soil1, marine2 ve host3 içindeki nişler genellikle Zn2+ sınırlıdır. Bu nedenle, çoğu bakteri, Zn2+ sınırlamasının üstesinden gelmek ve hücresel işlevi korumak için mekanizmalar geliştirmiştir4. Zn2+ homeostazının sürdürülmesiyle ilgili sistemler sıkı transkripsiyonel kontrol5 altındadır ve yüksek afiniteli Zn2+ içe aktarma sistemleri kullanarak Zn2+ süpürülmesinde, hücresel Zn2+ rezervlerinin mobilize edilmesinde ve belirli Zn2 + bağlayıcı proteinlerin alternatif Zn2 + bağımsız paraloglarla değiştirilmesinde rol oynar 6. İkincisinin bir örneği, bacteria<sup class="xref">4'teki Zn 2+ duyarlı regülasyonların ortak bir özelliği olan Zn2+'dan bağımsız ribozomal protein (RP'ler) paraloglarıdır. Bu oldukça farklı Zn2+ bağımsız RP'ler, Zn2+ bağlayıcı CXXC motifi7'nin bozulmasıyla Zn2+ bağlama paraloglarından ayırt edilir. Dizilenmiş prokaryotik genomların yarısından fazlası, en az bir çift çoğaltılmış RP içerir, burada birçoğunda bir RP Zn2+'yı bağlarken, paralogu 8'i bağlamaz. C+/C- gösterimi (sistein açısından zengin Zn2+ bağlama motifinin varlığını/yokluğunu gösterir) bu paralog RP çiftlerine atıfta bulunmak için yaygın olarak kullanılırken7, Zn 2+'dan bağımsız RP'ler, Zn2+'da ribozom biyogenezi için alternatif RP'ler olarak hizmet ettiğinden, birincil (Prim), Zn2+ bağlayıcı RP paraloglarının alternatif (Alt) versiyonları olarak da tanımlanmıştır-bazı bakterilerde sınırlı durumdadır ve daha iyi aranabilirliğe sahip bir anahtar kelimedir9,10,11.
AltRP ifadesi Zn2+ tarafından sıkı bir şekilde düzenlendiğinden, AltRP ifadesinin Zn2+ sınırlaması karşısında Zn2+'ya bağımlı ribozomal proteinlere işlevsel fazlalık sunduğunu varsaymak mantıklıdır. Gerçekten de, AltRP'lerin bu özelliği, Zn2+ sınırlaması sırasında yüzey PrimRP L31'in serbest bırakılması ve AltRP L3112,13 ile değiştirilmesiyle büyümenin kurtarıldığı model toprak bakterisi Bacillus subtilis için gösterilmiştir. Bununla birlikte, bazı AltRP'ler, örneğin S14 gibi çekirdek PrimRP'lere benzerdir, yani ribozom biyogenezi12,13 sırasında dahil edilmeleri gerekir. Ribozomu AltRP'lerle yeniden inşa etmek, kararlı, enerji yoğun bir programdır. Bu çekirdek AltRP'ler Zn2+'yı ribozomdan kurtarmaya hizmet edebilirken, bazı AltRP'lerin Zn2+ sınırlı ortamda ek bir işlev geliştirmesi de mümkündür. Bu, AltRP'lerin paralog PrimRP'lerinden farklı olduğu gözlemiyle desteklenir; AltRP genlerinin dizi homolojisi, farklı türlerdeki homologlar arasında, aynı tür içindeki Zn2+ bağlayıcı PrimRP gen dizisine göre genellikle daha yüksektir7,10. Oldukça farklı AltRP'leri kodlayan genler Zn2+'ya bağlı transkripsiyonel kontrol altında olduğundan, sıkı bir şekilde düzenlenmiş ve yüksek oranda korunmuş ribozomal süperoperonlar14 üzerine uygulanan seçici baskıdan çıkarılırlar. Ribozomal mekanizmayı ve AltRP'leri kodlayan genetik bilgi üzerindeki ayrıştırılmış seçici baskı, bu RP'leri homolog PrimRP'lerden farklı evrimsel yörüngelere maruz bırakır ve aynı AltRP'nin farklı bakterilerde soya özgü evrimine izin verebilir10,15. AltRP'lerin bakterilerde yaygın olarak bulunması ve bu benzersiz RP'lerin ayrıştırılmış genetik düzenlemesi, AltRP'lerin bakteri ribozomlarına dahil edilmesinin AltRP içeren ribozomlara (Alt-ribozomlar) özel bir özellik kazandırıp kazandırmadığı konusunda ilginç bir soruyu gündeme getirmektedir.
Mikobakteriler, Alt-ribozomların mekanik özelliklerini araştırmak için ideal bir bakteri grubudur. İlk olarak, mikobakteriler, AltRP'leri kodlayan dört gen içeren yüksek oranda korunmuş bir altRP operonuna sahiptir: S14-2, S18-2, L28-2 ve L33-28,9. Mikobakteriyel AltRP'ler, PrimRP paraloglarından önemli ölçüde farklıdır; dört PrimRP/AltRP çiftinin hepsinde, belirli bir AltRP geni, tüm mikobakteriyel türlerde aynı türdeki PrimRP genine olduğundan daha benzerdir10. AltRP'lerin soya özgü evrimi, Mycobacterium tuberculosis ve M. bovis'teki AltRPs S18-2 ve L28-2 tarafından kanıtlandığı gibi, diğer mikobakterilerde bulunmayan C-terminalinde benzersiz diziler içeren Mikobakteriler içinde de belirgindir10. İkincisi, bu yüksek derecede ilişkili bakteri grubu, topraktan (örneğin, M. smegmatis) sayısız konakçıya kadar çeşitli ortamlarda bulunan patojenik olmayan ve patojenik üyeler içerir: insan (örneğin, M. tuberculosis), sığır (örneğin, M. bovis), suda yaşayan (örneğin, M. marinum) ve kuş (örneğin, M. avium), birkaç isim. Mikobakterilerdeki altRP operonunun yüksek oranda korunmuş doğası, belirli AltRP genlerinin soya özgü evrimi ve bu grubun üyelerinin bulunduğu çok farklı ortamlar, AltRP fonksiyonunun korunmuş ve soya özgü evrimini ve Alt-ribozomlarının mekanik özelliklerini ayrıştırmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Prokaryotik genomlarda AltRP'lerin bolluğuna rağmen, AltRP'lerin ve Alt-ribozomların rolü yalnızca birkaç bakteride araştırılmıştır9,10,11,12,13,16,17,18,19. Mikobakterilerde Zn2 + sınırlayıcı büyüme koşullarını doğrulamak için belirli metriklere sahip standartlaştırılmış bir sistem kurmak, deneysel sonuçları iyileştirecek ve ribozom araştırması alanında Alt ribozomların anlaşılmasını ilerletecektir.
Zn2+ bir mikro besindir; bu nedenle, kimyasallarda ve suda Zn2 + 'yı kirleten izler, ortam hazırlığından çıkarılsa bile Zn2 + 'nın biyoyararlanımına katkıda bulunur. Suda veya kimyasallarda bulunan eser miktarda Zn2 + laboratuvarlar arasında büyük ölçüde değişebilir ve bu nedenle Zn2 + sınırlayıcı büyümenin sonucunu etkiler. Her bir bağımsız ortam hazırlığında [Zn2 +] 'nın ampirik olarak ölçülmesi, rutin büyüme testleri yürüten çoğu laboratuvar için aşırı derecede külfetlidir, ancak büyüme ortamında Zn2 + kontaminasyonu olasılığını ortadan kaldıran bir mekanizma özünde değerli olacaktır. Bu amaçla, burada M. smegmatis ve M. tuberculosis'te Zn2+ sınırlayıcı büyüme ve Alt-ribozom üretimi için kimyasal olarak tanımlanmış bir Zn 2+ - sınırlı ortam (ZLM), büyüme kapları ve tohum kültürleri hazırlamak için ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır. ZLM'de büyümeden sonra temel morfojenik özellikler (OD600 ile ölçülen hücre yoğunluğu, hücre uzunluğu ve koenzim F420'nin floresansı),Zn2+ sınırlamasının elde edildiğini doğrulamak için kullanılır. Koenzim F420, metanojenlerde ve mikobakterilerde katabolizma ve oksidatif strese karşı savunmada önemli rolleri olan bir deazaflavin kofaktörüdür20,21. Daha da önemlisi, mikobakteriler, bu kofaktör22'nin bolluğu nedeniyle 420 nm'de uyarıldığında otofloresandır. [Zn2 +] ve F420 floresan arasındaki moleküler bağlantı çözülmeden kalır, ancak kültürlerde F420 floresansını takip etmek izlenebilir ve güvenilir bir biyoindikatördür.
M. smegmatis'te, biyoindikatör fenotipleri vahşi tip bakterilerde meydana gelir, ancak altRP operonundan yoksun bir delesyon mutantı aynı morfojenik programa tabi tutulmaz ve diferansiyel bir biyoindikatör10 olarak kullanılabilir. M. tuberculosis, Zn2+ sınırlaması sırasında M. smegmatis ile aynı morfojenik programı takip etmese de, M. tuberculosis'in Zn'ye karşı sağlam ve küresel bir yanıtı vardır2+ sınırlama ve bu yöntemi izleyen önemli bir biyoindikatör fenotipi23. Böylece, burada tanımlanan sistem, Alt ve Alt ribozomların aynı büyüme koşulları altında (yani Zn2 + sınırlaması) üretilmesini sağlayarak, Alt ribozom fonksiyonunun mekanik diseksiyonunu ve bakteri fizyolojisini şekillendirmedeki rolünü kolaylaştırır. Bu büyüme yöntemi, aktif Alt-ribozomların yapısını çözmek ve vahşi tip M. smegmatis24'te translasyon aktivitelerini göstermek için kullanıldı. Bu büyüme yönteminin ve biyoindikatör fenotipinin, Zn2+ sınırlaması sırasında AltRP'lerin biyolojik işlevselliğini vurguladığını daha da destekleyen AltRP ekspresyonu, Zn2+'ya bağlı morfogenez için gereklidir ve Zn2+-sınırlı M. smegmatis10,25'in transkriptomu ve proteomu üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Aynı yöntem, inokulum miktarında ve inkübasyon süresinde küçük değişikliklerle, M. tuberculosis9,23'ün Zn2+ ile sınırlı kültürlerini oluşturmak için kullanılır. Burada, hem M. smegmatis hem de M. tuberculosis'te Zn2+ sınırlayıcı büyüme elde etmek için protokoller ve biyoindikatör fenotipleri, M. smegmatis'e odaklanılarak detaylandırılmıştır, çünkü bu bakteri ortamdaki Zn2+ kontaminasyonuna daha duyarlıdır ve yavaş büyüyen patojenden daha yaygın olarak erişilebilirdir.

<table><tbody><tr><td>1000 mL Vakum Filtrasyon Sistemleri, Standart Hat</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>125 mL Erlenmeyer Çalkalayıcı Şişeleri</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679501</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Kültür Tüpleri, Plastik, Çift Konumlu Kapaklı</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer Çalkalayıcı Şişeleri</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679502</td><td></td></tr><tr><td>40X-1000X Lab Binoküler Biyolojik Bileşiği Mikroskop</td><td>Omax</td><td>M82EZ</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Biyoreaksiyon Tüpleri, Steril</td><td>VWR</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Bayrak Kapaklı Yüksek Performanslı Santrifüj Tüpleri</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Alcojet Az Köpüren Toz Deterjan</td><td>Alconox</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum demir (III) sitrat, kahverengi</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAA1119930&nbsp;</td><td>MW: 265 g / mol, 1M çözelti için 5 mL ultra saf suya 1.325 g ekleyin; 4 ° C'de ışıktan korunarak saklayın</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Thermo Scientific</td><td>J10857-A1</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum D-Pantotenat</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC243300050</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1345-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit susuz, kristal</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP339-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D14-500</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Et Suyu BD</td><td>Teşhis</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Yoğunluğunun Belirlenmesi için DiluPhotometer OD600 ve Bradford Tahlilleri</td><td>Implen</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>GENios FL Mikroplaka Okuyucu</td><td>Tecan</td><td></td><td>Durdurulan</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu</td><td>Tecan</td><td>LGE140213-20BL</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagin</td><td>Termo Bilimsel</td><td>AAB2147336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Lösin</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A1231122</td><td></td></tr><tr><td>Macrofire SP CCD kamera</td><td>Optronics</td><td></td><td>Olympus mikroskobu ile kullanım için</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Doğrudan 8 Su Arıtma Sistemi</td><td>Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Moticam X3</td><td>Motic</td><td></td><td>Durduruldu, yerini Moticam X5 Plus aldı; bileşik mikroskop ile kullanım için</td></tr><tr><td>Oleik asit</td><td>Thermo Scientific</td><td>031997-14</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51 dik mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Durduruldu, BX53M ile değiştirildi</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat, monobazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Yarı Mikro İki Taraflı Tek Kullanımlık Plastik Küvetler</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür, kristal</td><td>VWR</td><td>VW1494-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>103170</td><td></td></tr><tr><td>Çinko sülfür heptahidrat, kristal/ACS</td><td>MP Biyomedikal</td><td>219145290</td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium smegmatis'in mikobakterilerde Çinko sınırlı büyüme koşulları için biyoindikatör olarak kullanılması

Using Mycobacterium smegmatis as a Bioindicator for Zinc-Limited Growth Conditions in Mycobacteria

Birçok bakteri, Zn2+ bağlayıcı ribozomal proteinleri Zn2+ bağımsız paraloglarla değiştirerek Zn2+ sınırlayıcı büyüme koşullarında alternatif ribozomlar oluşturur. Bu alternatif ribozomları incelemek için bir sistem tanımlamanın zor olduğu kanıtlanmıştır çünkü laboratuvarda Zn2 + kontaminasyonu yaygındır. Bu sorunu ele almak için, şelatlama maddeleri bazen büyüme ortamına eklenir, ancak bu yaklaşım kademeli Zn2 + sınırlamasına biyolojik yanıtı karıştırır ve ribozom hazırda bekletme ile ilişkilidir. Burada, şelatör eklemeden Zn2+ sınırlı büyüme için ortam ve tohumlama kültürlerinin hazırlanması için ayrıntılı talimatlar özetlenmiştir. Bu yöntemi takiben, model bakteri, Mycobacterium smegmatis, alternatif ribozomlara bağlı olan morfogeneze uğrar. Morfogenez izlenebilir olduğundan ve yalnızca Zn2 + sınırlayıcı koşullarda meydana geldiğinden, M. smegmatis biyolojik olarak ilgili büyüme koşullarını doğrulamak için bir biyoindikatör olarak kullanılabilir. Yabani tipte Zn2+ sınırlamasını gösteren üç biyoindikatör fenotipi (hücre yoğunluğu, hücre uzunluğu ve koenzim F420 floresansı) tanımlanmış ve alternatif ribozomlar oluşturamayan bir delesyon mutantı için bu biyoindikatörlerdeki değişiklikler özetlenmiştir. İz Zn2 + kontaminasyonunun her bir ortam partisi için kontrol edilmesi zor olduğundan ve her bir ortam preparatında Zn2 + 'nın kesin miktar tayini aşırı derecede külfetli olduğundan, bu biyoindikatör fenotipini takip etmek, Zn2 + sınırlı büyüme ortamının hazırlanmasını doğrulamanın erişilebilir bir yoludur. Zn2 + sınırlayıcı büyüme ve alternatif ribozom üretimi için uygun koşulların belirlenmesine yardımcı olmak için, biyoindikatör fenotiplerindeki değişiklikler, Zn2 + ile kontamine olmuş veya Zn2 + - sınırlı ortamın ciddi şekilde Zn2 + tükenmiş preparatları için de profillendi. M. tuberculosis'te Zn2 + sınırlayıcı büyüme ve alternatif ribozom üretimini elde etmek için daha fazla ayrıntı, ilişkili biyoindikatör fenotipi ile birlikte sunulmaktadır. Genel olarak, burada açıklanan ayrıntılı talimatlar ve biyoindikatör fenotipleri, mikobakterilerde translasyonel olarak aktif alternatif ribozomların üretiminin standartlaştırılmasına yardımcı olacaktır.

...’nın biyobelirteç fenotipleri M. smegmatis 
Yabanı tip M. smegmatis Zn düzeyine ulaşan ZLM içinde büyütülmüş kültürler2+- büyüme sınırlayıcı koşullar altında, Zn altında büyütülmüş hücrelerle karşılaştırıldığında üç ana biyobelirteç fenotipine sahiptir2+-yeterli koşullar: [1] azalmış OD600, [2] uzamış hücreler ve [3] 420 nm'de azalmış pik floresans. AltRP'lerden yoksun mutant (ΔaltRP) aynı Zn değerine sahip değildir2+yabanı tip olarak -bağımlı morfogenez10, ve Zn'deki kendine özgü fenotipi2+Sınırlı ortamlar diferansiyel bir biyobelirteç olarak kullanılabilir. Bu nedenle, üç biyobelirteç metriğinin tamamı önce ZRM ve ZLM'de yetiştirilen yabani tipte değerlendirilmelidir. Beklenen Zn2+-kısıtlı vahşi tip fenotip gözlemlenir, ΔaltRP Ardından delesyon suşu değerlendirilmelidir. ZLM'deki büyüme her zaman Zn seviyesine ulaşmayabilir.2+-kısıtlı koşullar; biyogöstergelere ihtiyaç duyulmasının temel nedeni de budur. Özgün yabani tip ve ΔaltRP biyoindikatör fenotipleri, biyolojik olarak ilgili Zn'nin doğrulamasını yapar2+- sınırlayıcı koşullar sağlandı. ZLM içinde büyütülen kültürler Zn düzeyine ulaşmadığında2+-Zn nedeniyle büyümenin kısıtlanması2+ besiyerindeki veya kültür kaplarındaki kontaminasyonlarda (ZLM-C), gösterildiği üzere bu biyobelirteç fenotipleri daha az belirgin olacaktır Şekil 1 ve Şekil 2Aksine, eğer Zn konsantrasyonu2+ ZLM'de çinko düzeyi çok düşük olduğunda, büyüme Zn tarafından engellenir2+ düşük kültür bulanıklığı ve değişmiş biyobelirteç fenotipleriyle belirginleşen tükenme (ZLM-D), şurada da ayrıntılarıyla anlatılmıştır: Şekil 1 ve Şekil 2.
Hücre yoğunluğu, Zn2+ kısıtlamasının güçlü bir göstergesidir. ZRM içinde büyütülen kültürler 72 saatin ardından tutarlı bir şekilde yüksek bulanıklığa (5'in üzerinde OD600) ulaşır, bazen kümelenme yapar ve ZLM içinde büyütülen kültürlere göre gözle görülür şekilde daha sarıdır (veriler gösterilmemiştir) (Şekil 1A). Zn2+ kısıtlaması, Zn2+-yeterli durumla karşılaştırıldığında tüm suşların büyümesini kısıtlar (düşük OD600 ile belirlenir) ve ΔaltRP suşu, yabani türe göre daha düşük hücre yoğunluğuna sahiptir (Şekil 1A). ZLM içindeki Zn2+-kısıtlı büyüme, yabani türde tutarlı bir şekilde 3,5'in üzerinde ve 5'ten düşük, ΔaltRP suşunda ise 3'ten düşük bir OD600 değeri verir (Şekil 1A). Zn2+ kontaminasyonu olan ZLM'de büyütülen kültürler (ZLM-C), ZRM'de büyütülen Zn2+-yeterli kültürlere benzer bir hücre yoğunluğuna (OD600 5'in üzerindedir) ulaşır (Şekil 1A). Eğer ZLM içindeki [Zn2+] çok düşükse, kültürlerde ciddi Zn2+ eksikliği oluşur (ZLM-D) ve yabani tür kültürlerindeki düşük hücre yoğunluğuyla (OD600 3'ten küçüktür; Şekil 1A) kanıtlandığı üzere büyüme bozulur. Yabani tür hücre yoğunluğu (3,5 &lt; OD600 &lt; 5), Zn2+-kısıtlı koşulları doğrulamak için ilk biyogösterge fenotip kontrol noktası olmalıdır. Yalnızca beklenen hücre yoğunluğuna ulaşan yabani tür kültürleri dikkate alınmalı ve ΔaltRP suşunun analizi, yabani türdeki Zn2+-kısıtlı biyogösterge fenotipinin doğrulanmasından sonra yapılmalıdır.
Zn2+ kısıtlı ZLM ortamında büyütülen durağan faz wild-type kültürler, yaklaşık 9 µm ortalama hücre uzunluğu ile uzamış durumdayken; ZRM'de büyütülen Zn2+-replete kültürler, yaklaşık 3 µm ortalama hücre uzunluğu ile kısadır (Şekil 1B). Zn2+ kontaminasyonlu ZLM'de (ZLM-C) büyütülen wild-type kültürler tamamen uzamazlar, ancak 5 µm ortalama hücre uzunluğu ile Zn2+-replete hücrelerden biraz daha uzundurlar. ZLM'nin tüm partilerinde Zn2+ kontaminasyonunun biyobelirteçle tespit edilmesi, hazırlama sırasında olası bir kontaminasyona işaret ederken; münferit kültürlerdeki (yani flasklardaki) tespitler, flaskların yetersiz yıkanması veya kültür hazırlama hataları nedeniyle oluşan kontaminasyonu gösterir. Zn2+ bakımından ciddi şekilde fakirleştirilmiş ZLM'de (ZLM-D) büyütülen wild-type kültürler, yaklaşık 7 µm ortalama hücre uzunluğu ile daha az belirgin bir uzama gösterirler (Şekil 1B). Uzamış wild-type fenotipi ΔaltRP suşunda gözlemlenmez ve Zn2+ kısıtlı ΔaltRP hücreleri yaklaşık 5 µm ortalama hücre uzunluğuna sahiptir (Şekil 1B). Şekil 2, farklı ZLM veya ZRM preparasyonlarında büyütülen (adım 2'den sonra) ve bileşik ışık mikroskobu ile görüntülenen hücrelerin temsilci imgelerini göstermektedir. Adım 4'ü takiben, Şekil 2'de gösterilene benzer imgelerdeki çok sayıda alandan alınan hücreler, Şekil 1B'de gösterilen kültürlerin ortalama hücre uzunluğunu hesaplamak için kullanılır. Wild-type uzamış fenotipi Zn2+-kısıtlı koşullara özgüdür; kültürler Zn2+-replete veya ciddi şekilde Zn2+-fakir olduğunda hücresel uzama gözlemlenmez (Şekil 1B ve Şekil 2).
Azalmış F420 floresans biyobelirteç fenotipi en iyi floresans taramalarında gözlemlenir (Şekil 1C). Kofaktör F420'den gelen azalmış floresans, adım 3.16.5'te açıklandığı üzere, 375 nm'deki (arka plan) floresans yoğunluğunun 420 nm'ye (kofaktör F420'den gelen otofloresans) olan yüzdesi alınarak nicelleştirilir ve F375/420 olarak ifade edilir. Floresans tarama yeteneği olmayan monokromatik plaka okuyucular için, F375/420 değerini hesaplamak amacıyla 375 nm ve 420 nm'deki (her ikisi de 475 nm emisyon ile) nokta okumaları uygundur. Zn2+-zengin koşullarda (yani, ZRM içinde) büyütülen yabani tip kültürler, %17 civarında oldukça tekrarlanabilir F375/420 değerlerine sahiptir (Şekil 1D). ZLM'de büyütülen Zn2+-kısıtlı kültürlerdeki F420 floresans azalması, F375/420 değerinin yaklaşık %27'ye yükselmesiyle belirginleşir (Şekil 1D). Zn2+-kısıtlı ΔaltRP suşundaki F420 floresansı, aynı koşuldaki yabani tipe göre dikkat çekici derecede daha düşüktür ve bu durum floresans taramalarında görsel olarak belirgindir (Şekil 1C). Zn2+-kısıtlı ΔaltRP suşunda F375/420 değeri yaklaşık %50-80 aralığında değişerek daha değişkenlik gösterir (Şekil 1D). ZLM'de büyütülen ancak Zn2+ kontaminasyonunun biyobelirteç göstergesini sergileyen kültürlerde (ZLM-C) F375/420 değeri yaklaşık %21'e düşmüş olup, Zn2+-tüketmiş (ZLM-D) kültürlerde F375/420 değeri yaklaşık %35 civarındadır (Şekil 1D).
Özetle, ZLM'de büyütülen kültürlerin Zn2+-kısıtlı durumunu doğrulamak için yabani tip ve ΔaltRP suşlarında üç biyoindikatör fenotip değerlendirilmelidir. Biyolojik olarak ilgili Zn2+-kısıtlı büyüme için biyoindikatörler şu şekilde olmalıdır: [1] yabani tipin OD600 değeri 3,5 - 5 arasındayken ΔaltRP suşu 3'ten düşük, [2] yabani tip hücreler yaklaşık 10 µm uzunluğundayken ΔaltRP hücreleri bu uzunluğun yarısı kadar ve [3] ΔaltRP suşunun F375/420 değeri yüksek, yani %50'nin üzerinde olmalıdır.
...'nın biyogösterge fenotipleri M. tuberculosis 
Çinko2+-sınırlı M. tuberculosis ile aynı morfogenik programı göstermez M. smegmatisÖzellikle, OD değerinde herhangi bir fark yoktur.600 Zn arasında2+-yeterli ve Zn2+-sınırlı kültürler ve Zn2+Sınırlı kültürlerde herhangi bir belirgin morfolojik fenotip görülmez, yani uzama meydana gelmez.23Benzer şekilde, bir Zn yoktur2+-eksilmiş biyobelirteç fenotipi (örneğin, azalmış hücre yoğunluğu) şeklinde M. tuberculosis ...da gözlemlendiği üzere M. smegmatisÇinko2+Zn kısıtlı kültürlerde, Zn içeren kültürlere kıyasla daha belirgin kümeleşme görülmektedir2+-zengin kültürler, ancak her iki koşul da 10. güne gelindiğinde önemli ölçüde kümeli görünmektedir (hem Mtb-H37Rv hem de Mtb-Aux'te gözlemlenmiştir). Zn için temel biyobelirteç fenotipi2+ kısıtlılıklar M. tuberculosis pik F azalmıştır420 daha önce bildirildiği üzere floresans23Kümeleşmeyi minimize etmek için, 10 gün yerine 8 gün boyunca büyütülen kültürlerin sonuçları burada sunulmuştur. Azalmış F420 Zn'de floresans belirgindir2+-sınırlı, hem monokromatik (Şekil 3) ve filtre tabanlı plak okuyucular. Filtre tabanlı plak okuyucular için Mtb-H37Rv, Zn2+Zn-kısıtlı kültürler (yani ZLM'de büyütülenler), ham floresan değerlerinin yaklaşık %50'sine sahiptir2+-zenginleştirilmiş kültürler (yani ZRM içinde büyütülmüş; veriler gösterilmemiştir). Monokromatik bir plaka okuyucu, alttan okuma modu ve Mtb-Aux, Zn kullanılarak2+-zenginleştirilmiş kültürler F içerir375/420 yaklaşık %75 ve Zn2+-kontamine ZLM kültürleri benzer değerlere sahiptir. Azalmış F420 Zn'de floresans2+ZLM içinde büyütülen sınırlı kültürler F ile ifade edilir375/420 %100'ün üzerinde. Zn2+-sınırlı ΔaltRP suşun benzer büyüme ve F420 Zn'de görüldüğü şekliyle floresans2+-sınırlı yabani tip (Şekil 3) ve şunda bir biyobelirteç olarak kullanışlı değildir M. tuberculosis olduğu gibi M. smegmatis (Şekil 1). Bu nedenle, büyütme için kullanılacak besiyerlerinin test edilmesi önerilir M. tuberculosis hızla büyüyenle birlikte M. smegmatis.
<img alt="Bakteriyel çalışmada büyüme eğrileri, uzunluk dağılımı ve floresans analizi; grafikler ve kutu grafikleri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1: Zn2+ kısıtlaması altında büyütülen M. smegmatis'in biyogösterge fenotipleri ile Zn2+ kontaminasyonunun ve Zn2+ tükenmesinin fenotipler üzerindeki etkisi. Her panelde gösterilen biyogösterge fenotipinin temsili örnekleri, 72. saatteki aynı kültürlere aittir. Zn2+-kontamine (ZLM-C), Zn2+-kısıtlı (ZLM-L) ve Zn2+-tükenmiş (ZLM-D) büyüme sonuçlarının örnekleri, tamamı burada sunulan aynı hazırlama yöntemini (adım 2) izleyen bağımsız besiyeri hazırlıklarından alınmıştır. Zn2+-kısıtlı yabanı tip ve ΔaltRP suşları için temsili fenotipler aynı ZLM serisinden alınmıştır. Tüm suşlar ve koşullar için üç biyolojik tekrarlama yapılmıştır (n=3). (A) 600 nm'de saptanan optik yoğunluğu (OD600) gösteren büyüme eğrileri ve Zn2+ kısıtlaması ile tükenmesiyle azalan hücre yoğunluğu. Hata çubukları tekrarlar arasındaki standart sapmayı temsil eder. (B) Zn2+-kısıtlı yabanı tipin uzamış fenotipini gösteren yabanı tip ve ΔaltRP suşlarının hücre uzunlukları. Kutu ve bıyık grafiği; µm cinsinden çeyrekler arası mesafeyi, minimum, maksimum ve medyan hücre uzunluklarını gösterir. (C) Zn2+ kısıtlamasıyla azalan pik F420 floresansını ve Zn2+-kısıtlı ΔaltRP suşunda azalmış F420 floresansını gösteren kültürlerin temsili floresans taramaları. Farklı besiyeri hazırlıklarının her birindeki biyolojik üçlemelerden sadece bir temsili kültür gösterilmiştir. Floresans taramaları, 5 nm adım boyutuyla 230 nm ile 440 nm arasında bir eksitasyon dalga boyu aralığı ve 475 nm emisyon dalga boyu kullanmıştır. Sol üstte gösterilen panel içi panel, Zn2+-kısıtlı ΔaltRP suşundaki 420 nm'deki azalmış floresans pikini belirginleştirmek için Zn2+-kısıtlı yabanı tip ve ΔaltRP suşlarının yakınlaştırılmış görünümüdür. Eksen birimleri ana grafikle aynıdır. Tüm lejantlar (A)'daki ile aynıdır. (D) F375/420 yüzdesinden hesaplanan, kofaktör F420'den kaynaklanan azalmış floresansın kantifikasyonu. Yüzdeler, (C)'deki floresans taramalarından elde edilen değerlerden hesaplanmıştır. Kutu ve bıyık grafiği; çeyrekler arası mesafeyi, minimum, maksimum ve medyan yüzdeleri gösterir. Besiyeri tipinden sonra parantez içinde verilen ve besiyerinin Zn2+ ile ilgili durumunu temsil eden kısaltmalar R = Zn2+-yeterli, C = Zn2+-kontamine, L = Zn2+-kısıtlı ve D = Zn2+-tükenmiş'tir; diğer kısaltmalar ise şunlardır: WT = yabanı tip suş, a.u. = keyfi birimler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Zn²⁺ durum elektroforez sonuçları, WT ile ΔaltRP karşılaştırması, protein ayrım analizi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2: 72. saatteki M. smegmatis'e ait temsili mikroskopi görüntüleri. Görüntüler Şekil 1'de gösterilen kültürlerden alınmıştır. Hücreler, bileşik ışık mikroskobu kullanılarak, 100x yağ daldırma lensi ile 1000x toplam büyütmede görüntülenmiştir. Ölçek çubukları 10 µm'dir. Ortam tipinden sonra parantez içinde verilen Zn2+ ile ilgili durumları temsil eden kısaltmalar şunlardır: R = Zn2+-yeterli, C = Zn2+-kontamine, L = Zn2+-kısıtlı ve D = Zn2+-eksik; diğer kısaltmalar ise şöyledir: WT = yabanıl tip suş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Floresan eksitasyon spektrumu grafiği; dalga boyu ile floresan karşılaştırması; protein çalışması analizi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Şekil 3"> 
Şekil 3: Zn2+-kısıtlı M. tuberculosis hücrelerinde F420 biyobelirteç fenotipinin kaybı; oksotrofik Mtb mc26206 (Mtb-Aux) hücrelerinin temsili floresan taramaları ile gösterilmiştir. Zn2+-kontamine ve Zn2+-kısıtlı büyüme sonuçlarına örnekler, bağımsız medya preparasyonlarından alınmıştır. Zn2+-kısıtlı yabanı tip ve ΔaltRP suşları aynı ZLM serisindendir. Tüm suşlar ve koşullar için üç biyolojik tekrar (n=3) yapılmıştır. Grafikte, farklı medya preparasyonlarının ve suşların biyolojik triplikatlardan sadece bir temsili kültür gösterilmiştir. Floresan taramaları, 8 günlük büyüme sonrası alt okuma modunda, 230 nm ile 440 nm arası eksitasyon dalga boyu aralığında 5 nm adım boyutuyla ve 475 nm emisyon dalga boyu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Medya tipinden sonra parantez içinde verilen ve medyanın Zn2+ durumunu temsil eden kısaltmalar şunlardır: R = Zn2+-yeterli, C = Zn2+-kontamine, L = Zn2+-kısıtlı ve D = Zn2+-tükenmiş; diğer kısaltmalar ise şunlardır: WT = yabanı tip suş, a.u. = keyfi birimler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Bu protokol, mikobakterilerde Zn2+ sınırlı ribozomlar üretmek için Zn2+ sınırlı ortamın, büyüme kaplarının ve tohum kültürlerinin hazırlanmasını detaylandırır. Zn2 + izleri Zn2 + sınırlayıcı büyümeye yol açar ve model bakteri, Mycobacterium smegmatis ve insan patojeni M. tuberculosis'te in vitro olarak Zn2 + sınırlamasını doğrulamak için biyoindikatör olarak kullanılan morfojenik özellikleri tanımlarız.

Mycobacterium smegmatis'in Mikobakterilerde Çinko Sınırlı Büyüme Koşulları için Biyoindikatör Olarak Kullanılması

Many bacteria build alternative ribosomes in Zn2+-limiting growth conditions by replacing Zn2+-binding ribosomal proteins with Zn2+-independent paralogs. ...

using-mycobacterium-smegmatis-as-bioindicator-for-zinc-limited-growth

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Belli koşullarda kültüre zaman Mycobacterium tuberculosis ilaç hoşgörülü biyofilm oluşturmaktadır. Burada kültür M. yöntemleri tarif tuberculosis biyofilmler ve ilaç tolerans persisters sıklığını belirlenmesi. Bu protokoller M. ilaç hoşgörü mekanizmalarına daha sonraki çalışmalar için faydalı olacaktır tüberküloz.

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Güncel tanısal antimikrobiyal duyarlılık testi besin açısından zengin, aerobik koşullarda izolatların planktonik büyüme dayanır. Burada, kistik fibrozis akciğer daha fazla temsilcisi hem aerobik hem de mikroaerofilik şartlarda Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerin antimikrobiyal duyarlılık incelemek için alternatif yapay balgam orta istihdam.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

Kaynak: Gupta, S., ve diğerleri. Demir Sınırlı Mikobakteriler Tarafından Üretilen Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, demir stresini indüklemek ve bakterilerin hayatta kalmasını destekleyen sideroforların salgılanmasını teşvik etmek için Mycobacterium tuberculosis'in demir sınırlı koşullar altında kültürlenmesi prosedürünü göstermektedir.

Mycobacterium tuberculosis'in Demir Sınırlı Koşullar Altında Kültürlenmesi

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Charcoal agar r esazurin assay (CARA), test ajanlarının replike eden, replike olmayan veya her ikisi olan mikobakterilere karşı aktivitesini değerlendirmek için yarı kantitatif, orta verimli bir yöntemdir.  CARA, zamana ve konsantrasyona bağlı aktivitenin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir ve koloni oluşturan birim (CFU) tahlilleri ile izlenecek parametreleri tanımlar.

Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Bu protokol, pelikül biyofilmi geliştirmek için sağlam bir yöntemi tanımlar. Yöntem, farklı kültür hacimlerine ölçeklenebilir ve çeşitli deneysel hedefler için kolay benimseme sağlar. Yöntemin tasarımı, çeşitli mikobakteri türlerinin biyofilm oluşturma potansiyelinin kalitatif veya kantitatif olarak değerlendirilmesini sağlar.

Antimikrobiyal Direnci İncelemek İçin Bir Model Olarak Mikobakteriyel Biyofilm Yetiştirme

Bu çalışma, bakteri canlılığını hızlı bir şekilde değerlendirmek için floresan ve lüminesans kullanarak, yakın zamanda oluşturulmuş bir çift raportör suşu ile Mycobacterium abscessus'a karşı yüksek verimli tarama için bir test geliştirdi. Bu protokol, bu ilaca dirençli bakterilere karşı yeni ilaçları taramayı amaçlayan araştırmacılar için geçerli olacaktır.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Mikobakteriyel patojenik stratejileri tam olarak anlaşılamamıştır. Çoğu türlerin yavaş büyüme hızı, hücre duvar aşılmaz doğa ve patojenler ile çalışan tehlikeleri mikobakteriler zor çalışma yapmak ve bu organizmalar bizim kötü anlamak için büyük ölçüde sorumludur. Bu video, DNA girişi sağlamak için kısa bir yüksek elektrik uyarısı konusu hücreler içerir elektroporasyon tekniği, gösterecektir. Mikobakteriyel hücrelerin içine DNA tanıtmak için en yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.

Mikobakteriler, Elektroporasyon

Keşfedin, Mycobacterium smegmatis'in çinko sınırlı koşullarda biyoindikatör olarak kullanımını. Bu yöntem, mikobakterilerde çinko kısıtlamasına adaptasyonları ve translasyonel olarak aktif alternatif ribozomların üretimini standartlaştırır.

Mycobacterium smegmatis'in Mikobakterilerde Çinko Sınırlı Büyüme Koşulları için Biyoindikatör Olarak Kullanılması

Daha fazla video keşfet