Name: Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Öğrenin, iki foton lazer ablasyonu yöntemiyle Danio rerio larvalarında kemik rejenerasyonunu ve makrofaj bağışıklık yanıtını inceleyin. Bu teknik, kemik iyileşmesinde immünomodülasyonun rolünü anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma protokolü, 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87 izin numaraları olan Landesdirektion Sachsen'den onay aldı. Kullanılan zebra balığı türleri, ulusal yasalara göre ve daha önce açıklandığı gibi standart koşullar altında muhafaza edilmiştir27,28. Çalışmada kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Malzemelerin ve çözeltilerin hazırlanması
<ol><li>Embriyoları 1x E3 ortamında muhafaza edin. 10 L deiyonize su içinde 170 mL 60x E3 stoğunu seyrelterek ve 2 mL %0.1 metilen mavisi ekleyerek 1x E3 ortamını hazırlayın.<ol><li>1 L deiyonize otoklavlanmış su içinde 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.90 g CaCl2·2 H2O, 4.90 g MgSO4·7 H2O'yu karıştırarak 60x E3 medya stoğunu hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Larvaların gömülmesi için, önceden %1 düşük erime noktalı agaroz (LMA) alikotları hazırlayın ve oda sıcaklığında tutun.<ol><li>Alikotları hazırlamak için, LMA'yı 1x E3 ortamında, örneğin bir Erlenmeyer şişesinde 50 mL 1x E3'te 500 mg LMA'yı çözün, çözeltiyi agaroz tamamen eriyene kadar mikrodalgada ısıtın ve 1.5 mL'lik tüplerde 1 mL alikotlara dağıtın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Zebra balığı yetiştiriciliği ve embriyo toplama
NOT: Taahhüt edilen osteoblastların varlığını bildiren çift transgenik zebra balığı larvaları [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 ve makrofajlar [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23] buradakullanılmıştır 30 (Şekil 1A).
<ol><li>Çiftleşmeden önceki akşam standart çiftleşme kafeslerinde istenen tek transgenlere sahip ebeveyn zebra balığı kurun. NOT: Standart çiftleşme kafesleri, yumurtaların ebeveyn zebra balığının ulaşamayacağı daha düşük bir bölmeye geçmesine izin verir.<ol><li>Çiftleşme kafesinde bir bölücü kullanarak çiftleşene kadar erkekleri ve dişileri ayrı tutun. Çiftleşmeyi başlatmak için ertesi günün sabahı bölücüyü çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Öğlen saatlerinde, en geç ebeveyn zebra balığını üreme tanklarından çıkarın ve embriyoları toplayın, çiftleşme kafesindeki suyu bir elek ile süzün. NOT: Larvaların kesin yaşının belirleyici olması durumunda, embriyoları yaklaşık 30 dakikalık düzenli aralıklarla hasat edin. Farklı deney grupları ile yapılan deneylerde debriyaj montaj ilişkileri kullanılmalıdır.</li>
	<li>Embriyoları 1 adet E3 besiyeri içeren 100 mm çapında bir kabın içine yerleştirin ve 28 °C'de bir inkübatörde saklayın31.</li>
	<li>Döllenmemiş yumurtaları ve ölü embriyoları stereomikroskop yardımıyla plastik bir pipet kullanarak tabaktan çıkarın ve günde 1 adet E3 ortamını değiştirin.</li>
	<li>Deneyden önce, bir floresan stereomikroskop kullanarak raportör transgenleri için pozitif larvaları sıralayın.</li>
</ol>3. Düşük erime noktalı agaroz içine gömülen larvalar
<ol><li>LMA alikotlarını 65 °C'de bir termoblok veya su banyosunda eritin. LMA eridikten sonra, gömülene kadar 42 °C'de tutun (Şekil 1B). Anestezi için% 0.02 MS-222 konsantrasyonu elde etmek için erimiş 1 mL LMA alikotuna 50 μL% 0.4 MS-222 ekleyin.</li>
	<li>% 0.02 MS-222 E3 ortamında 4 dpf (döllenmeden sonraki gün) larvaları (veya daha yaşlı larvaları) anestezi altına alın.</li>
	<li>Anestezi uygulanmış larvaları 3 mL'lik bir plastik Pasteur pipeti kullanarak cam tabanlı bir mikrokuyu kabına aktarın ve aynı pipetle fazla E3 ortamını çıkarın (Şekil 1B). Larvaların kurumasını önleyin. NOT: Bir tabağa aynı anda birden fazla larva gömülebilir; Yerleştirme için yeterli zaman tanımak için 3 ila 5 larva yerleştirilmesi önerilir.</li>
	<li>Erimiş LMA agarozunu su banyosundan/termobloktan alın ve larvaların yerleştirildiği cam tabanı kaplayacak şekilde tabağa bir (soğutma) damla LMA ekleyin. LMA'nın çok sıcak olmamasına rağmen yine de sıvı olmasına dikkat edin.</li>
	<li>Ardından, agaroz katılaşmadan önce larvaları istenen yanal pozisyona yerleştirin. Burada, ters mikroskop kurulumuna hazırlık olarak operkülün tabağın cam tabanına mümkün olduğunca yakın olduğu bir yanal konum sağlayın (Şekil 1B).</li>
	<li>Agarozun katılaşmasına izin verin ve ardından agarozun kurumasını önlemek için tabağa E3 ortamı (maksimum% 0.02 MS-222 içeren) ekleyin (Şekil 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig01.jpg"> Şekil 1: Gömme prosedürünün şematik gösterimi. (A) Çift transgenik Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 zebra balığı larvaları, yeşil işaretli operküler osteoblastlar ve kırmızı ile işaretlenmiş makrofajlar kullanıldı. (B) Protokolün 3. adımında açıklandığı gibi gömme prosedürünün iş akışı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Larvaların in vivo görüntülenmesi ve lazer ablasyonu
<ol><li>Transgenik zebra balığı Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, 25x/0.95 su objektifi veya eşdeğer bir kuruluma sahip ters çevrilmiş iki fotonlu lazer tarama mikroskobu kullanın.</li>
	<li>Gömülü larvaların bulunduğu tabağı ters çevrilmiş mikroskopta mikroskobik aşamaya yerleştirin ve ablasyon için istenen bölgeyi görüş alanının ortasına yerleştirin. Operkül, GFP floresan sinyalinin yardımıyla kolayca tanımlanabilir.</li>
	<li>Operkül mikroskobun görüş alanına odaklandıktan ve ortalandıktan sonra, operkülün tüm genişliğini görüntülemek için z-yığını ayarlarını seçin (genellikle 1-2 μm z-aralıkları kullanılır). Aynı zamanda, ablasyon yapılacak belirli bir z düzlemindeki alanı seçin (genellikle operkülün arka bölgesinde). İki fotonlu lazer ablasyonu sadece bu düzlemde uygulanır. NOT: Z boyutunda daha yüksek çözünürlük, daha uzun görüntüleme sürelerine yol açacak ancak daha sonra elde edilen verilerin hacimsel analizlerini mümkün kılacaktır.</li>
	<li>Ablasyondan önce ilgilenilen ameliyat alanını görüntüleyin. GFP tespiti için 488 nm'de beyaz ışıklı bir lazer ve 495 nm ila 550 nm veya eşdeğeri arasında değişen bir hibrit dedektör kullanın. Makrofajları, hibrit bir dedektörde (veya eşdeğeri) 595 ila 780 nm mCherry algılama aralığı ile 555 nm (beyaz ışık lazeri) uyarımı kullanarak görüntüleyin.<ol><li>İyi bir kalite/zaman oranı için 512 x 512 görüntü formatını kullanın (daha yüksek çözünürlük veya alternatif olarak daha yüksek hız isteniyorsa diğer formatlar da kullanılabilir). NOT: Mikroskoba monte edilen sıcaklık kontrollü bir inkübatör kullanılabilir ve örneğin 28 °C'ye ayarlanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>ROI aracını kullanarak operkülü odaklayarak, seçilen bir 2B düzlemde 25 μm çapında dairesel bir bölge çizin (deneye bağlı olarak başka şekiller ve boyutlar seçilebilir).</li>
	<li>Ablasyonu gerçekleştirmek için, 450 mW'ta ablasyon gücü (objektif olmadan ölçülür) uygulayın ve seçilen alanı 400 Hz tarama hızında ve toplam 10 saniye süreyle iki fotonlu lazere maruz bırakın. Ablasyon sırasında alan, 401-443 nm veya eşdeğeri aralığında bir hibrit dedektör kullanılarak görüntülenebilir.</li>
	<li>Ablasyondan sonra, ablasyondan önce kullanılanla aynı ayarlarla aynı z-yığınını tekrar görüntüleyerek ablasyonu yapısal olarak onaylayın. Ablasyon yapılan alan artık floresan hücreler içermez.</li>
</ol>5. Larvaların geri kazanılması ve bağışıklık hücresi alımını izlemek için görüntüleme
<ol><li>İmmün hücre alımının görüntülenmesinin gecikmeli olarak yapılması gerekiyorsa, larvaları görüntüleme ve anesteziden kurtarın. Forseps veya diseksiyon iğnesi kullanarak larvaları LMA'dan dikkatlice çıkarın.<ol><li>İlk olarak, larvaları kaplayan bir agaroz tabakasını çıkarın. İkinci olarak, agarozu larvalarla doğrudan temas halinde çıkarın. Bağışıklık hücresi alımının anında görüntülenmesi gerçekleşiyorsa bu adımı atlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Larvaları saf E3 ortamı olan bir tabağa geri koyun ve iyileşmelerini kontrol edin. İyileşme, larvaların yüzmesi ile belirgindir.</li>
	<li>4 veya 6 hpl'de (lezyondan sonraki saatler), ablasyonun makrofaj alımı üzerindeki etkilerini kontrol etmek için aynı mikroskopta aynı ayarları kullanarak ameliyat alanını tekrar görüntüleyin. Bunu yapmak için, gömmeyi (3. adım) ve görüntülemeyi daha önce gerçekleştirildiği gibi tekrarlayın (4. adım).</li>
	<li>Görüntülemeden sonra larvaları LMA'dan çıkarın. Larvaların kurban edilmesi, yasal gerekliliklere bağlı olarak buzlu suda inkübasyon yoluyla veya E3'te aşırı dozda MS-222 ile gerçekleştirilebilir. Örnekler daha sonra takip çalışmaları için kullanılabilir veya atılabilir.</li>
</ol>6. Görüntü analizi ve istatistiksel analiz
<ol><li>Görüntüleri Fiji32 gibi bir görüntü işleme yazılımı kullanarak işleyin. Elde edilen verilerin z-çözünürlüğüne bağlı olarak, analizler 2D veya 3D olarak gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Makrofajları, ana hücre gövdelerini ayırt etmek gibi açıkça ayrı olan hücreleri dahil ederek veya alternatif olarak bir nükleer etikete sahip hücreleri ölçerek veya hücrelerin örtüşmesi durumunda alanı ölçerek (bir sonraki adım) manuel olarak ölçün.</li>
	<li>Alanın ölçülmesi için makrofajları kapsayan bir maske oluşturun. Bunu yapmak için Image &gt; Adjust &gt; Threshold aracını kullanın ve Fiji'de bir ROI (ROI Manager &gt; Add'&gt; Analiz &gt; Araçları) oluşturun. Miktar tayini için arka plandaki küçük parçacıkları hariç tutun.<ol><li>Ardından alanı ölçün (Analiz &gt; Ölçün). Çakışan hücresel floresan alanlarının ölçüme dahil edilmesi gerekip gerekmediğini göz önünde bulundurun. NOT: Burada, bu alanda işe alınan makrofajlar ayırt edilemediği için dairesel ablasyon alanı alan ölçümlerinden çıkarılmıştır.</li>
	</ol></li>
	<li>Uygun yazılımı kullanarak ölçüm sonuçlarını çizen grafikler oluşturun. Ablasyondan önce ve sonra verileri karşılaştırmak için uygun bir istatistiksel test yapın (burada, eşleştirilmiş tek kuyruklu bir t-testi yapıldı). NOT: Şekiller fotoğraf düzenleme ve grafik tasarım yazılımları kullanılarak hazırlanabilir.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Larvalarında Kemik Rejenerasyonunu İncelemek için Lazer Ablasyon Yöntemi

<ol><li>Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+regeneration%3A+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Model systems for regeneration: Zebrafish.</a> Dev. 146 (18), dev167692(2019).</li>
<li>Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+biology+and+disease+modeling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal biology and disease modeling in zebrafish.</a> J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).</li>
<li>Geurtzen, K., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+injury+models+to+study+the+effects+of+prednisolone+in+regenerating+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue.</a> J Vis Exp. (140), e58429(2018).</li>
<li>Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+zebrafish+bone+crush+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A new zebrafish bone crush injury model.</a> Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).</li>
<li>González-Rosa, J. M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoinjury+as+a+myocardial+infarction+model+for+the+study+of+cardiac+regeneration+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish.</a> Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).</li>
<li>Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+fin+regeneration+after+cryoinjury-induced+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage.</a> Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).</li>
<li>Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+amputated+zebrafish+fin+rays+from+de+novo+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts.</a> Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast+production+by+reserved+progenitor+cells+in+zebrafish+bone+regeneration+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance.</a> Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).</li>
<li>Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+osteoblast+ablation+triggers+a+pro-osteogenic+inflammatory+response+regulated+by+reactive+oxygen+species+and+glucocorticoid+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish.</a> Dev. 149 (8), 1998030(2022).</li>
<li>Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscope-based+laser+ablation+and+regeneration+assay+in+zebrafish+interneuromast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells.</a> J Vis Exp. (159), e60966(2020).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> J Vis Exp. (54), e2845(2011).</li>
<li>Goldstein, A. M., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord+regulates+cardiac+lineage+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).</li>
<li>Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+sonic+hedgehog-a-expressing+cells+during+fin+regeneration+affects+ray+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).</li>
<li>Marshall, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+cell+and+tissue+level+laser+ablation+methods+to+study+morphogenetic+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics.</a> Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).</li>
<li>Angelo, J. R., Tremblay, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+cell+ablation+during+post-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development.</a> Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+pancreatic+cancer+using+a+cylindrical+light+diffuser%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser.</a> Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).</li>
<li>Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+for+cerebral+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Clin+N+Am%22%5BJournal%5D)">Laser ablation for cerebral metastases.</a> Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).</li>
<li>Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+laser+ablation+to+measure+cell+and+tissue-generated+forces+in+the+zebrafish+embryo+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo.</a> Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).</li>
<li>Vogel, A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pulsed+laser+ablation+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues.</a> Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).</li>
<li>Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-based+tumor+ablation%3A+Role+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-based tumor ablation: Role of the immune response.</a> Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).</li>
<li>Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Identification+of+dying+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Identification of dying cells.</a> Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).</li>
<li>Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+tissue+regeneration+by+modulating+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Promoting tissue regeneration by modulating the immune system.</a> Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).</li>
<li>Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+modulate+adult+zebrafish+tail+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration.</a> Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).</li>
<li>Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppressive+and+bone+inhibitory+effects+of+prednisolone+in+growing+and+regenerating+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues.</a> J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).</li>
<li>Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+in+the+regenerating+fin+reflect+tissue+homeostasis+disturbances+in+zebrafish+by+affecting+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol.+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling.</a> Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Breeding+and+Embryo+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+II%3A+Mouse%2C+Zebrafish%2C+and+Chick%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Breeding and Embryo Handling.</a> Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+combines+with+planar+polarised+patterning+during+metaphase+to+orient+embryonic+epithelial+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions.</a> Dev. 151 (10), dev202862(2024).</li>
<li>Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+complexity+of+cell+death%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity and complexity of cell death: A historical review.</a> Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).</li>
<li>O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zones+of+cellular+damage+around+pulsed-laser+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds.</a> PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).</li>
<li>Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+clearance+of+damaged+tissue+following+laser+ablation+in+engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues.</a> APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).</li>
<li>Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat, CaCl2&middot; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Kabı, PS, 100/20 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Foceps</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td>Uç şekli düz, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm</td></tr><tr><td>Falcon 6 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>353502</td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı mikro kuyu kabı</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm Çanak, No. 1.5 Lamel, 14 mm Cam Çapı, Kaplamasız</td></tr><tr><td>Insight X3 multifoton lazer</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite</td><td>LAS X, Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz&nbsp;</td><td>Biozyme</td><td>840101</td><td>Biozym Plak Agaroz</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat, MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Çiftleşme kafesleri</td><td></td><td></td><td>birçok çeşit, örneğin Tecniplast</td></tr><tr><td>Methyleneblue</td><td>Carl Roth</td><td>A514.1</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür, KCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131494</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür, NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>SP8 ŞAHIN&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Insight X3 multifoton lazer ve Leica Application Suite yazılımı ile donatılmıştır</td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Diseksiyon İğnesi</td><td>Bochem</td><td>12010</td><td>140 mm</td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop Sistemi SZX16</td><td>Olympus</td><td></td><td>LED aydınlatma tabanı ile donatılmıştır SZX2-ILLTQ</td></tr><tr><td>Termostatik Dolaplar TS - WTW</td><td>ksilem</td><td>TS 608/2-i</td><td>İnkübasyon (embriyo) transferi için</td></tr><tr><td> pipet, 3,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>861171</td><td>155 x 15 mm, LD-PE, şeffaf</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V12 sürüm 4.7.1.0.</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axiocam MRm kamera ve AxioVision yazılımı ile donatılmıştır</td></tr></tbody></table>

gelişmekte olan zebra balığı larvalarında osteoblastların İki foton lazer aracılı ablasyonu

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

Lazer ablasyon yukarıdaki protokolde belirtildiği gibi yapıldı. Ablasyon yapılan bölgedeki osteoblastların GFP sinyali, ablasyondan sonra anında kayboldu. Osteoblast ablasyonunun immün yanıt açısından yanıtını incelemek için, 6 dpf larvasında 6 hpl öncesi ve sonrasında makrofaj varlığı görüntülendi. Ablasyondan önce, operkül alanında10 çok az makrofaj gözlendi (Şekil 2). 6 hpl'de, ablasyonlu operkül bölgesinde güçlü bir makrofaj birikimi ve operkül ve operkülü çevreleyen alan da dahil olmak üzere görüş alanında artmış sayıda makrofaj tespit edildi10 (Şekil 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig02v2.jpg"> Şekil 2: 6 dpf zebra balığı larvasında 6 hpl'de makrofaj alımı. Ablasyon yapılmayan ve 6 hpl'de ameliyat alanı. Operküler osteoblastlar yeşil renkte, makrofajlar macenta renkte etiketlenmiştir ve kesikli daire lazerle kesilmiş alanı gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Makrofaj alımı, 4 hpl'de çok daha küçük operküllerle 4 dpf larvasında da analiz edildi ve benzer sonuçlar gözlendi (Şekil 3). Makrofaj sayısının nicelleştirilmesi (acil lazer ablasyon bölgesi dışında), incelenen zaman çerçevesi içinde bir artış gösterdi (ablasyondan önce 4.00 ± 2.37 makrofaj, 4 hpl'de 7.00 ± 2.76 makrofaj) (Şekil 3B). Benzer şekilde, makrofaj alanı (ablasyondan önce μm2, 785.8 μm2 ± 723.1 μm2 olarak ölçülürken, 4 hpl'de 1553 μm2 ± 869.9 μm2 olarak ölçülmüştür) artmıştır (Şekil 3C). Makrofajların ayırt edilmesi bazen zor olduğundan, burada yapıldığı gibi makrofaj sayısı yerine makrofaj alanının ölçülmesi önerilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig03.jpg"> Şekil 3: 4 dpf zebra balığı larvasında 4 hpl'de makrofaj alımı. (A) Ablasyon olmadan ve 4 hpl'de operkül alanı. Operküler osteoblastlar yeşil renkte, makrofajlar macenta renkte etiketlenmiştir ve kesikli daire lazerle kesilmiş alanı gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. (B) Operkül alanındaki makrofaj sayısının doğrudan ablasyondan önce (0 hpl) ve ablasyondan sonra (4 hpl) ölçülmesi. (C) Makrofaj alanının ölçülmesi (lazer ablasyon bölgesi hariç). Eşleştirilmiş tek kuyruklu t-testleri. Her nokta bir larvanın verilerini temsil eder ve SD ± ortalama gösterilir, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

two-photon-laser-mediated-ablation-osteoblasts-developing-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile...

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Burada sunulan yöntem, yüksek enerjili lazer darbeleri ve zamanla bu yaralanmalar ve kurtarma ileri analizi ile canlı zebrafish embriyo kesin hasar oluşur. Ayrıca genetik olarak tek etiketli veya iskelet kas hücre gruplarının sırasında ve lazer ışık kaynaklı hasar sonrası takip edilebilir göstermek.

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Bu video, iki foton lazer aksotomi kullanarak ve yaralanmadan aksonal iyileşmeyi gözlemleyerek zebra balığı embriyolarında aksonları yaralama yöntemini açıklamaktadır.

İki Fotonlu Lazer Aksotomi: Zebra Balığı Embriyolarında Aksonları Yaralamak ve Aksonal İyileşmeyi Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Source: Morsch, M.,  vd. al., Konvansiyonel UV Lazer Konfokal Mikroskopi Kullanarak Hücre Stresini ve Ölümünü Tetikleme. J. Vis. Exp. (2017) Bu videoda, transgenik zebra balıklarında tek tek nöronları hassas bir şekilde hedeflemek ve incelemek için yüksek yoğunluklu UV lazer ablasyon tekniğini keşfediyoruz. Yaralanma ve iyileşmenin hücresel dinamiklerini vurgulayarak nöronal tepkilerin nasıl hazırlanacağını, hareketsiz hale getirileceğini ve görselleştirileceğini gösteriyoruz.

Konfokal Mikroskop Kullanılarak Zebra Balığı Larvasında Seçici Tek Nöron Lazer Ablasyonu

Source: Muto, A., et al. İki Fotonlu Lazer Kullanılarak Bir Nöronal Popülasyonun Ablasyonu ve Zebra Balığı Larvalarında Kalsiyum Görüntüleme ve Davranışsal Kayıt Kullanılarak Değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Bu videoda, agarozla hareketsiz hale getirilmiş zebra balığı larvalarında floresan nöronların seçici olarak yok edilmesini sağlayan iki fotonlu bir lazer ablasyon prosedürü gösterilmektedir. İşlemden önce ve sonra...

Bir Zebra Balığı LarAva'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Hedeflenen Nöronal Ablasyon

Burada, zebra balığı larvaları üzerinden bir iki fotonlu lazer nöronların genetik olarak etiketlenmiş bir subpopulation ablate için bir protokol mevcut.

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Embriyonik gelişim, hücre hareketinin büyük ölçekli koordinasyonunu gerektirir. İki fotonlu ekscitasyon aracılı lazer ablasyon, büyük derin hücre gruplarının mekansal olarak kontrol edilen 3 boyutlu ablasyonunu sağlar. Ek olarak, bu teknik , in vivo olarak toplu olarak göç eden hücrelerin mekanik ortamlarındaki pertürbasyonlara reaksiyonlarını araştırabilir.

Zebrafish Gastrula'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Derin ve Mekansal Kontrollü Hacim Ablasyonları

Zebra balığı larva kuyruk yüzgeci rejenerasyonunun dinamiklerini parlak alan tabanlı stereomikroskopi kullanarak tüm doku ölçeğinde yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, tek hücre çözünürlüğü ile rejenerasyon dinamiklerinin yakalanmasını sağlar. Bu metodoloji, bir CCD kamera ve hızlandırılmış yazılım ile donatılmış herhangi bir stereomikroskoba uyarlanabilir.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

Öğrenin, iki foton lazer ablasyonu yöntemiyle Danio rerio larvalarında kemik rejenerasyonunu ve makrofaj bağışıklık yanıtını inceleyin. Bu teknik, kemik iyileşmesinde immünomodülasyonun rolünü anlamaya yardımcı olur.

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu

Daha fazla video keşfet