Name: Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Keşfedin, CRISPR-Cas9 ile insan embriyonik kök hücrelerinde L2HGDH gen delesyonunu. Lentiviral taşıma sistemi kullanılarak pluripotensiyel ve farklılaşma potansiyeli korunarak stabil gen knockoutu sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+structures+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 structures and mechanisms.</a> Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Xue, C., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathway+choices+in+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome-editing+system+in+human+stem+cells%3A+Current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).</li>
<li>Qiu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+regulation+of+D2HGDH+and+L2HGDH+influences+the+epigenome+and+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome.</a> Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).</li>
<li>Sheikh, M. A., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+mediated+delivery+of+shRNAs+to+hESCs+and+NPCs+using+low-cost+cationic+polymer+polyethylenimine+%28PEI%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI).</a> J Vis Exp. (183), e63953(2022).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+cost-effective+method+for+screening+of+CRISPR%2FCas9-induced+homozygous%2Fbiallelic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants.</a> Plant Methods. 14 (1), 40(2018).</li>
<li>Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+fatty+acid+alters+embryonic+cortical+neurogenesis+through+modulation+of+gene+expression+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells.</a> J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation.</a> Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-sensitive+protein+O-GlcNAcylation+modulates+the+transcriptome+through+epigenetic+mechanisms+during+embryonic+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis.</a> Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modeling+of+hepatogenesis+using+obese+iPSCs-hepatocyte+differentiation+uncovers+pathological+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features.</a> Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+hepatocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells%3A+Growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor.</a> Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).</li>
<li>Jacobs, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+na%C3%AFve+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).</li>
<li>Cuevas-Ocaña, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+optimized+approach+for+rapid+and+efficient+gene+editing+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN-targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li>
<li>Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+analysis+reveals+high+specificity+of+CRISPR%2FCas9+and+TALEN-based+genome+editing+in+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-MERKAPTOETANOL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38.5 mL, Steril + Sertifikalı Ücretsiz Üstü Açık İnce Duvar Ultra Şeffaf Tüpler</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF Rekombinant insan</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury Tavşan mAbklonal</td><td></td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Bodrum Membran Matrisi, LDEV içermeyen</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Siklopamin</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ortamı</td><td>İnvitrojen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM BESIN KARIŞIMI F12&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/o: Ca ve Mg</td><td>PAN</td><td>Biotech P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovie serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FoxA2 / HNF3 & beta; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Tavşan mAb Antikoru</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Nazik Hücre Ayrışması Reaktifi</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA) 100x Çözelti</td><td>GE sağlık</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) Tavşan mAb</td><td>CST</td><td>9129</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Değişimi</td><td>İnvitrojen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L GLUTAMIN, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>Makrojen</td><td></td><td>CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH Poliklonal antikor</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>Makrojen</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>Makrogen</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>Makrogen</td><td></td><td>CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>Makrogen</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC</td></tr><tr><td>L2H-SeqF1</td><td>Makrogen</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>Makrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 komple medya</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog Antikor</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>NÖROBAZAL ORTAM 1x CTS</td><td>İnvitrojen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Ek 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Ek 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Antikor</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP Tavşan mAb</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>PENİSİL STREPTOMYCIN SOL</td><td>İnvitrojen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Polibren enfeksiyon reaktifi</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin, dallı</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Lentivirus Titre Kiti</td><td>Abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>Kaya inhibitörü Y-27632 dihidroklorür ve nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 Antikoru</td><td>CST</td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>TRIPSIN .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GAGGGCCTATT TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>Sihirbazı Genomik DNA Saflaştırma Kiti&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

besleyicisiz koşullar altında kültürlenen İnsan pluripotent kök hücrelerinde crispr-cas9 aracılı gen delesyonuna

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

L2HGDH sgRNA'ların lentiCRISPRv2 puro'da klonlanması lentiCRISPRv2 puro vektörü ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve BsmB1 ile sindirildi, bu da 1.8 Kb'lik bir doldurma parçasının serbest bırakılmasıyla sonuçlandı. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, vektörün tam bir sindirimi gözlendi. Her yapı için, altı klon, bir primer olarak ters sgRNA dizisi ve vektör dizisi içinden bir ileri primer (U6-459F) kullanılarak ekin varlığı veya yokluğu açısından tarandı. Bu yaklaşımı kullanarak, Şekil 2B'de gösterildiği gibi, yalnızca eke sahip klonlar 288 bp'lik bir PCR ürünü verdi ve sgRNA'nın ters dizisini içermeyen negatif klonlar, hiçbir PCR ürünü ile sonuçlanmadı.
H9 enfeksiyonları, stabil seçimler ve Western blot hESC'ler, L2HGDH geninin ekzon 1'ini hedef alan iki farklı sgRNA'yı eksprese eden lentiviral partiküller ile enfekte edildi ve puromisin ile seçildi. Kullanılan iki sgRNA'dan hangisinin gen delesyonunu indüklemede daha verimli olduğunu belirlemek için, kararlı bir şekilde birlikte eksprese eden sgRNA ve Cas9 hücrelerinin heterojen popülasyonlarından Western blot analizi yapıldı. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, L2HGDH-sgRNA-1, heterojen hücre popülasyonlarında L2HGDH ekspresyonunu azaltmada diğer diziden daha verimliydi.
Klonal seçim, genişletme ve protein analizi L2HGDH-sgRNA-1 eksprese eden hücreler için tek hücre seçimi ve klonal genişleme yapıldı. Tek klonlar veren kuyucuklar, kolonilerin daha da genişlemesi, kriyoprezervasyon ve analiz yapması için yeterli bir boyuta (genellikle 2 hafta) ulaşılana kadar işaretlendi ve büyütüldü (Şekil 3B). Toplam 22 klon, L2HGDH için beş homozigot nakavt (% 23) veren Western blot analizi kullanılarak analiz edildi. Bu sonuç, tek bir kasetten hem sgRNA hem de Cas9'un kararlı ko-ekspresyonu için lentiviral aracılı gen iletimi kullanılarak yüksek bir gen nakavt verimliliğini göstermektedir. Şekil 4, kontrol hücreleri ile birlikte beş homozigot nakavt klonunun Western blot analizini göstermektedir ve seçilen klonlardaki kontrole kıyasla 0 azaltılmış ekspresyon göstermektedir.
DNA düzeyinde analiz Cas9'un PAM tanıma dizisinin yukarı akışındaki CRISPR mutasyon bölgesini haritalamak için, kontrol hücrelerinden ve beş farklı klondan alınan genomik DNA kullanılarak Mutasyon Bölgelerine Dayalı Spesifik Primerler Polimeraz Zincir Reaksiyonu (MS-BSP PCR) gerçekleştirildi. Şekil 5'te gösterildiği gibi, iki klon (A5 ve B4) PAM tanıma dizisine hemen yakın mutasyonlara sahipken, diğer üç klon (A1, A9 ve B12) mutasyonun PAM bölgesine çok yakın olmayabileceğini ve L2HGDH geninin ekzon 1'i içindeki 20bp sgRNA dizisinin daha yukarısında olduğunu gösterdi.
DNA'daki kesin mutasyonları bulmak için, kontrol hücrelerinden (sadece vektör enfekte H9) saflaştırılmış PCR ürünleri ve ayrıca üç farklı CRISPR klonu, A5, A1 ve B4, Sanger dizilemesine tabi tutuldu ve mutasyon bölgeleri, PAM bölgesi8'in yukarı akışında çoklu hizalama aracı kullanılarak haritalandı. Sonuçlar, PAM bölgesinin yukarı akışındaki A5 klonunda delesyon mutasyonunu ortaya çıkardı. Diğer iki klon, A1 ve B4, Şekil 6'da vurgulandığı gibi, PAM bölgesinin yukarı akışında insersiyonel mutasyon gösterdi.
Klonların fonksiyonel analizi hESC'lerde CRISPR nakavt hücre hatlarının üretilmesi üzerine, bir sonraki adım, pluripotentliklerini ve farklılaşma potansiyellerini doğrulamaktır. Bu amaçla, A1, A5 ve B4 olmak üzere üç farklı klon için farklı pluripotentlik belirteçlerini test ettik ve sonuçları kontrol (yalnızca vektör ile enfekte olmuş H9) hücreleriyle karşılaştırdık. Sonuçlar, OCT4, NANOG ve SOX2 belirteçleri için immün boyama ile belirlenen nakavt hücre hatlarının pluripotens potansiyelinde hiçbir değişiklik göstermedi. Daha sonra, kontrol ve nakavt hücre hatları, hücre proliferasyon belirteci KI67 için de boyandı ve bu da kontrole kıyasla nakavt hücre hatlarında hiçbir değişiklik göstermedi. Bu sonuçlar, CRISPR nakavtının bu hücrelerin kendini yenileme özelliklerini etkilemediğini göstermektedir. Ek olarak, EB ve koloni oluşumu da etkilenmemiştir (Şekil 7). Laboratuvarımızda kurulan in vitro yöntemler kullanılarak, tüm klonlar, PAX6 (nöroektoderm belirteci), Brachyury (mezoderm belirteci) ve FOXA2 (endoderm belirteci) için immün boyama ile doğrulandığı gibi üç germ tabakası hücresine başarıyla farklılaştırıldı. Kontrol hücrelerine kıyasla nakavt hücre hatlarının farklılaşma potansiyelinde herhangi bir değişiklik gözlenmedi, bu da nakavt hücrelerinin farklılaşma potansiyellerini koruduğunu gösterdi (Şekil 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig01.jpg"> 
Şekil 1: Etüt tasarımını 5 adımda gösteren şematik diyagram. Adım 1: sgRNA'ların Bsmb1 sindirilmiş V2 CRISPR vektörüne tasarlanması ve klonlanması. Adım 2: Polifeksiyonlar ve ultrasantrifüjleme kullanılarak viral konsantrasyon kullanılarak HEK293T hücrelerinin birlikte transfekte edilmesiyle paketleme plazmitleri ile birlikte sgRNA taşıyan giriş vektörü kullanılarak lentiviral partiküllerin üretilmesi. Adım 3: 10-20 MOI'de lentiviral partiküller kullanılarak hESC'lerin enfeksiyonu ve puromisin kullanılarak stabil hücre seçimi ve ardından sgRNA'ların etkinliğini görmek için heterojen hücre popülasyonlarının analizi. Adım 4: Heterojen popülasyonlarda maksimum yıkım gösteren hücrelerden seyreltme yöntemiyle tek hücre klonlama ve tek klon seçimi. Adım 5: Tek klonların genişletilmesi ve DNA düzeyinde analiz, protein ve klonların saplılık ve farklılaşma potansiyeli için fonksiyonel analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig02.jpg"> 
Şekil 2: lentiCRISPR V2.puro vektöründe sgRNA'ların klonlanması. (A) lentiCRISPR V2.puro vektörünün kısıtlama enzimi BsmB1 ile sindirimi. Ok, vektörün sindirimi üzerine salınan 1.8 Kb'lik bir doldurma parçasını gösterir. (B) L2HGDH sgRNA yapı 1 ve 2'nin farklı klonları için koloni PCR analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig03.jpg"> 
Şekil 3: Tek hücreli seçim kullanılarak western lekeleri ve klonal yayılım. (A) Kontrol (C) H9 hESC'leri ile birlikte, kararlı bir şekilde birlikte eksprese eden sgRNA (L2H-1 ve L2H-2) ve Cas9'un heterojen popülasyonlarının iki farklı biyolojik replikasından (S1 ve S2) Western blot analizi. (B) L2HGDH-sgRNA-1'i stabil bir şekilde eksprese eden H9 hücrelerinin tek hücre seçimi ve klonal genişlemesi. Oklar, yalnızca tek klonları gösteren 96 kuyulu plakanın kuyularını gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig04.jpg"> 
Şekil 4: H9'un farklı klonlarından Western blot analizi. (AC) 22 klonun toplam hücre lizatlarından Western blot analizi, L2HGDH için beş homozigot nakavt (#) verdi. (D) Western blot kullanılarak yapılan farklı bir biyolojik replikat deneyinden L2HGDH nakavtlarının doğrulanması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig05.jpg"> 
Şekil 5: Farklı H9 klonlarının MSBSP PCR analizi. (A) MSBSP PCR analizi için kullanılan L2HGDH ekzon 1'in dizi analizi. (B) Kontrol ve H9 V2 L2HGDH KO Clone B4 kullanılarak MSBSP PCR analizi için tavlama sıcaklığının optimizasyonu. 96.8'de, kontrol bir bant gösterir, ancak B4 oklarla gösterildiği gibi bir bant göstermez. (C) Tüm homozigot KO klonlarının analizi, ekzon 1 içindeki mutasyon bölgesinin aşağıdaki haritalanmasıyla sonuçlandı. A1 = In/Del, PAM sahasına yakın değil; A5 = PAM sahasına yakın/Del; A9 = In/Del PAM sahasına oldukça yakın; B4 = In/Del PAM sahasına çok yakın B12 = In/Del PAM sahasına yakın değil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig06.jpg"> 
Şekil 6: Sanger dizili PCR ürünlerinin referans L2HGDH ekzon 1 dizisi ile hizalanması. A1, A5 ve B4'ten Sanger dizili PCR ürünlerinin ve kontrol hücrelerinin çoklu hizalamaları, NCBI veritabanından L2HGDH'nin ilk ekzonu içinde bir referans dizisi ile birlikte yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig07.jpg"> 
Şekil 7: CRISPR nakavt hücre hatlarının fonksiyonel karakterizasyonu. (A) Hücreler, kontrol ile enfekte olmuş H9 hESC'lere göre pluripotens belirteçleri (OCT4, NANOG, SOX2), kendini yenileme (KI67), EB'ler ve koloni oluşumu için immün boyandı. Ölçek çubukları: 100 μM. (B) Pozitif (+ve) eksprese eden hücrelerin yüzdesi DAPI boyamaya göre hesaplandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig08.jpg"> 
Şekil 8: CRISPR nakavt hücre hatlarının farklılaşma potansiyeli. Kontrol ile enfekte olmuş H9 hücrelerine göre PAX6 (nöroektoderm), Brachyury (mezoderm) ve FOXA2 (Endoderm) için belirteçler kullanılarak CRISPR nakavt hücre hatlarının farklılaşma potansiyelleri açısından fonksiyonel karakterizasyonu. Ölçek çubukları: 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protokol adımı</td>
			<td>Gereken süre</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LentiCRISPRv2'de sgRNA'ların klonlanması</td>
			<td>4 gün</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentivirüs üretimi ve titresi tayini</td>
			<td>5 gün</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC enfeksiyonları, stabil hücre seçimleri ve genişleme</td>
			<td>2 hafta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek hücreli klonal seçim ve genişletme</td>
			<td>2 hafta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klonların fonksiyonel analizi</td>
			<td>2 hafta</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Protokol adımları için zaman çizelgesi ve gereken tahmini süre.

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...

crispr-cas9-mediated-gene-deletion-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Geliştirici aktivitenin deneysel doğrulamasına en iyi fonksiyon kaybı analizi ile yaklaşılır. Burada, hibrit bir genom (Mus musculus129 x Mus castaneus) içeren F1 ES hücrelerinde gen transkripsiyonunun alele özgü regülasyonunu incelemek için CRISPR/Cas9 aracılı delesyon kullanan etkili bir protokol sunulmaktadır.

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) genom düzenlemesi hızlı ve verimli bir şekilde yapılabilir. Burada, EGFP'yi eksprese etmek ve antibiyotik direncini ortaya çıkarmak için AAVS1 güvenli liman lokusunun düzenlenmesiyle örneklendiği gibi, hPSC'leri genetik olarak tasarlamak için sağlam bir deneysel prosedür sunulmaktadır.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Protokoller iCRISPR platformu kullanılarak hPSC mutan çizgileri oluşturmak için ve tarif edilen glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere hPSCs ayırt etmek. hPSC yönettiği farklılaşma ile genom düzenleme teknolojisini birleştirerek insan gelişimi ve hastalık seyrinde soy belirleyicilerinin rolü sistematik analizi için güçlü bir platform sunmaktadır.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Bu iletişim kuralı koşullarda besleyici içermeyen insan pankreas hücreleri ayak izi-Alerjik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) nesil ayrıntılı olarak anlatılmaktadır kullanarak CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ve değiştirilmiş karakterizasyonu düzenleyerek takip tek hücre klonlar.

Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Burada açıklanan endogenously etiketleme için bir protokol proteinler insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler CRISPR/Cas9 kullanarak floresan etiketleri ile ifade olmasıdır. Putatively düzenlenen hücreleri hücre aktif floresans sıralayarak zenginleştirilmiş ve klonal hücre satırları oluşturulur.

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Aşağıdaki protokolü tam nakavt Serum Yedek Besleyici Ücretsiz orta (KSR-FF) kullanarak besleyici ücretsiz kültür, insan kaynaklı Pluripotent Kök (IPS) Hücreler uyarlanması için talimat sağlar. Bir kez, adapte sürekli bakım için talimatlar ayrıca verilmiştir.

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

Keşfedin, CRISPR-Cas9 ile insan embriyonik kök hücrelerinde L2HGDH gen delesyonunu. Lentiviral taşıma sistemi kullanılarak pluripotensiyel ve farklılaşma potansiyeli korunarak stabil gen knockoutu sağlanır.

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

Daha fazla video keşfet