In vivo (İn canlı) Kısmen Kısıtlanmış Larva Zebra Balıklarında Duyusal Stimülasyonla İndüklenen Nöral Aktivitenin Konfokal Floresan Görüntülemesi

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, embriyo ortamında% 3 düşük erime noktalı agros hazırlayın, agrosları zebra balıklarını zarar vermeden manipüle etmek için güvenli bir sıcaklığa ısıtın. Agros soğumadan ve katılaşmadan önce, döllenmeden iki ila yedi gün sonra olan larvaları sırt tarafı yukarı bakacak şekilde cam tabanlı bir petri kabına yerleştirin. Agros larvalar yerinde katılaştıktan sonra, tabağa beş mililitre embriyo ortamı ekleyin. Bir neşter kullanarak, agroları larvaların etrafında gerektiği gibi kesin. Zebra balığı ile petri kabını konfokal mikroskobun sahnesine aktarın. 20 dakika iklimlendirdikten sonra, balığı oda sıcaklığında 40 kez suya daldırma hedefinin altında ortalamak için parlak alan görüntülemeyi kullanın. Konfokal mikroskop edinim parametrelerini, floresan molekülünün nitelikleri ve ekspresyon seviyelerinin yanı sıra dokunun derinliği ve optik özelliklerine göre ayarlayın. Floresan ışığını optimum aralıkta düzgün bir şekilde yakalamak ve G kampı başarısına bağlı floresanın gereksiz kaybını önlemek için lazer gücü ve ana kazanç ayarlarını yapın. Daha sonra görüş alanını, omuriliğin rostral kısmına bitişik olarak yerleştirilmiş bir nöronal küme üzerinde ortalayın. Piksel başına 0,119 mikrometre kare uzamsal çözünürlükle saniyede 1,20 kare kare hızında 79,86 mikrometre kare görüş alanına sahip bir zaman serisi taraması gerçekleştirin. Denemenin hedeflerine göre görüş alanını, boyutunu ve alım hızını ayarlayın. Görüntülemenin başlamasından iki dakika sonra, tabağa 41.67 mikrolitre aloe izotiyosiyanat stok çözeltisi veya embriyo ortamı ekleyin ve hızlandırılmış görüntüleme yoluyla G Camp 6'nın ilgilenilen bölgedeki aktivitesindeki değişiklikleri gözlemlemek için yaklaşık 30 saniye boyunca kayda devam edin. Kaydedilen çıktı nokta TIF dosya biçiminde değilse, görüntü dosyalarını aşağı akış Fiji analizi için mikroskop yazılım paketinden nokta TIF dosyaları olarak dışa aktarın. Nöral iz analizi için Fiji yazılımını indirdikten sonra, Fiji'yi açın, nokta CZI dosyalarını programa aktarın. İlgili simgelere tıklayarak ilgilenilen bir alanı veya nöronu vurgulamak için Fiji'deki daire veya serbest el araçlarını kullanın. İlgilendiğiniz bölgeyi veya yatırım getirisini seçtikten sonra, Fiji araç çubuğundan analiz, araçlar ve yatırım getirisi yöneticisi'ne tıklayın. Seçilen ROI'yi ROI yöneticisi penceresine eklemek için T ekle'ye tıklayın. ROI yöneticisinde, ROI'yi analiz etmek için daha fazla ve çoklu ölçüm'e tıklayın. Ayarları varsayılan olarak bırakın ve ham veri oluşturmak için Tamam'ı tıklayın. Ardından, Python veya elektronik tablolar kullanarak daha fazla manipülasyon için çıktıyı bir CSV dosyası olarak kaydedin. Şimdi, iki dakikalık ön uyaranın son 30 saniyesinin ortalamasını alarak ham verileri nöral bir iz olarak temsil edecek şekilde normalleştirin ve verilen formülü kullanarak normalleştirilmiş floresan yoğunluğu oluşturun ve normalleştirilmiş verileri nöral izler olarak çizin. Aloe izotiyosiyanat uygulaması, larva zebra balığının lokalize bir beyin bölgesinde G CAMP 6S floresansında bir artışa neden oldu ve bu da nöral aktivitenin arttığını gösteriyor. Saniyede 0.10 karelik yavaş bir yakalama hızında, arka beyin ve omurilikteki nöronlar yüksek çözünürlükle açıkça görülebiliyordu. Yakalama hızını saniyede 0,79 kareye çıkarmak, uzamsal çözünürlükte hafif bir kayba neden oldu, ancak zamansal çözünürlük iyileştirildi. Saniyede 3.16 karede, nöronlar daha fazla zamansal dinamik yakalarken daha az belirgin göründü.