Name: Heterotrofik Mayayı Fototrofik Şeker Salgılayan Siyanobakterilerle Birleştiren Ko-Kültürlerin Birleştirilmesi ve Miktar Tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Keşfedin fototrofik siyanobakteriler ve heterotrofik mayalarla ko-kültür kurulumu ve miktar tayini yöntemlerini. Bu protokol sentetik konsorsiyumlarda mikrobiyal ağ oluşumunu anlamak için biyoteknolojik uygulamaları geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Sükroz Salgılayan Siyanobakterilerin Mantar Ortaklarıyla Birlikte Kültürlenmesi için Protokol

<table><tbody><tr><td>10x Ph1 objektif</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>525/40 nm Bant Geçiren Filtre</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>FITC filtresi (488 nm lazerde)</td></tr><tr><td>660/10 nm Bant Geçiren Filtre</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0055</td><td>APC kanalı (638 nm lazerde)</td></tr><tr><td>710/50 nm Bant Geçiren Filtre</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B71092</td><td>PC5.5 kanal (561 nm lazerde)</td></tr><tr><td>Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td> için Accuvettes<td>A35473</td><td>Kapaklı numune kapları</td></tr><tr><td>Diyafram tüpü 30 & mu; Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td> için M<td>C92760</td><td>Kılcal</td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>Lab Associates</td><td>malzemenin sterilizasyonu için</td><td>EQM-ARBP</td></tr><tr><td>Şaşkın şişeler ROTILABO&reg;, Düz boyunlu, 250 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11 bileşenleri</td><td>farklı tedarikçiler</td><td></td><td>Tablo 1'e bakınız;</td></tr><tr><td>Şişe üstü steril filtre</td><td>Sigmaaldrich</td><td>,</td><td>otoklav kullanmak istemiyorsanız steril ortamlara</td>Z222593</tr><tr><td>Capillary 45 &micro; m</td><td>Omni Yaşam Bilimleri</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>CASY Hücre Sayacı Modeli TTC</td><td>Schaerfe Sistemleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY bardakları</td><td>Omni Yaşam Bilimleri</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>Omni Yaşam Bilimleri</td><td>OLS 5651786</td><td>Temizleme çözeltisi</td></tr><tr><td>CASYton çözeltisi</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651808</td><td>İzotonik çözelti&nbsp;</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri (50 mL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>, siyanobakteriler, aksenik kültürler ve ko-kültürler tedarik etmek için</td></tr><tr><td>CONTRAD & reg; 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>Derin temiz çözelti</td></tr><tr><td>Kapak camı 20 > 26 x 0,4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>Sayma haznesi için kapak</td></tr><tr><td>camı</td><td>Küvetler Sarstedt&nbsp;</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Siyanobakteriler BG-11 Tatlı Su Çözeltisi</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert Yazılımı v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Sitometre uygulama yazılımı</td></tr><tr><td>CytoFLEX Kılıf Sıvısı</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td><td>Kılıf sıvısı</td></tr><tr><td>Sitometresi CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BE51180 Multisizer 4e Beckman</td><td>Coulter, Inc.</td> için DxH Temizleyici<td>628022</td><td>Temizleme solüsyonu</td></tr><tr><td>Eppendorf tüp santrifüj (küçük)</td>2 <td>mL'den daha az kültürü santrifüjlemek için</td> <td>Labstac</td><td>CEN16-15</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpleri</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>Yarı otomatik mod için</td> <td>2523749</td> tüpler</tr><tr><td>FlowClean Temizlik Maddesi, 500ml</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C48093</td><td>Günlük temiz çözelti</td></tr><tr><td>Dereceli silindirler</td><td>Ortamın hazırlanması için</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron fotoinkübatör</td><td>Infors AG</td><td></td><td>beyaz LED ışık</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>Alikotları hazırlayın, -20 ° C'de saklayın; C, çözdürün ve buz üzerinde tutun&nbsp;</td></tr><tr><td>Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td> için Isoton II<td>8448011</td><td>İzotonik çözelti&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaluza v. 2.2</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B16406</td><td>Sitometri veri analiz yazılımı</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>Tüy bırakmayan dokular</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>KPO3</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>Ölçüm beherleri</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>Mikro test plakası, 96 kuyulu, geçmeli kapak, düz taban, PS, şeffaf</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop tabanı</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosope kafası</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q su arıtma sistemi</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Mulitisizer 4e partikül sayacı</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B23005</td><td>CASY Hücre Sayacına Alternatif</td></tr><tr><td>Neubauer geliştirilmiş, derinlik 0,02 mm</td><td>Yardımcı Almanya</td><td></td><td>Sayma haznesi</td></tr><tr><td>Neubauer geliştirilmiş, derinlik 0,1 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td>Sayma</td></tr><tr><td>haznesi Kullanıma Hazır Günlük QC Florosferler</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C65719</td><td>QC</td></tr><tr><td>SCHOTT şişeleri</td> için <td>referans Dutscher</td><td>90347</td><td>depolama için</td></tr><tr><td>Specord&reg; 200 Plus Spektrofotometre</td><td>Analitik Jena GmbH</td><td></td><td>OD600/750</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Merck KGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj (büyük)</td><td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td>, <td>kültür biyokütlesi</td></tr><tr><td>Maya Azot Bazı, amino asitler olmadan, amonyum sülfat olmadan</td> toplayın <td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>11743014</tr></tbody></table>

heterotrofik mayayı fototrofik Şeker salgılayan siyanobakterilerle birleştiren ko-kültürlerin birleştirilmesi ve miktar tayini

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

Fototrofik S. elongatus ve heterotrofik mayaların ko-kültürlerinin oluşturulması Synechococcus elongatus PCC 7942'nin S. cerevisiae'nin çeşitli alt suşları ile birlikte yetiştirilmesinden elde edilen ayrıntılı sonuçları daha önce bildirmiştik. Bu siyanobakteri / maya çifti ile ko-kültür sonuçlarının kapsamlı bir açıklaması için, bakınız8. Kısalık ve doğruluk adına, bu sonuçlar burada çoğaltılmamıştır. Kısaca, önceki sonuçlar, uzun vadeli siyanobakteriyel-maya ko-kültürlerinin kurulması için önemli olan bir dizi hususu göstermektedir. Birincil endişe kaynağı, mayanın siyanobakterilerin tek sabit karbon formlarını sağladığı koşullar altında hayatta kalma kapasitesi, maya suşunun sakarozdan yararlanabileceği verimliliğe büyük ölçüde bağlıdır. Sakaroz27,28'i daha verimli bir şekilde metabolize etmek için evrimleşen veya tasarlanan S. cerevisiae suşlarının, ko-kültür büyüme moduna geçişte hayatta kalma olasılığı daha yüksekti, daha yüksek hücre yoğunlukları elde etti ve uzun süreli (günler ila haftalar) siyanobakteriyel ko-kültür deneylerinde daha yüksek sağlamlık sergiledi8. Bir ko-kültürü aşılamanın ilk aşaması, muhtemelen kültür seyreltme, ortam bileşimini değiştirme ve / veya daha konsantre bir karbon kaynağının geri çekilmesi stresleri nedeniyle, maya canlılığı için özellikle önemliydi. Bu nedenle, ko-kültür başlangıcında daha zengin bir büyüme ortamından minimum karbon mevcudiyetine geçişi kolaylaştırma çabaları, deneysel performansı ve tutarlılığı artırabilir (bkz. adım 1.2.1.1). Ek olarak, S. cerevisiae, oksijenli fotosentezin birincil yan ürünü olarakO2 oluşumu ile tutarlı olarak, yoğun S. elongatus kültürlerine aşılandığında hiperoksi ile tutarlı stres tepkileri sergiledi. Bu nedenle, siyanobakteriyel partnerin aşırı büyümesini ve / veya alternatif "gündüz / gece" ışık döngülerini önleme çabaları, S. cerevisiae'nin uzun vadeli ko-kültürlerde yaşayabilirliğini önemli ölçüde artırabilir. Aksenik kontrol örneklerine göre ko-kültürlerde yaygın olan fenomenlerin ek bir özeti için Tartışma bölümüne bakın.
Farklı metodolojiler kullanarak ortak kültürlerin büyümesinin izlenmesi Aşağıdaki bölümde, Synechocystis ve iki maya S. cerevisiae ve U. maydis'in yapay olarak karıştırılmış üçlü konsorsiyumunun üç farklı yöntem kullanılarak örnek olarak nicelleştirilmesi açıklanmaktadır. Karışım için, tek kültürlerin OD750 (siyanobakteriler için) ve OD600 (heterotroflar için) belirlendi ve OD 0.1'e ayarlandı. Tek kültürler, optik yoğunluk kullanılarak 1: 1: 1 oranında karıştırıldı (hücre sayımlarından farklıdır, yukarıya bakın). Sitometredeki mayaların ayrımını kolaylaştırmak için, genetik olarak modifiye edilmiş S. cerevisiae FY1679-O1B29'un raportör suşları yapısal olarak sitoplazmik mKate2 üretir (genotip: URA3Δ/pTDH3::mKate2; suş: S. cerevisiae mKate230) ve U. maydis suşu AB3331 yapısal olarak eGFP üretir (genotip: pep4Δ/pRpl40::egfp; suş: U. maydis eGFP32) kullanılmıştır. Dikkat çekici bir şekilde, siyanobakteriyel suşu, sarı floresan protein versiyonu mVenüs'ün (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenüs, Synechocystis mVenüs suşu,33'e benzer) ve ek olarak, fotosentetik makinelerin varlığına bağlı olarak tipik güçlü otofloresan sergiler.
Sayma odalarını kullanarak mikroskobik niceleme: Kullanılan üç mikroorganizmanın yapay karışımındaki tüm hücre tipleri mikroskobik olarak kolayca ayırt edilebilir (Şekil 2A): Synechocystis ve S. cerevisiae , çapları bakımından büyük farklılıklar gösteren küresel hücrelerle temsil edilir (Synechocystis: yaklaşık 1.5-3 μm çap, S. cerevisiae: yaklaşık 3-6 μm çap), U. maydis hücreleri ise uzun, puro şeklinde bir morfolojiye ve en az 10 μm uzunluğa sahiptir (Şekil 2A). Bu açık morfolojik özellikler, karışımdaki her bir ortağın tam olarak ölçülmesine izin verir. Açıklayıcı bir örnek olarak, 37, 18, 36 ve 21 S. cerevisiae hücreleri sırasıyla dört büyük karede sayılır (Şekil 2B). Ortalama değer 28 hücredir. Kullanılan hemositometrenin büyük bir karesi 1mm2'lik bir alana sahip olduğundan ve odacık derinliği 0.02 mm olduğundan, bu 0.02 μL'de 28 hücre ile sonuçlanır. Bu, 1.4 x 106 hücre/mL'ye eşdeğer olan 1.400 hücre/μL'ye karşılık gelir. Diğer hücre tipleri sayıldı ve konsantrasyonlar buna göre belirlendi (Şekil 2C, Tablo 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig02.jpg"> 
Şekil 2: Synechocystis ve S. cerevisiae ve U. maydis mayalarından oluşan üçlü bir konsorsiyumun mikroskobik miktar tayini. (A) Belirtilen mikroorganizmaların yapay olarak birleştirilmiş bir karışımının mikroskobik diferansiyel kontrast (DIC) görüntüsü. Tüm türler morfolojileri ile kolayca ayırt edilebilir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (B) OD'si 0.1 olan aksenik kültürlere dayalı olarak belirtilen suşların yapay olarak bir araya getirilmiş bir karışımı için örnek sayım sonuçları. Izgara kenarlarındaki dört büyük kare analiz edildi ( Şekil 1D'deki kırmızı işaret). (C) Dört karede sayılan farklı hücrelerin ortalama değeri, aşağıdaki denklem kullanılarak süspansiyondaki hücrelerin konsantrasyonunu hesaplamak için kullanıldı: Ortalama değer/(oda derinliği [0.02 mm] x sayılan karenin boyutu [1 mm2] x 1.000). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Partikül sayaçları kullanarak miktar tayini: Partikül sayaçları, boyutlarına bağlı olarak bir süspansiyondaki partikül sayısını belirler. Örnek veri setinde, 45 μm kılcal damarlı bir partikül sayacı kullanılmıştır. S. cerevisiae ve U. maydis hücreleri benzer boyutlar gösterdiğinden, partikül sayacında ayırt edilemezken, daha küçük Synechocystis hücreleri net bir şekilde ayrılabilir. Bu nedenle, tek kültürlerin analizi, iki maya için 3 ila 6 μm'ye atıfta bulunan aynı konumlarda zirveleri gösterir (Şekil 3A). Ölçüm sırasında, hücrelerin kılcal damara girmesine neden olan negatif bir basınç uygulanır. Bu, elektrik direncini kısaca değiştirir, böylece cihaz, değişikliğe bağlı olarak partikül boyutunu belirleyebilir. Karışık kültürde, biri daha küçük siyanobakteri hücreleriyle ilişkili ve diğeri iki maya türünün ortak bir fraksiyonunu temsil eden iki farklı tepe tespit edilebilir (Şekil 3B). Daha da önemlisi, canlı hücreleri yansıtan tepe noktalarına ek olarak, hücre kalıntılarına ve daha küçük parçacıklara karşılık gelen yaklaşık 1 μm'de ek tepe noktaları tespit edildi (Şekil 3). Beklenenden daha büyük çaplarda görünecek sinyaller, hücre kümelenmelerinden kaynaklanabilir. Dikkat çekici bir şekilde, tepelerin şekli hücrelerin homojenliğini yansıtır: Keskin bir tepe, bir ko-kültür için olası olmayan çok homojen hücreleri gösterir. Bir ortak kültürde, ortak kültürün ortaklarının büyüklükleri açıkça farklıysa, çok geniş bir zirve veya hatta iki zirve görmesi beklenir. Heterotrofik mantarların aksenik kültürleri için, tepe orta geniş bir tepe olabilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2.jpg"> 
Şekil 3: Synechocystis mVenus ve S. cerevisiae mKate2 ve U. maydis eGFP mayalarından oluşan üçlü bir konsorsiyumun bir parçacık sayacı kullanılarak miktar tayini. (A) Grafiklerde gösterildiği gibi üç suşun aksenik kültürlerinin analizlerinin görsel çıktısı (45 μm kılcal hücre sayacı). (B) Yapay üçlü konsorsiyumun aynı koşullar kullanılarak analizi için örnek görsel çıktı dosyası. Parçacık sayacı, her ikisi de ikinci tepe noktası tarafından temsil edilen iki maya türünün ayrımını desteklemez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tek hücreli sitometri kullanarak miktar tayini: Tek hücreli akış sitometresi kullanılarak, farklı hücre popülasyonları (otomatik) floresan ve ışık saçılma özelliklerine göre kolayca ayırt edilebilir. Fototrofik hücreler (Synechocystis), APC-H kanalında ölçülen fotosentetik pigmentlerin kırmızı otofloresansına bağlı olarak heterotrofik hücrelerden (U. maydis ve S. cerevisiae) ayırt edilebilir (Şekil 4A). Fototrofik ve heterotrofik hücrelerin bu ilk ayrımına dayanarak, iki heterotrofik popülasyon, FITC-H kanalındaki floresan belirteçleri eGFP ve PC5.5 kanalındaki mKate2'ye göre ayırt edilebilir (Şekil 4B,C). Her üç popülasyonun (FSC-H ve FSC-Genişliği) saçılma özelliklerini gösteren bir nokta grafiğinde, popülasyonlar, popülasyonların yalnızca bazı küçük örtüşmeleriyle de ayırt edilebilir (Şekil 4D).
Bu yöntemle, seyreltilmiş numunelerin 10 μL'si 10 μL/dk'lık bir akış hızı ile analiz edildi ve 1 dakikada yaklaşık 70.000 hücrenin miktar tayinine izin verildi. Bu hücrelerin yaklaşık `'ı Synechocystis'e (4.23 x 106 hücre/mL) atanabilirken, kalan @'ı U. maydis (1.35 x 106 hücre/mL) ve S. cerevisiae (1.36 x 106 hücre/mL, Şekil 4E, Tablo 2) arasında eşit olarak dağıtılmıştır.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig04.jpg"> 
Şekil 4: Siyanobakteri Synechocystis mVenus ve U. maydis eGFP ve S. cerevisiae mKate2 mayalarından oluşan üçlü bir konsorsiyumun tek hücreli akış sitometrisi kullanılarak miktar tayini. Synechocystis mVenus (koyu yeşil), U. maydis eGFP (açık yeşil) ve S. cerevisiae mKate2 (kırmızı) karışık kültürünün 1/3 OD750 / 1/3 OD600 / 1/3 OD600 oranında ölçülmesinden sonra elde edilen örnek grafikler APC-H kanalındaki olay sayısı ve floresan histogramını gösteren bir sitometre (A) üzerinde (örn.: 638 nm, em.: 660/10 nm) otofloresanlarına göre fototrofik ve heterotrofik hücreleri ayırt etmek için kullanılan tüm hücrelerin. (B) U. maydis eGFP ve S. cerevisiae mKate2 hücrelerini yeşil floresan özelliklerine göre ayırt etmek için kullanılan tüm heterotrofik hücrelerin FITC-H kanalındaki (örn.: 488 nm, em.: 525/40 nm) olay sayısı ve floresan histogramı. (C) U. maydis eGFP ve S. cerevisiae mKate2 hücrelerini kırmızı floresan özelliklerine göre ayırt etmek için kullanılan tüm heterotrofik hücrelerin PC5.5-H kanalındaki (örn.: 561 nm, em.: 710/50 nm) olay sayısı ve floresan histogramı. (D) Floresan özellikleri olmayan hücre popülasyonlarını tanımlamak için kullanılan FSC-H kanalı üzerindeki FSC-Genişliğindeki saçılma sinyallerinin bir nokta grafiği. (E) İlgili floresan kanallarının olay sayıları, yüzdeleri ve aritmetik ortalamaları ve standart sapmaları (SD) dahil olmak üzere nüfus istatistikleri. Hücrelerin toplam miktarı, boyutları ve floresanları ile birlikte, 10 μL/dk'lık bir akış hızı ile 10 μL'lik bir hacimde belirlendi. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig04large.jpg" target="_blank">rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Farklı niceleme yöntemlerinin çıktısını karşılaştırmalı olarak görselleştirmek için, belirlenen hücre sayıları aşağıdaki iki tabloda sunulmuştur (Tablo 2 ve Tablo 3). Daha önce tarif edilen üç yöntem kullanılarak belirlenen nihai hücre konsantrasyonları, tüm yöntemler için benzer bir aralıktadır. Sitometre, en yüksek numune boyutunu, ardından partikül sayacını ve mikroskobik nicelemeyi, yöntemler arasında yaklaşık bir büyüklük sırası azalmasıyla sağlar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Ortak kültür 1:1:1</td>
			<td>Işıkölçer</td>
			<td colspan="2">Sitometre</td>
			<td colspan="2">Partikül Sayacı</td>
			<td colspan="2">Mikroskopi Sayım Odası</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organizma</td>
			<td>Dış Çap750/600</td>
			<td>Hücre sayısı</td>
			<td>hücreler / mL</td>
			<td>Hücre sayısı</td>
			<td>hücreler / mL</td>
			<td>Hücre sayısı</td>
			<td>hücreler / mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,618</td>
			<td>1,36 × 106</td>
			<td rowspan="2">1,546*</td>
			<td rowspan="2">2,58 x 106*</td>
			<td>112</td>
			<td>1,40 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,541</td>
			<td>1,35 x 106</td>
			<td>89</td>
			<td>1,11 × 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVenüs</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>42,330</td>
			<td>4,23 × 106</td>
			<td>3,094</td>
			<td>5,16 x 106</td>
			<td>271</td>
			<td>3,39 × 106</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: Farklı kantifikasyon yöntemlerinin karşılaştırılması: Yapay karma kültür. U. maydis ve S. cerevisiae'nin bir parçacık sayacı (*) kullanılarak ayırt edilemeyeceğine dikkat edin.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Tek kültür</td>
			<td>Işıkölçer</td>
			<td colspan="2">Sitometre</td>
			<td colspan="2">Partikül Sayacı</td>
			<td colspan="2">Mikroskopi Sayım Odası</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organizma</td>
			<td>Dış Çap750/600</td>
			<td>Hücre sayısı</td>
			<td>hücreler / mL</td>
			<td>Hücre sayısı</td>
			<td>hücreler / mL</td>
			<td>Hücre sayısı</td>
			<td>hücreler / mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>38,936</td>
			<td>3,89 × 106</td>
			<td>1,928</td>
			<td>3,21 × 106</td>
			<td>403</td>
			<td>4,03 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.1</td>
			<td>36,927</td>
			<td>3,69 × 106</td>
			<td>2,465</td>
			<td>4,11 × 106</td>
			<td>307</td>
			<td>3,07 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVenüs</td>
			<td>0.1</td>
			<td>127,864</td>
			<td>1,28 × 107</td>
			<td>8,186</td>
			<td>1,36 x 107</td>
			<td>428</td>
			<td>1,07 x 107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 3: Farklı kantifikasyon yöntemlerinin karşılaştırılması: Tek/aksenik kültürlerle kalibrasyon.

Heterotrofik Mayayı Fototrofik Şeker Salgılayan Siyanobakterilerle Birleştiren Ko-Kültürlerin Birleştirilmesi ve Miktar Tayini

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Araştırmamız, sükroz salgılayan siyanobakteriler ve heterotrofik mantarları içeren sentetik konsorsiyumlarda mikrobiyal ağları anlamayı amaçlamaktadır. Geçmişte, mikrobiyologlar genellikle tek mikroorganizmaların saf kültürlerini incelediler. Bununla birlikte, doğada, mikroplar genellikle konsorsiyumlarda bulunur ve bu nedenle karışık kültürlerde mikrobiyal ağları da anlamak önemlidir.En büyük zorluklardan biri, tüm konsorsiyum üyelerinin büyümesine izin veren bir ortam da dahil olmak üzere uygun büyüme koşullarını bulmaktır. Burada esas olarak, heterotrofik üyelerin büyümesi için temel sağlayan fototrofik üye tarafından en yüksek sakaroz üretimini ve salgılanmasını optimize etmeye odaklanıyoruz. Aksenik kültürlerde büyümeyi izlemek için optik yoğunluk veya geri saçılma ölçümleri gibi yaygın teknikler kullanılabilir.Bununla birlikte, bu teknikler, tek tek türlerin hücre sayımına ihtiyaç duyduğumuz ko-kültürler için geçerli değildir. Protokolümüzde, farklı ko-kültür ortakları arasında ayrım yapmak için floresan etiketleme ve hücre sayımının bir kombinasyonunu uyguluyoruz. Ek olarak, benzer sonuçların basit, düşük maliyetliden pahalı, yüksek verimli olanlara kadar farklı yöntemlerle elde edilebileceğini gösterebiliriz.Başlamak için, kültürü üç gün büyüttükten sonra siyanobakteri hücrelerini peletleyin. Peleti 25 mililitre steril CoYBG-11 ortamında tekrar süspanse edin. Numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 4.000 g'da santrifüjleyin.Daha sonra süpernatanı boşaltarak atın. Optik yoğunluk belirlendikten sonra, hesaplanan CoYBG-11 miktarını steril koşullar altında 250 mililitrelik şaşkın bir şişeye ekleyin. Daha sonra, 50 mililitrelik bir nihai kültür hacmi elde etmek için siyanobakteriyel ve heterotrofik hücre süspansiyonlarının hesaplanan hacimlerini ekleyin.50 mililitrelik bir kültür için bir molar IPTG stoğundan 50 mikrolitre kullanın. Daha sonra şişeyi fotoinkübatöre saniyede metrekare başına yaklaşık 200 mikromol foton olacak şekilde yerleştirin. Çevreyi 30 santigrat derecede %2 karbondioksit, 150 RPM'de yörünge sallaması ve %75 nem ile destekleyin.Numune almak için, şişeyi inkübatörden çıkarın ve steril koşullar altında kültürden bir mililitrelik bir numune alın. Mikroskobik nicelemeye hazırlanmak için, sayım odasının ve kapak camının toz ve hücrelerden arınmış olduğundan emin olun. Kapak camını, kırılmayı önlerken biraz basınçla iki destek çubuğunun üzerine kaydırarak doğru şekilde konumlandırın.Kapak camı düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, kapak camının kaymadığından emin olurken iki cam yüzey arasındaki Newton halkalarını gözlemleyin. Şimdi hücre süspansiyonunu iyice karıştırın ve odanın kenarına birkaç mikrolitre uygulayın. Haznenin kılcal kuvvet ile tamamen dolmasına izin verin.Daha sonra uygun bir ışık mikroskobu objektifi kullanın ve sayma odası ızgara çizgilerine odaklanın. Verilen hücre boyutuna uygun karelerdeki hücreleri sayın. Partikül sayımı ile miktar tayini için, numunenin optik yoğunluğunu 0.1 olarak ayarlayın.Daha sonra 10 mililitre izotonik ölçüm tamponuna 10 mikrolitre numune ekleyin. Numune kabının kapağını sabitleyin ve kabı hafifçe eğerek numuneyi nazikçe karıştırın. Numune kabını partikül sayacına yerleştirdikten sonra, kullanılan hücreler için uygun gözenek boyutuna sahip bir kılcal damarı numune kabına yerleştirin ve makinenin kapağını kapatın.Ölçümü başlatın ve uygun bir aralıkta kaydedin. Farklı hücre boyutlarına sahip hücreler bu aşamada ayırt edilebilir. Tek hücreli akış sitometrisi ile miktar tayini için, sitometri ölçümüne uygun olacak şekilde numunelerin optik yoğunluğunu ayarlayın.Hücre sayısının dakikada 10 mikrolitre akış hızında saniyede 1.000 ila 10.000 hücre aralığında kalmasını sağlamak için verilen formülü uygulayın. Her bir numune hücresi süspansiyonunun 300 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakadaki ayrı bir kuyucuğa aktarın. Daha sonra 96 oyuklu plakayı sitometrenin otomatik örneğine aktarın.Örneklerle ilgili floresan ve saçılma kanalları için nokta grafikleri ve histogramları açın. Hücre konsantrasyonunu belirlemek için, kayıt işlevini kullanarak tanımlanmış bir numune hacmini kaydedin. APC-H kanalının histogramını kullanarak fototrofik organizmanın kırmızı otofloresansına dayalı olarak fototrofik ve heterotrofik organizmalar için sinyalleri ayırın.Ardından, yeşil floresan proteini içeren heterotrofik hücreleri tanımlamak için yalnızca heterotrofik popülasyonu gösteren FITC-H kanalının histogramını kullanın. Kırmızı floresan proteini içeren heterotrofik hücreleri ve içermeyen hücreleri ayırt etmek için PC5.5-H kanalının histogramını kullanın.

assembly-quantification-co-cultures-combining-heterotrophic-yeast

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kaynak: Jiang, H., Ho, M. Siyanobakterilerde Bozulmamış Fikobilizomun İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm.(2021).Bu video, karbondioksit kaynağı ve besin açısından zengin koşullarla sürekli aydınlatma altında hücreleri büyüterek biyokütle elde etmek için siyanobakterilerin kültürlenmesi ve ardından santrifüjleme yoluyla hasat prosedürünü göstermektedir.

Biyokütle Üretimi için Siyanobakteri Kültürünün Hazırlanması

Biz bir inverted mikroskop ile atık mikropların kültürler ve düzenli görüntü hücrelere aydınlatmak için Optogenetic sistemleri ile kullanım için sürekli bir kültür cihazı tasarlanmıştır. aydınlatma dinamik tepkiler birkaç gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır.

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Burada, i) CyanoGate modüler klonlama araç kiti kullanarak kendi kendini çoğaltan bir vektör monte etmek açıklayan bir protokol sokulması, ii) konjugasyon ile bir siyanobakteriyel konak içine vektör tanıtmak ve iii) transgenik siyanobakteri suşları karakterize bir plaka okuyucu veya akış sitometri.

CyanoGate Modüler Klonlama Araç Kiti Kullanılarak Konjugasyon ile Siyanobakterilerin Genetik Modifikasyonu

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Mikrobiyal metabolizmanın optogenetik kontrolü, fermantasyon süreçleri üzerinde esnek dinamik kontrol sağlar. Buradaki protokol, farklı hacimsel ölçeklerde kimyasal ve protein üretimi için mavi ışık ayarlı fermantasyonların nasıl kurulacağını göstermektedir.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Mevcut protokol, filobobizomların siyanobakterilerden santrifüjleme ile süreksiz bir sakkaroz yoğunluk gradyanı ile izolasyonunu detaylandırıyor. Sağlam fitoidürlerin fraksiyonları 77K floresan emisyon spektrumu ve SDS-PAGE analizi ile doğrulanır. Ortaya çıkan fitobilizom fraksiyonları TEM ve kütle spektrometresi analizinin negatif boyanması için uygundur.

Siyanobakterilerde Bozulmamış Fitoidinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu çalışmada temel amaç, karbon nanotüplerin (CNT'ler) hücresel alımını ve nihai ekzositozunu izlemekti. Bu perspektiften bakıldığında, burada multispektral görüntüleme akış sitometrisini kullanan, istatistiksel olarak anlamlı sayıda hücrede CNT'lerin nicelleştirilmesine ve lokalizasyonuna izin veren benzersiz bir yöntem önerdik.

Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu

Tek veya birden fazla hücre dışı matris proteinleri nanolifler ve karmaşık oluşturulan nano elde etmek için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamalarında çeşitli kullanım için ayarlanabilir kompozisyon ve mimarisi ile serbest duran protein bazlı malzemeleri oluşturmak için protein-yüzey etkileşimlerini kullanır.

ECM Protein Nanofiberler ve Nanoyapılar İşlenmiş Kullanılarak Yüzey başlatılan Meclisi

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır ve doğal zar parçacıkları hücre zarlarının özelliklerini yaklaşık ve analitik çeşitli stratejiler dahil edilmesi uygun sistemlerdir. Burada destekli lipid iki katmanlı kaplı SiO 2 boncuklar, fosfolipid vezikülleri ya da doğal zar parçacıklarının oluşan mikrodizileri hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Bu el yazması endotele fizyolojik özelliklerini recapitulate mikrodamarlar mühendisi bir enjeksiyon kalıplama yöntemi sunar. Mikroakışkan tabanlı süreç böyle akışı, hücresel kompozisyon, geometri ve biyokimyasal geçişlerini olarak Uyarlanabilen koşullar, patent 3D damar ağları oluşturur. üretim süreci ve potansiyel uygulama örnekleri açıklanmıştır.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Keşfedin fototrofik siyanobakteriler ve heterotrofik mayalarla ko-kültür kurulumu ve miktar tayini yöntemlerini. Bu protokol sentetik konsorsiyumlarda mikrobiyal ağ oluşumunu anlamak için biyoteknolojik uygulamaları geliştirir.

Heterotrofik Mayayı Fototrofik Şeker Salgılayan Siyanobakterilerle Birleştiren Ko-Kültürlerin Birleştirilmesi ve Miktar Tayini

Daha fazla video keşfet