Heterotrofik Mayayı Fototrofik Şeker Salgılayan Siyanobakterilerle Birleştiren Ko-Kültürlerin Birleştirilmesi ve Miktar Tayini

Araştırmamız, sükroz salgılayan siyanobakteriler ve heterotrofik mantarları içeren sentetik konsorsiyumlarda mikrobiyal ağları anlamayı amaçlamaktadır. Geçmişte, mikrobiyologlar genellikle tek mikroorganizmaların saf kültürlerini incelediler. Bununla birlikte, doğada, mikroplar genellikle konsorsiyumlarda bulunur ve bu nedenle karışık kültürlerde mikrobiyal ağları da anlamak önemlidir.

En büyük zorluklardan biri, tüm konsorsiyum üyelerinin büyümesine izin veren bir ortam da dahil olmak üzere uygun büyüme koşullarını bulmaktır. Burada esas olarak, heterotrofik üyelerin büyümesi için temel sağlayan fototrofik üye tarafından en yüksek sakaroz üretimini ve salgılanmasını optimize etmeye odaklanıyoruz. Aksenik kültürlerde büyümeyi izlemek için optik yoğunluk veya geri saçılma ölçümleri gibi yaygın teknikler kullanılabilir.

Bununla birlikte, bu teknikler, tek tek türlerin hücre sayımına ihtiyaç duyduğumuz ko-kültürler için geçerli değildir. Protokolümüzde, farklı ko-kültür ortakları arasında ayrım yapmak için floresan etiketleme ve hücre sayımının bir kombinasyonunu uyguluyoruz. Ek olarak, benzer sonuçların basit, düşük maliyetliden pahalı, yüksek verimli olanlara kadar farklı yöntemlerle elde edilebileceğini gösterebiliriz.

Başlamak için, kültürü üç gün büyüttükten sonra siyanobakteri hücrelerini peletleyin. Peleti 25 mililitre steril CoYBG-11 ortamında tekrar süspanse edin. Numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 4.000 g'da santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı boşaltarak atın. Optik yoğunluk belirlendikten sonra, hesaplanan CoYBG-11 miktarını steril koşullar altında 250 mililitrelik şaşkın bir şişeye ekleyin. Daha sonra, 50 mililitrelik bir nihai kültür hacmi elde etmek için siyanobakteriyel ve heterotrofik hücre süspansiyonlarının hesaplanan hacimlerini ekleyin.

50 mililitrelik bir kültür için bir molar IPTG stoğundan 50 mikrolitre kullanın. Daha sonra şişeyi fotoinkübatöre saniyede metrekare başına yaklaşık 200 mikromol foton olacak şekilde yerleştirin. Çevreyi 30 santigrat derecede %2 karbondioksit, 150 RPM'de yörünge sallaması ve %75 nem ile destekleyin.

Numune almak için, şişeyi inkübatörden çıkarın ve steril koşullar altında kültürden bir mililitrelik bir numune alın. Mikroskobik nicelemeye hazırlanmak için, sayım odasının ve kapak camının toz ve hücrelerden arınmış olduğundan emin olun. Kapak camını, kırılmayı önlerken biraz basınçla iki destek çubuğunun üzerine kaydırarak doğru şekilde konumlandırın.

Kapak camı düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, kapak camının kaymadığından emin olurken iki cam yüzey arasındaki Newton halkalarını gözlemleyin. Şimdi hücre süspansiyonunu iyice karıştırın ve odanın kenarına birkaç mikrolitre uygulayın. Haznenin kılcal kuvvet ile tamamen dolmasına izin verin.

Daha sonra uygun bir ışık mikroskobu objektifi kullanın ve sayma odası ızgara çizgilerine odaklanın. Verilen hücre boyutuna uygun karelerdeki hücreleri sayın. Partikül sayımı ile miktar tayini için, numunenin optik yoğunluğunu 0.1 olarak ayarlayın.

Daha sonra 10 mililitre izotonik ölçüm tamponuna 10 mikrolitre numune ekleyin. Numune kabının kapağını sabitleyin ve kabı hafifçe eğerek numuneyi nazikçe karıştırın. Numune kabını partikül sayacına yerleştirdikten sonra, kullanılan hücreler için uygun gözenek boyutuna sahip bir kılcal damarı numune kabına yerleştirin ve makinenin kapağını kapatın.

Ölçümü başlatın ve uygun bir aralıkta kaydedin. Farklı hücre boyutlarına sahip hücreler bu aşamada ayırt edilebilir. Tek hücreli akış sitometrisi ile miktar tayini için, sitometri ölçümüne uygun olacak şekilde numunelerin optik yoğunluğunu ayarlayın.

Hücre sayısının dakikada 10 mikrolitre akış hızında saniyede 1.000 ila 10.000 hücre aralığında kalmasını sağlamak için verilen formülü uygulayın. Her bir numune hücresi süspansiyonunun 300 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakadaki ayrı bir kuyucuğa aktarın. Daha sonra 96 oyuklu plakayı sitometrenin otomatik örneğine aktarın.

Örneklerle ilgili floresan ve saçılma kanalları için nokta grafikleri ve histogramları açın. Hücre konsantrasyonunu belirlemek için, kayıt işlevini kullanarak tanımlanmış bir numune hacmini kaydedin. APC-H kanalının histogramını kullanarak fototrofik organizmanın kırmızı otofloresansına dayalı olarak fototrofik ve heterotrofik organizmalar için sinyalleri ayırın.

Ardından, yeşil floresan proteini içeren heterotrofik hücreleri tanımlamak için yalnızca heterotrofik popülasyonu gösteren FITC-H kanalının histogramını kullanın. Kırmızı floresan proteini içeren heterotrofik hücreleri ve içermeyen hücreleri ayırt etmek için PC5.5-H kanalının histogramını kullanın.